Summary
Artikeln beskriver de metoder och reagenser som är nödvändiga för att utföra hybridiseringskedjereaktion RNA helmonterad fluorescens in situ-hybridisering (HCR RNA WM-FISH) för att avslöja insikter i den rumsliga och cellulära upplösningen av kemosensoriska receptorgener i myggantennen och överkäkspalpen.
Abstract
Myggor är effektiva vektorer för dödliga sjukdomar och kan navigera i sin kemiska miljö med hjälp av kemosensoriska receptorer som uttrycks i deras luktbihang. Att förstå hur kemosensoriska receptorer är rumsligt organiserade i de perifera luktbihangen kan ge insikter om hur lukt kodas i myggornas luktsystem och informera om nya sätt att bekämpa spridningen av myggburna sjukdomar. Framväxten av tredje generationens hybridiseringskedjereaktions-RNA helmonterad fluorescens in situ-hybridisering (HCR RNA WM-FISH) möjliggör rumslig kartläggning och samtidig uttrycksprofilering av flera kemosensoriska gener. Här beskriver vi ett stegvis tillvägagångssätt för att utföra HCR RNA WM-FISH på Anopheles myggantenn och maxillär palp. Vi undersökte känsligheten hos denna teknik genom att undersöka uttrycksprofilen för jonotropa luktreceptorer. Vi frågade om HCR WM-FISH-tekniken som beskrevs var lämplig för multiplexade studier genom att binda RNA-sonder till tre spektralt distinkta fluoroforer. Resultaten gav bevis för att HCR RNA WM-FISH är robust känslig för att samtidigt detektera flera kemosensoriska gener i antennen och överkäkens palpluktbihang. Ytterligare undersökningar visar att HCR WM-FISH är lämpligt för samuttrycksprofilering av dubbel- och trippel-RNA-mål. Denna teknik, när den tillämpas med modifikationer, kan anpassas för att lokalisera gener av intresse i luktvävnaderna hos andra insektsarter eller i andra bihang.
Introduction
Myggvektorer som Anopheles gambiae förlitar sig på en rik repertoar av kemosensoriska gener som uttrycks i deras perifera luktbihang för att trivas i en komplex kemisk värld och identifiera beteendemässigt relevanta lukter som härrör från mänskliga värdar, upptäcka nektarkällor och lokalisera äggläggningsställen1. Myggantennen och överkäken är berikade med kemosensoriska gener som driver luktdetektering i dessa luktbihang. Tre huvudklasser av ligandstyrda jonkanaler driver luktdetektering i myggornas luktbihang: Odorantreceptorerna (OR), som fungerar med en obligat Odorant-receptor-co-receptor (Orco); de jonotropa receptorerna (IR), som interagerar med en eller flera IR-koreceptorer (IR8a, IR25a och IR76b); de kemosensoriska smakreceptorerna (GR), som fungerar som ett komplex av tre proteiner för att detektera koldioxid (CO2)1,2.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering är ett kraftfullt verktyg för att detektera uttrycket av endogent mRNA3. I allmänhet använder denna metod en fluoroformärkt enkelsträngad nukleinsyrasond med sekvens som är komplementär till ett mål-mRNA. Bindning av den fluorescerande RNA-sonden till mål-RNA möjliggör identifiering av celler som uttrycker ett transkript av intresse. De senaste framstegen gör det nu möjligt att detektera transkript i hela myggvävnader 4,5. Den första generationen av hybridiseringskedjereaktionsteknik (HCR) använde en RNA-baserad HCR-förstärkare; Detta förbättrades i en andra generationens metod som istället använde konstruerat DNA för HCR-förstärkaren 6,7. Denna uppgradering resulterade i en 10x ökning av signalen, en dramatisk minskning av produktionskostnaden och en betydande förbättring av hållbarheten hos reagenser 6,7.
