Summary
Makale, sivrisinek anteni ve maksiller palptaki kemosensoriyel reseptör genlerinin uzamsal ve hücresel çözünürlüğüne ilişkin içgörüleri ortaya çıkarmak için hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (HCR, RNA, WM-FISH) gerçekleştirmek için gerekli yöntemleri ve reaktifleri açıklamaktadır.
Abstract
Sivrisinekler ölümcül hastalıkların etkili vektörleridir ve koku alma eklerinde eksprese edilen kemosensör reseptörlerini kullanarak kimyasal çevrelerinde gezinebilirler. Kemosensoriyel reseptörlerin periferik koku alma eklerinde uzamsal olarak nasıl organize edildiğini anlamak, sivrisinek koku alma sisteminde kokunun nasıl kodlandığına dair içgörüler sunabilir ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasıyla mücadele etmenin yeni yollarını bilgilendirebilir. Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun (HCR RNA WM-FISH) ortaya çıkışı, çoklu kemosensoriyel genlerin uzamsal haritalanmasına ve eşzamanlı ekspresyon profiline izin verir. Burada, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp üzerinde HCR RNA WM-FISH gerçekleştirmek için aşamalı bir yaklaşım açıklıyoruz. Bu tekniğin duyarlılığını, iyonotropik koku alma reseptörlerinin ekspresyon profilini inceleyerek araştırdık. Tarif edilen HCR WM-FISH tekniğinin, RNA problarını spektral olarak farklı üç florofora bağlayarak çoğullanmış çalışmalar için uygun olup olmadığını sorduk. Sonuçlar, HCR RNA WM-FISH'in anten ve maksiller palp koku alma uzantılarındaki çoklu kemosensör genleri aynı anda tespit etmek için sağlam bir şekilde duyarlı olduğuna dair kanıt sağladı. Daha ileri araştırmalar, HCR WM-FISH'in ikili ve üçlü RNA hedeflerinin birlikte ekspresyon profilinin çıkarılması için uygunluğunu doğrulamaktadır. Bu teknik, modifikasyonlarla uygulandığında, diğer böcek türlerinin koku alma dokularında veya diğer uzantılarda ilgilenilen genleri lokalize etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Anopheles gambiae gibi sivrisinek vektörleri, karmaşık bir kimyasal dünyada gelişmek ve insan konakçılardan yayılan davranışsal olarak ilgili kokuları tanımlamak, nektar kaynaklarını tespit etmek ve yumurtlama bölgelerini bulmak için periferik koku uzantılarında ifade edilen zengin bir kemosensör gen repertuarına güvenir1. Sivrisinek anteni ve maksiller palp, bu koku uzantılarında koku algılamayı sağlayan kemosensör genlerle zenginleştirilmiştir. Üç ana ligand kapılı iyon kanalı sınıfı, sivrisineklerin koku alma uzantılarında koku algılamayı sağlar: zorunlu bir Koku reseptörü ko-reseptörü (Orco) ile işlev gören Koku reseptörleri (OR'ler); bir veya daha fazla IR koreseptörü (IR8a, IR25a ve IR76b) ile etkileşime giren İyonotropik reseptörler (IR'ler); karbondioksiti (CO2) tespit etmek için üç proteinden oluşan bir kompleks olarak işlev gören kemosensoriyel Tat reseptörleri (GR'ler)1,2.
RNA floresansı in situ hibridizasyon, endojen mRNA3'ün ekspresyonunu tespit etmek için güçlü bir araçtır. Genel olarak, bu yöntem, bir hedef mRNA'yı tamamlayıcı diziye sahip florofor etiketli tek sarmallı bir nükleik asit probu kullanır. Floresan RNA probunun hedef RNA'ya bağlanması, ilgilenilen bir transkripti ifade eden hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Son gelişmeler artık tam monteli sivrisinek dokularındatranskriptlerin saptanmasını mümkün kılmaktadır 4,5. Birinci nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) teknolojisi, RNA tabanlı bir HCR amplifikatörü kullandı; bu, bunun yerine HCR amplifikatörü 6,7 için tasarlanmış DNA'yı kullanan ikinci nesil bir yöntemle geliştirildi. Bu yükseltme, sinyalde 10 kat artış, üretim maliyetinde dramatik bir düşüş vereaktiflerin dayanıklılığında önemli bir iyileşme ile sonuçlandı 6,7.
