Summary
Artikkelen beskriver metodene og reagensene som er nødvendige for å utføre hybridiseringskjedereaksjon RNA helmontert fluorescens in situ hybridisering (HCR, RNA, WM-FISH) for å avsløre innsikt i romlig og cellulær oppløsning av kjemosensoriske reseptorgener i myggantenne og maksillærpalp.
Abstract
Mygg er effektive vektorer av dødelige sykdommer og kan navigere i sitt kjemiske miljø ved hjelp av kjemosensoriske reseptorer uttrykt i deres olfaktoriske vedlegg. Å forstå hvordan kjemosensoriske reseptorer er romlig organisert i de perifere olfaktoriske vedleggene, kan gi innsikt i hvordan lukt er kodet i myggluktsystemet og informere om nye måter å bekjempe spredning av myggbårne sykdommer. Fremveksten av tredje generasjons hybridiseringskjedereaksjon RNA helmontert fluorescens in situ hybridisering (HCR, RNA, WM-FISH) muliggjør romlig kartlegging og samtidig ekspresjonsprofilering av flere kjemosensoriske gener. Her beskriver vi en trinnvis tilnærming for å utføre HCR RNA WM-FISH på Anopheles myggantenne og maksillærpalp. Vi undersøkte sensitiviteten til denne teknikken ved å undersøke ekspresjonsprofilen til ionotrope olfaktoriske reseptorer. Vi spurte om den beskrevne HCR WM-FISH-teknikken var egnet for multipleksede studier ved å binde RNA-sonder til tre spektralt distinkte fluoroforer. Resultatene ga bevis for at HCR RNA WM-FISH er robust følsom for samtidig å oppdage flere kjemosensoriske gener i antennen og maxillarpalp olfaktoriske vedheng. Videre undersøkelser vitner om egnetheten til HCR WM-FISH for co-expression profilering av doble og triple RNA-mål. Denne teknikken, når den brukes med modifikasjoner, kan tilpasses for å lokalisere gener av interesse i det olfaktoriske vevet til andre insektarter eller i andre vedlegg.
Introduction
Myggvektorer som Anopheles gambiae stole på et rikt repertoar av kjemosensoriske gener uttrykt i deres perifere olfaktoriske vedheng for å trives i en kompleks kjemisk verden og identifisere atferdsmessig relevante lukt som kommer fra menneskelige verter, oppdage nektarkilder og lokalisere oviposisjonssteder1. Myggantennen og den maksillære palpen er beriket med kjemosensoriske gener som driver luktdeteksjon i disse olfaktoriske vedleggene. Tre hovedklasser av ligandstyrte ionekanaler driver luktdeteksjon i myggens olfaktoriske vedheng: Odorantreseptorene (OR), som fungerer med en obligatorisk Odorantreseptor-co-reseptor (Orco); de ionotrope reseptorene (IR), som interagerer med en eller flere IR-koreseptorer (IR8a, IR25a og IR76b); de kjemosensoriske gustatoriske reseptorene (GRs), som fungerer som et kompleks av tre proteiner for å oppdage karbondioksid (CO2) 1,2.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering er et kraftig verktøy for å oppdage uttrykket av endogent mRNA3. Generelt benytter denne metoden en fluoroformerket enkeltstrenget nukleinsyresonde med sekvens komplementær til et mål-mRNA. Binding av den fluorescerende RNA-sonden til mål-RNA tillater identifisering av celler som uttrykker et transkripsjon av interesse. Nylige fremskritt gjør det nå mulig å oppdage transkripsjoner i helmonterte myggvev 4,5. Den første generasjonen av hybridiseringskjedereaksjonsteknologi (HCR) brukte en RNA-basert HCR-forsterker; Dette ble forbedret i en andregenerasjons metode som i stedet brukte konstruert DNA for HCR-forsterkeren 6,7. Denne oppgraderingen resulterte i en 10x økning i signal, en dramatisk reduksjon i produksjonskostnadene og betydelig forbedring i holdbarheten til reagenser 6,7.