I protokollet beskriver vi användningen av en tredje generationens HCR-helmonterad RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetod (HCR RNA WM-FISH) som är utformad för att detektera den rumsliga lokaliseringen och uttrycket av vilken gen som helst 8,9. Denna tvåstegsmetod använder först nukleinsyrasonder som är specifika för det mRNA som är av intresse, men som också innehåller en initiatorigenkänningssekvens; I det andra steget används fluoroformärkta hårnålar som binder till initiatorsekvensen för att förstärka den fluorescerande signalen (figur 1). Denna metod möjliggör också multiplexering av två eller flera RNA-sonder och förstärkning av sondsignaler för att underlätta RNA-detektion och kvantifiering8. Visualisering av transkriptöverflöd och RNA-lokaliseringsmönster för kemosensoriska gener som uttrycks i luktbihangen ger den första insikten om kemosensoriska genfunktioner och luktkodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Överväganden och förberedelse av material
- Bestäm om hel- eller kryosnitt av vävnad är lämpligt. Detta protokoll är optimerat för helmonterad in situ-avbildning av RNA i Anopheles-myggantennen och maxillär palp utan kryosnitt. Om proverna är tjockare än 5 mm rekommenderas kryosnittning för att möjliggöra sondpenetration.
- Identifiera de gener som är av intresse och kopiera sekvenserna inklusive introner och exoner från en lämplig databas. Transkribera gensekvensen till RNA för syntes.
- Bestäm om du ska köpa sonder från kommersiella leverantörer eller om sonder ska syntetiseras i laboratoriet.
OBS: I denna studie köptes in situ-sonderna från en kommersiell leverantör (se materialtabell). Alternativt kan det syntetiseras som tidigare rapporterats10. Reagenser som användes i studien beskrivs i tabell 1. Material som krävs för att bereda reagenserna listas i materialtabellen.
2. Förfixering av vävnad
- Bedöva 10-15 vuxna hon- eller hanmyggor av typen Anopheles coluzzii (stam N'Gousso), som är 5-10 dagar gamla efter uppkomsten, genom att samla in dem med en munsug i en pappersmugg eller ett plaströr och placera dem i en hink med is. En lyckad köldinducerad anestesi kan bekräftas när myggorna är orörliga.
- Halshugg dem genom att ta bort huvudena från halsregionen med en pincett. Använd den icke-dominanta handen och ta tag i bröstkorgen med en pincett och separera halsen från kroppen med en pincett som hålls av den dominanta handen. Placera huvudena i ett 1,5 ml rör som innehåller 500 μL kitinas-kymotrypsindimetylsulfoxidbuffert (CCD-buffert) på is.
OBS: Frysande djur kan deformera antennerna; En snabb nedtagning på is rekommenderas. Myggans ålder under testningen kan variera beroende på projektet. Det är viktigt att bekräfta och samordna deras fysiologiska status, till exempel om de är blodmatade, svälter eller paras. I denna studie provtogs luktbihang från myggor som hade blivit blodmatade och parade sig. - Förvärm mygghuvuden i CCD-buffert vid 37 ° C på ett värmeblock i 5 minuter och överför sedan röret som innehåller mygghuvudena till en hybridiseringsugn och rotera vid 37 ° C. Inkubationstiden i CCD-buffert beror på vävnadstyp. För honantenner av typen Anopheles används 20 minuter, hanantenner kräver 15 minuter, medan längre inkubationstid (1 timme) behövs för överkäkspalperna.
- Överför hela rörets innehåll till ett dissekerande klockglas. Häll försiktigt sample i fördjupningen av ett klockglas (dissektion). Om mygghuvuden har fastnat inuti röret, använd en pipett för att lägga till CCD-buffert i röret och skölj ur huvudet.
- Använd en pincett för att försiktigt överföra huvudena eller eventuella antenner/palper som lossnat under inkubationen och fixera i 1 ml av förfixeringsmedlet.
OBS: Överbliven CCD-buffert kan bevaras vid -20 ° C. Buffert kan återanvändas upp till 3x. Om förfixeringsmedlet blir något brunaktigt på grund av CCD-buffertöverföringen av vävnaderna, byt ut det mot ytterligare 1 ml fixeringsmedel. - Vrid huvudena i förfixeringsmedel i 24 timmar vid 4 °C med hjälp av en mutter.
OBS: Vipphastigheten för muttern som användes i denna studie var inte justerbar; Standardhastigheten som ställts in (12 varv/min) av tillverkaren användes.
3. Dissektion av vävnad
- Skölj huvudena 4 gånger (5 min per tvätt) med 1 ml 0,1 % PBS-Tween på is. För att undvika sample förlust, använd en pipett fäst vid gelladdningsspetsen för att ta bort vätskan.
OBS: Två snabba tvättar följt av en 10 min lång tvätt och en sista snabbtvätt kan utföras istället för steg 3.1. - Överför huvudena i röret till ett dissekerande klockglas. Häll försiktigt sample i fördjupningen av ett klockglas. Skölj ur mygghuvuden som har fastnat i röret med 0,1 % PBS-Tween.