Protokolde, herhangi bir geninuzamsal lokalizasyonunu ve ekspresyonunu tespit etmek için tasarlanmış üçüncü nesil HCR tam montajlı RNA floresan in situ hibridizasyon (HCR RNA WM-FISH) yönteminin kullanımını açıklıyoruz 8,9. Bu iki aşamalı yöntem ilk olarak, ilgilenilen mRNA'ya özgü, ancak aynı zamanda bir başlatıcı tanıma dizisi içeren nükleik asit problarını kullanır; ikinci adım, floresan sinyalini yükseltmek için başlatıcı dizisine bağlanan florofor etiketli saç tokalarını kullanır (Şekil 1). Bu yöntem aynı zamanda iki veya daha fazla RNA probunun çoğullanmasına ve RNA tespitini ve nicelemeyi kolaylaştırmak için prob sinyallerinin yükseltilmesineizin verir 8. Koku eklerinde eksprese edilen kemosensör genlerin transkript bolluğu ve RNA lokalizasyon modellerini görselleştirmek, kemosensoriyel gen fonksiyonları ve koku kodlaması hakkında ilk içgörü satırını sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dikkat edilmesi gerekenler ve materyallerin hazırlanması
- Dokunun tam montajının mı yoksa kriyo kesitinin mi uygun olacağına karar verin. Bu protokol, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp'taki RNA'nın kriyo-kesit olmadan tam montajlı in situ görüntülenmesi için optimize edilmiştir. Numuneler 5 mm'den daha kalınsa, prob penetrasyonunu sağlamak için kriyo-kesit alınması önerilir.
- İlgilenilen genleri tanımlayın ve intronlar ve ekzonlar dahil olmak üzere dizileri uygun bir veritabanından kopyalayın. Sentez için gen dizisini RNA'ya kopyalayın.
- Probların ticari satıcılardan satın alınıp alınmayacağını veya probların laboratuvarda sentezlenip sentezlenmeyeceğini belirleyin.
NOT: Bu çalışmada, in situ problar ticari bir satıcıdan satın alınmıştır (bkz. Alternatif olarak, daha önce bildirildiği gibisentezlenebilir 10. Çalışmada kullanılan reaktifler Tablo 1'de açıklanmıştır. Reaktifleri hazırlamak için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
2. Doku ön fiksasyonu
- Yaşları 5-10 gün arasında değişen 10-15 adet erişkin dişi veya erkek Anopheles coluzzii sivrisineğini (N'Gousso suşu) ağız aspiratörü ile bir kağıt bardağa veya plastik tüpe toplayıp içinde buz bulunan bir kovaya koyarak uyuşturun. Sivrisinekler hareketsiz olduğunda başarılı bir soğuk kaynaklı anestezi doğrulanabilir.
- Bir çift forseps ile boyun bölgesinden kafaları çıkararak başlarını ayırın. Baskın olmayan eli kullanarak göğüs kafesini forseps ile kavrayın ve baskın elin tuttuğu forseps ile boynu vücuttan ayırın. Kafaları buz üzerinde 500 μL kitinaz-kimotripsin dimetil sülfoksit tamponu (CCD tamponu) içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
NOT: Donan hayvanlar antenleri deforme edebilir; Buz üzerinde hızlı bir şekilde devrilmesi önerilir. Test sırasında sivrisineğin yaşı projeye bağlı olarak değişebilir. Kanla beslenip beslenmedikleri, aç bırakılıp bırakılmadıkları veya çiftleşip çiftleşmedikleri gibi fizyolojik durumlarını doğrulamak ve koordine etmek önemlidir. Bu çalışmada, kanla beslenen ve çiftleşen sivrisineklerden koku uzantıları örneklendi. - Sivrisinek kafalarını CCD tamponunda 37 ° C'de bir ısı bloğunda 5 dakika önceden ısıtın ve ardından sivrisinek başlıklarını içeren tüpü bir hibridizasyon fırınına aktarın ve 37 ° C'de döndürün CCD tamponunda inkübasyon süresi doku tipine bağlıdır. Dişi Anofel antenleri için 20 dakika, erkek antenler 15 dakika gerektirirken, maksiller palplar için daha uzun inkübasyon süresi (1 saat) gerekir.
- Tüpün tüm içeriğini diseksiyon yapan bir saat camına aktarın. Numuneyi yavaşça bir saat (diseksiyon) camının çöküntüsüne dökün. Sivrisinek kafaları tüpün içine sıkışmışsa, tüpe CCD tamponu eklemek için bir pipet kullanın ve kafayı durulayın.
- İnkübasyon sırasında ayrılan kafaları veya herhangi bir anteni/avuç içini dikkatlice aktarmak için forseps kullanın ve ön fiksatifin 1 mL'sine sabitleyin.
NOT: Artık CCD tamponu -20 ° C'de korunabilir, tampon 3x'e kadar tekrar kullanılabilir. Ön fiksatif, dokular tarafından CCD tamponunun taşınması nedeniyle hafif kahverengimsi hale gelirse, başka bir 1 mL fiksatif ile değiştirin. - Bir nutatör kullanarak kafaları 24 saat boyunca 4°C'de ön fiksatifte döndürün.
NOT: Bu çalışmada kullanılan nutator için sallanma hızı ayarlanamamıştır; Üretici tarafından ayarlanan varsayılan hız (12 rpm) kullanıldı.
3. Doku diseksiyonu
- Başlıkları 4x (yıkama başına 5 dakika) buz üzerinde 1 mL %0.1 PBS-Tween ile durulayın. Numune kaybını önlemek için, sıvıyı çıkarmak için jel yükleme ucuna bağlı bir pipet kullanın.