I protokollen beskriver vi bruken av en tredje generasjons HCR helmontert RNA-fluorescens in situ hybridisering (HCR RNA WM-FISH) metode designet for å oppdage romlig lokalisering og ekspresjon av et hvilket som helst gen 8,9. Denne to-trinns metoden bruker først nukleinsyreprober som er spesifikke for mRNA av interesse, men som også inneholder en initiatorgjenkjenningssekvens; Det andre trinnet benytter fluoroformerkede hårnåler som binder seg til initiatorsekvensen for å forsterke det fluorescerende signalet (figur 1). Denne metoden tillater også multipleksing av to eller flere RNA-prober og forsterkende sondesignaler for å lette RNA-deteksjon og kvantifisering8. Visualisering av transkripsjonsoverflod og RNA-lokaliseringsmønstre av kjemosensoriske gener uttrykt i olfaktoriske vedlegg gir den første innsikten i kjemosensoriske genfunksjoner og luktkoding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vurderinger og forberedelse av materialer
- Bestem om helmontering eller kryoseksjon av vev vil være passende. Denne protokollen er optimalisert for helmontert in situ-avbildning av RNA i Anopheles myggantenne og maksillærpalp uten kryoseksjonering. Hvis prøvene er tykkere enn 5 mm, anbefales kryosnitting for å muliggjøre sondepenetrasjon.
- Identifiser gener av interesse og kopier sekvensene inkludert introner og eksoner fra en passende database. Transkribere gensekvensen til RNA for syntese.
- Bestem om du skal kjøpe sonder fra kommersielle leverandører eller om sonder vil bli syntetisert i laboratoriet.
MERK: I denne studien ble in situ-sondene kjøpt fra en kommersiell leverandør (se Materialfortegnelse). Alternativt kan det syntetiseres som tidligere rapportert10. Reagenser brukt i studien er beskrevet i tabell 1. Materialer som kreves for å forberede reagensene er oppført i materialfortegnelsen.
2. Vev pre-fiksering
- Bedøv 10-15 voksne kvinnelige eller mannlige Anopheles coluzzii mygg (stamme N'Gousso), i alderen 5-10 dager etter fremkomsten, ved å samle dem med en munn aspirator i en papirkopp eller plastrør og plassere dem i en bøtte som inneholder is. En vellykket kuldeindusert anestesi kan bekreftes når myggene er immobile.
- Decapitate dem ved å fjerne hodene fra nakkeområdet med et par tang. Bruk den ikke-dominerende hånden til å ta tak i brystkassen med tang og skille nakken fra kroppen med tang holdt av den dominerende hånden. Plasser hodene i et 1,5 ml rør inneholdende 500 μL kitinase-chymotrypsin dimetylsulfoksidbuffer (CCD-buffer) på is.
MERK: Frysende dyr kan deformere antennene; En rask knockdown på isen anbefales. Myggens alder under testingen kan variere avhengig av prosjektet. Det er viktig å bekrefte og koordinere deres fysiologiske status, for eksempel om de er blodmatet, sultet eller parret. I denne studien ble det tatt prøver av luktevedheng fra mygg som hadde blitt blodmatet og parret. - Forvarm mygghoder i CCD-buffer ved 37 ° C på en varmeblokk i 5 minutter og overfør deretter røret som inneholder mygghodene til en hybridiseringsovn og roter ved 37 ° C. Inkubasjonstiden i CCD-buffer avhenger av vevstype. For kvinnelige Anopheles-antenner bruker du 20 min, hannantennene trenger 15 min, mens lengre inkubasjonstid (1 time) er nødvendig for maksillærpalpene.
- Overfør hele innholdet i røret til et dissekerende klokkeglass. Hell prøven forsiktig i fordypningen av et klokkeglass (disseksjon). Hvis mygghoder sitter fast inne i røret, bruk en pipette for å legge CCD-buffer inn i røret og skyll ut hodet.
- Bruk tang til å forsiktig overføre hodene eller eventuelle antenner/palper som løsner under inkubasjonen og fikser i 1 ml av prefiksativet.
MERK: Gjenværende CCD-buffer kan bevares ved -20 °C. Buffer kan gjenbrukes opptil 3x. Hvis prefiksativet blir litt brunaktig på grunn av CCD-bufferoverføringen av vevet, erstatt det med ytterligere 1 ml fikseringsmiddel. - Roter hodene i prefiksativ i 24 timer ved 4 ° C ved hjelp av en mutter.
MERK: Gyngehastigheten for nutatoren som ble brukt i denne studien var ikke justerbar; Standardhastigheten satt (12 o / min) av produsenten ble brukt.
3. Vev disseksjon
- Skyll hoder 4x (5 min per vask) med 1 ml 0,1% PBS-Tween på is. For å unngå tap av prøve, bruk en pipette festet til gelbelastningsspissen for å fjerne væsken.