- Ta bort vävnader av intresse (antenner/palper) från huvudet med en vass pincett under ett dissekerande mikroskop. Håll den bakre delen av huvudet med en pincett och ta tag i en antenn med en annan pincett från basen. Rengör pincetten med papper fuktat med RNAse-fri lösningsmedel. Ta bort palperna på samma sätt.
- Överför antennerna och palperna med pincett till tomma DNA/RNas-fria rör som placeras på is. Separera de olika vävnadsdelarna i förmärkta olika rör.
- Dehydratisera vävnad i 400 μl lösningsmedel innehållande en blandning av metanol (MeOH 80 %) och dimetylsulfoxid (DMSO 20 %) i 1 timme vid rumstemperatur.
OBS: Det finns inget behov av att placera vävnad på en nutator; Låt den sitta på ett rörställ i rumstemperatur på labbbänken. Det rekommenderas att använda färsk lösningsmedelsblandning. För en 500 μL stamlösning, blanda 400 μL MeOH med 100 μL DMSO. - Ersätt det dehydratiseringsreagenset med 400 μl absolut (100 %) metanol och dehydrera vävnaderna över natten vid -20 °C. Låt vävnaderna sedimentera genom gravitationen och använd en pipett för att ta bort vätskan.
OBS: Samples är livskraftiga under längre perioder av uttorkning, upp till 4 nätter har testats utan förlust av signal.
4. Efterfixering av vävnad
- Rehydrera vävnader i en fyrstegsserie av graderad 400 μL MeOH/PBS-Tween i 10 minuter på is. Börja med 75 % MeOH/25 % PBS-Tween följt av 50 % MeOH/50 % PBS-Tween, sedan 25 % MeOH/75 % PBS-Tween och slutligen 100 % PBS-Tween.
OBS: En gelladdningsspets med en liten öppning kan användas för att ta bort bufferten från röret för att undvika att vävnaderna går förlorade. Borttagning av buffert kan göras under ett dissekerande mikroskop. - Tvätta med 400 μL fosfatbuffrad koksaltlösning innehållande 0,1 % Tween-20 (PBS-T) i 10 minuter i rumstemperatur. Tvätta genom att placera provet på en nutator.
- Gör en 20 μg/ml proteinas-K-lösning och inkubera i 400 μl proteinas-K-lösning i 30 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Späd 20 mg/ml proteinas-K-stam (1000x stamlösning), dvs 2 μL i 2 ml 0,1 % PBS-Tween. Resterna kan förvaras i en -20 ° C frys. - Stoppa enzymatisk nedbrytning av vävnad genom att tvätta 2 gånger i 10 minuter med 400 μL 0,1 % PBS-tween.
- Tillsätt 400 μl av postfixeringsmedlet och inkubera i 20 minuter i rumstemperatur. Tvätta 3 gånger, 15 min per tvätt, med 400 μL 0.1 % PBS-Tween.
5. Hybridisering av sond
- Inkubera vävnaden i 400 μl sondhybridiseringsbuffert i 5 min. Se till att vävnaden är helt nedsänkt i bufferten genom att försiktigt pipettera.
- Förbered dig för nästa steg genom att värma upp en alikvot av sondhybridiseringsbuffert till 37 ° C i 30 minuter.
- Ta bort bufferten och förhybridisera med 400 μL förvärmd sondhybridiseringsbuffert i 30 minuter vid 37 ° C.
- Gör sondlösning för de kemosensoriska receptorerna (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a eller Orco) genom att tillsätta 8 pM sond. Tillsätt 8 μl 1 μM sondstam till 500 μL förvärmd sondhybridiseringsbuffert.
- Ta bort den förvärmda sondhybridiseringsbufferten och ersätt den med 400 μl uppvärmd sondlösning.
- Inkubera vävnaden vid 37 ° C i två nätter på en nutator placerad i en inkubator och täckt under en låda.
6. Förstärkning av sond
- Värm upp sondtvättbufferten till 37 ° C. Ta bort överflödig sondlösning genom att skölja vävnaden 5 gånger, 10 min per tvätt, med 400 μL sondtvättbuffert vid 37 ° C, nuting i inkubatorn.
OBS: Förberedelser för steg 6.4 kan börja. Se anmärkningen i steg 6.4. - Tvätta proverna 2 gånger, 5 minuter per tvätt, med 400 μL 5 x saltlösning-natriumcitrat innehållande 10 % Tween-20 (SSCT) vid rumstemperatur. Tina amplifieringsbufferten till rumstemperatur på en bänkskiva.
- Förbered vävnaden för amplifiering genom inkubation med 400 μl amplifieringsbuffert i 10 minuter vid rumstemperatur. På grund av amplifieringsbuffertens viskositet kan det hända att vävnader inte är helt nedsänkta. Blanda genom att försiktigt pipettera amplifieringsbufferten under vävnaden och driva ut bufferten ovanpå vävnaden tills de är nedsänkta.
- Bered separat 18 pM hårnål h1 och 18 pM hårnål h2 genom att värma 6 μl 3 μM stam vid 95 °C i 90 s och svalna till rumstemperatur i en mörk låda i 30 minuter. Se till att PCR-rören är tätt täckta för att förhindra avdunstning av hårnålarna under uppvärmning i en termisk cykler.
OBS: För att spara tid kan steg 6.4 initieras under det 4:e tvättsteget i steg 6.1. Hårnålar bör värmas separat för att förhindra korsreaktion. Hårnålar bör inte spädas ut med någon buffert i detta steg. Hårnålarna kan köpas från sondtillverkaren tillsammans med sonderna. - Byt ut amplifieringsbufferten som tillsattes i steg 6.3 med en blandning som innehåller de uppvärmda hårnålarna (från steg 6.4) tillsammans med 100 μL amplifieringsbuffert. En typisk reaktion innehåller 6 μL h1, 6 μL h2 och 100 μL förstärkningsbuffert.
OBS: Hårnålarna h1 och h2 kan kombineras efter kylning till rumstemperatur och sedan tillsättas till 100 μL amplifieringsbuffert. För att undvika att vävnadsproverna överförs från ett rör till ett annat kan amplifieringsbufferten i steg 6.3 tas bort och ersättas med hårnålsblandningen utspädd i amplifieringsbufferten. - Inkubera vävnaden över natten och nutera i mörker vid rumstemperatur med hjälp av mutterns standardhastighet.
7. Montering av vävnadsprov
- Späd amplifieringsbufferten i den inkuberade vävnaden med 300 μl 5x SSCT (natriumklorid-natriumcitrat utspätt i Tween-20).
OBS: Utspädningen är till hjälp för att minska viskositeten och gör det lättare att ta bort förstärkningsbufferten från vävnaden. Vi använde Triton-X 100 för prefixativ och Tween-20 för postfixativ på grund av skillnaderna i deras verkan som medel för att permeabilisera cellmembran. - Tvätta servetten 5 gånger med 400 μL 5 x SSCT vid rumstemperatur.
OBS: Förvara vävnaden tillfälligt vid 4 °C tills den är redo att monteras, om det behövs. Vi har inte överskridit 2 dagar före avbildning. - Gör 5 droppar monteringslösning på en glasskiva. Skär av spetsen på en 200 μL pipettspets för att göra den bredare och överför vävnaden till ett nytt glasglas.
- Ta tag i vävnadsproverna i basen med en pincett och sänk försiktigt ner och skölj i en serie droppar av monteringslösningen. Var försiktig så att du inte bryter vävnaderna i detta steg.
- Montera med monteringslösning, placera täckglas och försegla med nagellack. Ta vävnadsprover in situ med hjälp av ett konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Robust detektion av kemosensoriska gener i Anopheles-antenn
Vi undersökte känsligheten hos HCR FISH-metoden (Figur 1) för att detektera uttrycket av kemosensoriska receptorer i myggors luktvävnader. Med hjälp av RNA-transkriptdata som tidigare rapporterats på den kvinnliga Anopheles-myggantennen, genererade vi sonder för att rikta in oss på en mängd olika IR. De genomsnittliga transkriptvärdena från fyra oberoende antenntranskriptomstudier visade att Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) och Ir7t (13 RPKM) var mindre rikligt förekommande i antennen jämfört med co-receptorerna Ir25a (197 RPKM) och Ir76b (193 RPKM)5,11,12,13,14. Vi genererade sonder för att rikta in oss på Ir41t.1, Ir75d och Ir7t. IR64a (31 RPKM) var också måltavla med tanke på att dess transkriptnivå är cirka 3 gånger rikligare än det lägsta transkriptvärdet bland kandidatgenerna av intresse. Det måste noteras här att RPKM-värden från transkriptomikstudier representerar en bulkmätning av transkript från hela antennen. Som sådan kan det vara så att endast ett fåtal neuroner starkt uttrycker ett IR-gentranskript, eller så kan det vara så att en IR-gen uttrycks lågt i många celler. RPKM-värden behöver därför inte nödvändigtvis motsvara överflödsnivån för en IR i en neuron. Dessutom kan den signalförstärkning som HCR-metoden ger också göra det svårt att använda denna metod för att exakt mäta neuronala transkriptnivåer baserat på fluorescerande signaler. I vår senaste publikation diskuterade vi dessa begrepp mer i detalj5. Data tyder på att HCR WM-FISH är mycket känsligt för att detektera mRNA-transkript från antennvävnader, vilket visas i figur 2.