MERK: To hurtigvask etterfulgt av en 10 min lang vask, og en siste hurtigvask kunne utføres i stedet for trinn 3.1. - Overfør hodene i røret til et dissekerende klokkeglass. Hell prøven forsiktig i depresjonen av et klokkeglass. Skyll ut mygghoder som sitter fast inne i røret med 0,1% PBS-Tween.
- Under et dissekerende mikroskop, fjern vev av interesse (antenner / palper) fra hodet med skarpe tang. Hold den bakre delen av hodet med tang og ta en antenne med en annen tang fra basen. Rengjør tang med papir fuktet med RNAse-fritt løsningsmiddel. Fjern palpene med samme prosess.
- Overfør antennene og palpene med tang til tomme DNA/RNasefrie rør som legges på is. Separer de forskjellige vevsdelene i forhåndsmerkede forskjellige rør.
- Dehydrer vev i 400 mikrol oppløsningsmiddel inneholdende en blanding av metanol (MeOH 80%) og dimetylsulfoksid (DMSO 20%) i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Det er ikke nødvendig å plassere vev på en nutator; La den stå på et rørstativ ved romtemperatur på laboratoriebenken. Det anbefales å bruke fersk løsningsmiddelblanding. For en 500 μL stamløsning, bland 400 μL MeOH med 100 μL DMSO. - Dehydreringsreagenset erstattes med 400 μL absolutt (100 %) metanol- og dehydreringsvev over natten ved -20 °C. La vev sette seg ved tyngdekraften og bruk en pipette for å fjerne væsken.
MERK: Prøver er levedyktige for lengre periode med dehydrering, opptil 4 netter har blitt testet uten tap av signal.
4. Vev etter fiksering
- Rehydrer vev i en firetrinns serie med gradert 400 μL MeOH/PBS-Tween i 10 minutter på is. Start med 75% MeOH/25% PBS-Tween etterfulgt av 50% MeOH / 50% PBS-Tween, deretter 25% MeOH / 75% PBS-Tween og til slutt 100% PBS-Tween.
MERK: En gellastespiss med en liten åpning kan brukes til å fjerne bufferen fra røret for å unngå å miste vevet. Bufferfjerning kan gjøres under et dissekerende mikroskop. - Vask med 400 μL fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 (PBS-T) i 10 minutter ved romtemperatur. Vask ved å plassere prøven på en mutter.
- Lag en 20 μg / ml Proteinase-K-løsning og inkuber i 400 μL Proteinase-K-løsning i 30 minutter ved romtemperatur.
MERK: Fortynn 20 mg / ml Proteinase-K-lager (1000x stamløsning) dvs. 2 μL i 2 ml av 0,1% PBS-Tween. Restene kan lagres i en fryser på -20 °C. - Stopp enzymatisk fordøyelse av vev ved å vaske 2x i 10 minutter med 400 μL på 0,1% PBS-tween.
- Tilsett 400 μL av postfikseringsmiddelet og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Vask 3x, 15 min per vask, med 400 μL av 0,1% PBS-Tween.
5. Sonde hybridisering
- Inkuber vev i 400 μL sondehybridiseringsbuffer i 5 minutter. Forsikre deg om at vevet er helt nedsenket i bufferen ved forsiktig pipettering.
- Forbered deg på neste trinn ved å varme opp en aliquot av sondehybridiseringsbuffer til 37 ° C i 30 minutter.
- Fjern buffer og forhåndshybridiser med 400 μL forvarmet sondehybridiseringsbuffer i 30 minutter ved 37 ° C.
- Lag sondeløsning for de kjemosensoriske reseptorene (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a eller Orco) ved å legge til 8 pM sonde. Tilsett 8 μL 1 μM sondebestand til 500 μL forvarmet sondehybridiseringsbuffer.
- Fjern den forvarmede sondehybridiseringsbufferen og erstatt den med 400 μL oppvarmet sondeløsning.
- Inkubere vev ved 37 ° C i to netter på en nutator plassert inne i en inkubator og dekket under en boks.
6. Probe forsterkning
- Varm opp sondens vaskebuffer til 37 ° C. Fjern overflødig sondeoppløsning ved å skylle vevet 5x, 10 minutter per vask, med 400 μL sondevaskebuffer ved 37 ° C, nøttedannelse i inkubatoren.
MERK: Forberedelsene til trinn 6.4 kan begynne. Se notatet i trinn 6.4. - Vaskeprøver 2x, 5 min per vask, med 400 μL 5x saltvann-natriumsitrat inneholdende 10% Tween-20 (SSCT) ved romtemperatur. Tine forsterkningsbuffer til romtemperatur på en benkplate.