Multiplexad sammärkning av olika RNA-mål i kemosensoriska bihang
För att undersöka samlokaliseringen av RNA-mål genererade vi prober konjugerade till olika fluoroforer. Dubbel in situ-hybridisering riktad mot transkript av Odorant-receptor-co-receptorgenen (Orco) och den mest brett uttryckta jonotropa receptor-co-receptorgenen (Ir25a) avslöjade samlokalisering av dessa distinkta kemosensoriska receptorfamiljer i en undergrupp av cellpopulationer i antennen (Figur 3A) och maxillär palp (Figur 3B). Vi undersökte också samlokaliseringen av transkript av tre IR-coreceptorgener (Ir8a, Ir25a och Ir76b). Samlokaliseringsmönster tyder på att Ir76b-positiva celler uttrycker Ir25a, medan Ir8a-positiva celler delvis samlokaliseras med Ir76b och Ir25a (figur 4). Samuttrycksanalysen av IR-koreceptorerna visar robustheten i att använda HCR WM-FISH för multiplexa studier.
Figur 1: Schematisk bild av in situ-hybridiseringskedjereaktionen . Denna metod fungerar i två steg: detektering och förstärkning. En sond för in situ hybridiseringskedjereaktion består av en delad initiator och en nukleinsyrasekvens som är specifik för RNA-målet. Flera par av sonduppsättningar kan designas för att hybridisera flera regioner i RNA-målet; Detta definierar detekteringssteget. Förstärkningssteget kräver fluoroformärkta hårnålar (h1 och h2) för att binda specifikt till initiatorn som är konjugerad till en sonduppsättning. Vid bindning förstärks RNA-signalen märkt av fluoroforen genom upprepad bindning av fluoroformärkta hårnålar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: RNA-lokalisering av IR-kemosensoriska gener. HCR WM-FISK av honan Anopheles coluzzii antenner för att rikta in sig på IR. RNA-sonder inkluderar (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t och (D) IR64a. Infällningarna i vita streckade rutor är förstorade bilder från vävnaden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Dubbel in situ samlokalisering av kemosensoriska gener i antennen och överkäkspalpen. Konfokala Z-stackbilder av celler som uttrycker Ir25a (grön) och Orco (magenta) i (A) antennen och (B) överkäkspalpen hos honmyggor av honkön . Infällningarna i vita streckade rutor är förstorade bilder från vävnaden. Skalan är 10 μm. Figur 3B har ändrats från15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kartläggning av den rumsliga samlokaliseringen av flera RNA-mål. In situ-bilder som visar samlokaliseringsmönster för tre IR-koreceptorer, IR25a (magenta), IR8a (grön) och IR76b (blå) i myggantennen. Vita pilar pekar på celler som uttrycker de tre IR-koreceptorerna (IR25a, IR8a och IR76b). Skalan är 20 μm. Denna siffra har ändrats från5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Reagenser för in situ-hybridiseringskedjereaktion. Reagenser som behövs för att utföra hybridiseringskedjereaktion helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering . Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tredje generationen av hybridiseringskedjereaktion (HCR) är anmärkningsvärd för sin känslighet och robusthet för att visualisera flera RNA-mål8. HCR WM-FISH har framgångsrikt använts på embryon från Drosophila, kycklingar, möss och zebrafiskar samt larver av nematoder och zebrafiskar 10,16,17. Myggantenner och överkäkspaper är vanligtvis benägna att drabbas av hög autofluorescens och svag sondpenetration, vilket är särskilt utmanande när man utför traditionella in situ-metoder med helmontering. Dessa nackdelar har minskats av signalförstärkningssteget som är integrerat i HCR-protokollet, vilket förbättrar signal-till-bakgrundsförhållandet och möjliggör detektion av luktkemoreceptor-mRNA-transkript (figur 2). HCR-protokollets design säkerställer att de initierande sonderna är bundna till amplifieringspolymererna, vilket gör det möjligt att avbilda RNA-mål med låg signal. I den multiplexade uppställningen var olika ortogonala HCR-förstärkare bundna till spektralt unika fluoroforer. Detta tillvägagångssätt var avgörande för att undvika spektral genomblödning från en närliggande bildkanal.
För att optimera HCR-metoden för användning med myggbihang gjorde vi flera observationer. HCR-förstärkarna är ljuskänsliga och ska alltid förvaras i en låda i en frys med -20 °C. Enligt vår erfarenhet kan omfattande inkubation av vävnader i CCD-buffert, proteinas K eller kort fixeringstid i paraformaldehyd resultera i brott på antenner eller palper under tvättstegen. Antenner och maxillära palper bör också alltid gripas av basen för att undvika brott. I det tidiga skedet av anpassningen av detta protokoll förlorade vi konsekvent vävnader under serien av buffertutbyten (steg 5 och 6). För att minimera sådana förluster fördubblades antalet vävnader i början av experimentet, tvättsteg och buffertbyten utfördes under mikroskopet och gelladdningsspetsar som inte var bredare än 0,5 mm användes för att ta bort buffertarna från vävnaderna.
HCR WM-FISH har varit framgångsrik i perifera luktbihang av Anopheles gambiae 5,15 och Aedes aegypti 4,18 myggvektorer, och protokollet kan ytterligare optimeras och anpassas till andra insektsvävnadsdelar eller olika djur. Det ursprungliga protokollet som utformats av tillverkaren innehåller inte inkubation i CCD-bufferten. Detta steg integrerades i protokollet för att smälta och permeabilisera kitinkutikeln. Vi förlängde inkubationstiden i sonduppsättningarna med två nätter för att ge mer tid för sondpenetration, en modifiering av tillverkarens protokoll som rekommenderar en inkubationstid på 16 timmar som fungerar bra för generiska prover på ett objektglas. Optimering av detta protokoll för andra delar av insektsvävnad skulle kräva att inkubationstiden i CCD-bufferten varieras. Perifera vävnadsdelar med tjocka nagelband kommer sannolikt att kräva förlängd inkubationstid. Koncentrationen av proteinas K måste också justeras experimentellt samtidigt som detta protokoll anpassas till olika vävnads- eller utvecklingsstadier hos djur. När man arbetar med vävnader som är tjockare än 5 mm blir sondpenetration en utmaning. I en sådan situation krävs ytterligare ansträngningar för att utföra vävnadskryosektion eller ytterligare ändra protokollet som beskrivs i denna studie.
HCR WM-FISH är begränsad till att samtidigt visualisera endast ett fåtal genmål åt gången, jämfört med spatial transkriptomik, som potentiellt skulle kunna möjliggöra samtidig avbildning av tusentals gener19. Kommersiell syntes av RNA-sonder är dyrt; Alternativet skulle vara att producera sonderna och förstärkarna i laboratoriet, men detta kan vara utmanande för de flesta grupper och är arbetsintensivt och tidskrävande. Detta protokoll begränsas också av svårigheter med RNA-sondpenetration genom tjocka prover med hela monteringen, vilket kan kräva ändringar i protokollet (t.ex. vävnadsberedning i steg 2) eller snittning av den intakta vävnaden. Om HCR WM-FISH-metoden som beskrivs här misslyckas med att detektera ett RNA-transkript i ett luktbihang, kan genen uttryckas i endast ett fåtal celler och kräva omfattande kartläggning av vävnaden, eventuellt inte transkriberas eller transkriberas på en nivå under detektionsgränsen för denna metod. Kvantitativ RT-PCR eller RNA-seq kan utföras för att validera sådana fynd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Margo Herre och Leslie Vosshall-labbet för att de delade med sig av sitt in-situ hybridiseringsprotokoll för Aedes aegypti luktbihang. Detta arbete stöddes av anslag från National Institutes of Health till C.J.P. (NIAID R01Al137078), ett HHMI Hanna Gray-stipendium till J.I.R, ett Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award till J.I.R. och ett Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship till J.I.R. Vi tackar Johns Hopkins Malaria Research Institute och Bloomberg Philanthropies för deras stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al.
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al.
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