- Forbered vev for forsterkning ved å inkubere med 400 μL amplifikasjonsbuffer i 10 minutter ved romtemperatur. På grunn av viskositeten til amplifikasjonsbufferen, kan vev ikke være helt nedsenket. Bland ved forsiktig å pipetere amplifikasjonsbufferen under vevet og drive ut bufferen på toppen av vevet til de er nedsenket.
- Forbered separat 18 pM hårnål h1 og 18 pM hårnål h2 ved å varme opp 6 μL 3 μM lager ved 95 °C i 90 s og avkjøl til romtemperatur i en mørk skuff i 30 minutter. Sørg for at PCR-rørene er tett avkortet for å forhindre fordampning av hårnålene mens du varmer opp i en termisk syklist.
MERK: For å spare tid kan trinn 6.4 startes mens du erpå vasketrinnet 4 i trinn 6.1. Hårnåler bør varmes opp separat for å forhindre kryssreaksjon. Hårnåler skal ikke fortynnes med noen buffer i dette trinnet. Hårnålene kan kjøpes fra sondeprodusenten sammen med sondene. - Erstatt forsterkningsbufferen som ble tilsatt i trinn 6.3 med en blanding som inneholder de oppvarmede hårnålene (fra trinn 6.4) sammen med 100 mikrol amplifikasjonsbuffer. En typisk reaksjon vil inneholde 6 μL h1, 6 μL h2 og 100 μL amplifikasjonsbuffer.
MERK: Hårnåler h1 og h2 kan kombineres etter avkjøling til romtemperatur og deretter tilsettes til 100 μL amplifikasjonsbuffer. For å unngå overføring av vevsprøver fra ett rør til et annet, kan amplifikasjonsbufferen i trinn 6.3 fjernes og erstattes av hårnålblandingen fortynnet i amplifikasjonsbuffer. - Inkuber vev over natten og nøtt i mørket ved romtemperatur ved hjelp av standardhastigheten til mutteren.
7. Montering av vevsprøve
- Fortynn amplifikasjonsbuffer i inkubert vev med 300 μL 5x SSCT (natriumklorid-natriumcitrat fortynnet i Tween-20).
MERK: Fortynningen er nyttig for å redusere viskositeten og gjør det lettere å fjerne amplifikasjonsbufferen fra vevet. Vi brukte Triton-X 100 for prefikseringsmiddelet og Tween-20 for postfikseringstrinnet på grunn av forskjellene i deres handlinger som midler for å permeabilisere cellemembranen. - Vask papirlommetørkleet 5x med 400 μL 5x SSCT ved romtemperatur.
MERK: Oppbevar vevet midlertidig ved 4 °C til det er klart til montering, om nødvendig. Vi har ikke overskredet 2 dager før avbildning. - Lag 5 dråper monteringsløsning på et glassglass. Klipp spissen på en 200 μL pipettespiss for å gjøre den bredere og overfør vevet til et nytt glassglass.
- Ta tak i vevsprøvene ved basen med tang og senk forsiktig ned og skyll i en serie monteringsløsningsdråper. Vær forsiktig så du ikke bryter vevet i dette trinnet.
- Monteres med monteringsløsning, plasser dekkslipp og forsegling med neglelakk. Bilde in situ vevsprøver ved hjelp av et konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Robust påvisning av kjemosensoriske gener i Anopheles-antenne
Vi undersøkte sensitiviteten til HCR FISH-metoden (figur 1) for å påvise ekspresjon av kjemosensoriske reseptorer i myggluktvev. Guidet av RNA-transkripsjonsdataene som ble rapportert tidligere på den kvinnelige Anopheles myggantennen, genererte vi sonder for å målrette mot en rekke IRer. De gjennomsnittlige transkripsjonsverdiene fra fire uavhengige antennetranskriptomstudier viste at Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) og Ir7t (13 RPKM) var mindre rikelig i antennen sammenlignet med co-reseptorene Ir25a (197 RPKM) og Ir76b (193 RPKM) 5,11,12,13,14. Vi genererte sonder for å målrette Ir41t.1, Ir75d og Ir7t. IR64a (31 RPKM) ble også målrettet da transkripsjonsnivået er omtrent 3x mer rikelig enn den laveste transkripsjonsverdien blant kandidatgenene av interesse. Det må her bemerkes at RPKM-verdier fra transkriptomikkstudier representerer en massemåling av transkripsjoner fra hele antennen. Som sådan kan det være at bare noen få nevroner sterkt uttrykker et IR-gentranskripsjon, eller det kan være at et IR-gen er lavt uttrykt over mange celler. RPKM-verdier kan derfor ikke nødvendigvis korrespondere med overflodsnivået til en IR i et nevron. I tillegg kan signalforsterkningen som HCR-metoden gir, også gjøre det vanskelig å bruke denne metoden til nøyaktig å måle neuronale transkriptnivåer basert på fluorescerende signaler. Vår siste publikasjon diskuterte disse begrepene mer detaljert5. Data tyder på at HCR WM-FISH er svært følsom for påvisning av mRNA-transkripter fra antennevev som vist i figur 2.
Multiplekset sammerking av forskjellige RNA-mål i kjemosensoriske vedlegg
For å undersøke samlokaliseringen av RNA-mål, genererte vi sonder konjugert til forskjellige fluoroforer. Dobbel in situ hybridisering rettet mot transkripsjoner av Odorantreseptor-co-reseptorgenet (Orco) og det mest bredt uttrykte ionotrope reseptor-co-reseptorgenet (Ir25a) avslørte kolokalisering av disse distinkte kjemosensoriske reseptorfamiliene i en undergruppe av cellepopulasjoner i antennen (figur 3A) og maksillærpalp (figur 3B). Vi undersøkte også samlokalisering av transkripsjoner av tre IR-koreceptorgener (Ir8a, Ir25a og Ir76b). Kolokaliseringsmønstre antyder at Ir76b-positive celler uttrykker Ir25a, mens Ir8a-positive celler delvis samlokaliseres med Ir76b og Ir25a (figur 4). Samuttrykksanalysen av IR-veilederne demonstrerer robustheten ved bruk av HCR WM-FISH for multipleksede studier.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av in situ hybridiseringskjedereaksjonen . Denne metoden fungerer i to trinn: deteksjon og forsterkning. En sonde satt for in situ hybridiseringskjedereaksjon består av en delt initiator og en nukleinsyresekvens spesifikk for RNA-målet. Flere par sondesett kan utformes for å hybridisere flere regioner i RNA-målet; Dette definerer gjenkjenningstrinnet. Forsterkningstrinnet krever fluoroformerkede hårnåler (h1 og h2) for å binde seg spesifikt til initiatoren som er konjugert til et sondesett. Ved binding forsterkes RNA-signalet merket av fluoroforen ved gjentatt binding av fluoroformerkede hårnåler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RNA-lokalisering av IR-kjemosensoriske gener. HCR WM-FISH av hunnen Anopheles coluzzii antenner for å målrette IR. RNA-sonder inkluderer (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t og (D) IR64a. Innsatsene i hvite stiplede bokser er forstørrede bilder fra vevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Double in situ samlokalisering av kjemosensoriske gener i antenne og maksillærpalp. Konfokale Z-stack-bilder av celler som uttrykker Ir25a (grønn) og Orco (magenta) i (A) antennen og (B) maksillærpalp av hunnmygg av Anopheles coluzzii. Innsatsene i hvite stiplede bokser er forstørrede bilder fra vevet. Skalaen er 10 μm. Figur 3B er endret fra15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kartlegging av romlig samlokalisering av flere RNA-mål. In situ-bilder som viser samlokaliseringsmønstre av tre IR-koreseptorer, IR25a (magenta), IR8a (grønn) og IR76b (blå) i myggantennen. Hvite piler peker på celler som uttrykker de tre IR-veilederne (IR25a, IR8a og IR76b). Skalaen er 20 μm. Dette tallet er endret fra5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Reagenser for in situ hybridiseringskjedereaksjon. Reagenser som trengs for å utføre hybridiseringskjedereaksjon helmontert fluorescerende in situ-hybridisering . Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tredje generasjonen av hybridiseringskjedereaksjon (HCR) er bemerkelsesverdig for sin følsomhet og robusthet for å visualisere flere RNA-mål8. HCR WM-FISH har blitt brukt med hell på embryoene til Drosophila, kylling, mus og sebrafisk samt larver av nematoder og sebrafisk 10,16,17. Myggantenner og maksillære palper er typisk utsatt for høy autofluorescens og svak sondepenetrasjon, noe som er spesielt utfordrende ved utførelse av tradisjonelle helmonterte in situ-metoder. Disse ulempene har blitt redusert ved signalforsterkningstrinnet integrert i HCR-protokollen, noe som forbedrer signal-til-bakgrunnsforholdet og muliggjør påvisning av olfaktoriske kjemoreceptor-mRNA-transkripter (figur 2). HCR-protokolldesignet sikrer at initieringsprobene er bundet til amplifikasjonspolymerene som muliggjør avbildning av RNA-mål med lavt signal. I det multipleksede oppsettet ble forskjellige ortogonale HCR-forsterkere bundet til spektralt unike fluoroforer. Denne tilnærmingen var avgjørende for å unngå spektral gjennomblødning fra en nærliggende bildekanal.
For å optimalisere HCR-metoden for bruk med myggvedheng, gjorde vi flere observasjoner. HCR-forsterkerne er lysfølsomme og bør alltid oppbevares i en boks i en fryser på -20 °C. Vår erfaring er at omfattende inkubasjon av vev i CCD-buffer, proteinase K eller kort fikseringstid i paraformaldehyd kan føre til brudd på antenner eller palper under vasketrinnene. Antenner og maksillære palper bør også alltid gripes av basen for å unngå brudd. På det tidlige stadiet av tilpasningen av denne protokollen mistet vi konsekvent vev under serien av bufferutvekslinger (trinn 5 og 6). For å minimere slike tap ble antall vev doblet ved starten av forsøket, vasketrinn og bufferutveksling ble utført under mikroskopet, og gelbelastningsspisser ikke bredere enn 0, 5 mm ble brukt til å fjerne bufferne fra vevet.
HCR WM-FISH har vært vellykket i perifere olfaktoriske vedheng av Anopheles gambiae 5,15 og Aedes aegypti 4,18 myggvektorer, og protokollen kan videre optimaliseres og tilpasses andre insektvevsdeler eller forskjellige dyr. Den opprinnelige protokollen designet av produsenten inneholder ikke inkubasjon i CCD-buffer. Dette trinnet ble integrert i protokollen for å fordøye og permeabilisere den chitinous kutikula. Vi utvidet inkubasjonstiden i sondesettene i to netter for å gi mer tid til sondepenetrasjon, en modifikasjon av produsentens protokoll som anbefaler en 16 timers inkubasjonstid som fungerer bra for generiske prøver på et lysbilde. Optimalisering av denne protokollen for andre insektvevsdeler vil kreve variasjon av inkubasjonstiden i CCD-bufferen; Perifere vevsdeler med tykke neglebånd vil sannsynligvis kreve utvidet inkubasjonstid. Konsentrasjonen av proteinase K må også justeres eksperimentelt mens denne protokollen tilpasses for forskjellige vevs- eller utviklingsstadier av dyr. Når du arbeider med vev tykkere enn 5 mm, blir sondepenetrasjon en utfordring. I en slik situasjon er det nødvendig med ytterligere innsats for å utføre vevskryoseksjon eller ytterligere endre protokollen beskrevet i denne studien.
HCR WM-FISH er begrenset til samtidig å visualisere bare noen få genmål om gangen sammenlignet med romlig transkriptomikk som potensielt kan tillate samtidig avbildning av tusenvis av gener19. Kommersiell syntese av RNA-prober er dyrt; Alternativet ville være å produsere sonder og forsterkere i laboratoriet, men dette kan være utfordrende for de fleste grupper og er arbeidskrevende og tidkrevende. Denne protokollen er også begrenset av vanskeligheter som oppstår ved RNA-sondepenetrasjon gjennom helmonterte tykke prøver, noe som kan kreve endringer i protokollen (f.eks. Trinn 2 vevsforberedelse) eller seksjonering av det intakte vevet. Hvis HCR WM-FISH-metoden beskrevet her ikke klarer å oppdage en RNA-transkript i et olfaktorisk vedheng, kan genet uttrykkes i bare noen få celler og kreve omfattende kartlegging av vevet, er muligens ikke transkribert, eller kan transkriberes på et nivå under deteksjonsgrensen for denne metoden. Kvantitativ RT-PCR eller RNA seq kan utføres for å validere slike funn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Margo Herre og Leslie Vosshall lab for å dele deres in situ hybridiseringsprotokoll for Aedes aegypti olfaktoriske vedheng. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health til CJP (NIAID R01Al137078), et HHMI Hanna Gray-fellesskap til JIR, en Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award til JIR, og et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship til JIR Vi takker Johns Hopkins Malaria Research Institute og Bloomberg Philanthropies for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al.
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al.
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