NOT: Adım 3.1 yerine iki hızlı yıkama, ardından 10 dakika uzunluğunda yıkama ve son bir hızlı yıkama gerçekleştirilebilir. - Tüpteki kafaları bir diseksiyon saat camına aktarın. Numuneyi yavaşça bir saat camının çöküntüsüne dökün. Tüpün içine sıkışmış sivrisinek başlıklarını %0.1 PBS-Tween ile durulayın.
- Diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen dokuları (antenler / avuç içleri) keskin forseps ile kafadan çıkarın. Başın arka kısmını forseps ile tutun ve tabandan başka bir forseps ile bir anten alın. Forsepsleri RNAse içermeyen çözücü ile nemlendirilmiş kağıtla temizleyin. Aynı işlemi kullanarak avuç içlerini çıkarın.
- Antenleri ve avuç içlerini forseps ile buz üzerine yerleştirilmiş boş DNA/RNaz içermeyen tüplere aktarın. Farklı doku parçalarını önceden etiketlenmiş farklı tüplere ayırın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca metanol (MeOH% 80) ve Dimetil sülfoksit (DMSO% 20) karışımı içeren 400 μL çözücü içinde dokuyu kurutun.
NOT: Bir nutatör üzerine doku yerleştirmeye gerek yoktur; Laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında bir tüp rafına oturmasına izin verin. Taze solvent karışımı kullanılması tavsiye edilir. 500 μL'lik bir stok çözeltisi için 400 μL MeOH'yi 100 μL DMSO ile karıştırın. - Dehidrasyon reaktifini 400 μL mutlak (%100) metanol ile değiştirin ve dokuları gece boyunca -20 °C'de kurutun. Dokuların yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın.
NOT: Numuneler uzun süreli dehidrasyon için uygundur, sinyal kaybı olmadan 4 geceye kadar test edilmiştir.
4. Doku sonrası fiksasyon
- Dokuları dört aşamalı bir dizi dereceli 400 μL MeOH / PBS-Tween'de buz üzerinde 10 dakika boyunca rehidre edin. %75 MeOH/%25 PBS-Tween ile başlayın, ardından %50 MeOH/%50 PBS-Tween, ardından %25 MeOH/%75 PBS-Tween ve son olarak %100 PBS-Tween ile başlayın.
NOT: Dokuları kaybetmemek için tamponu tüpten çıkarmak için küçük bir açıklığa sahip bir jel yükleme ucu kullanılabilir. Tampon çıkarma işlemi diseksiyon mikroskobu altında yapılabilir. - %0,1 Tween-20 (PBS-T) içeren 400 μL fosfat tamponlu salin ile oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın. Numuneyi bir nutatör üzerine yerleştirerek yıkayın.
- 20 μg/mL Proteinaz-K çözeltisi yapın ve 400 μL Proteinaz-K çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
NOT: 20 mg / mL Proteinaz-K stoğunu (1000x stok çözeltisi) seyreltin, yani 2 mL% 0.1 PBS-Tween'de 2 μL. Kalan -20 ° C'lik bir dondurucuda saklanabilir. - 400 μL% 0.1 PBS-tween ile 10 dakika boyunca 2x yıkayarak dokunun enzimatik sindirimini durdurun.
- 400 μL post-fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 400 μL %0,1 PBS-Tween ile yıkama başına 3 kez, 15 dakika yıkayın.
5. Prob hibridizasyonu,
- Dokuyu 400 μL prob hibridizasyon tamponunda 5 dakika inkübe edin. Hafifçe pipetleyerek dokunun tampona tamamen daldırıldığından emin olun.
- Bir dizi prob hibridizasyon tamponunu 30 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtarak bir sonraki adıma hazırlanın.
- Tamponu çıkarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca 400 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponu ile ön hibridize edin.
- 8 pM prob ekleyerek hedef kemosensör reseptörleri (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a veya Orco) için prob çözeltisi yapın. 500 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponuna 8 μL 1 μM prob stoğu ekleyin.
- Önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponunu çıkarın ve 400 μL ısıtılmış prob çözeltisi ile değiştirin.
- Bir inkübatörün içine yerleştirilmiş ve bir kutunun altına örtülmüş bir nutatör üzerinde iki gece boyunca 37 ° C'de doku inkübe edin.
6. Prob amplifikasyonu
- Prob yıkama tamponunu 37 ° C'ye ısıtın Dokuyu yıkama başına 5x, 10 dakika, 37 ° C'de 400 μL prob yıkama tamponu ile durulayarak, inkübatörde nutlayarak fazla prob çözeltisini çıkarın.
NOT: Adım 6.4 için hazırlık başlayabilir. Adım 6.4'teki nota bakın. - Numuneleri oda sıcaklığında %10 Tween-20 (SSCT) içeren 400 μL 5x salin-sodyum sitrat ile yıkama başına 2x, 5 dakika yıkayın. Amplifikasyon tamponunu bir tezgah üstünde oda sıcaklığına çözdürün.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 μL amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek dokuyu amplifikasyon için hazırlayın. Amplifikasyon tamponunun viskozitesi nedeniyle, dokular tamamen suya batırılmayabilir. Amplifikasyon tamponunu dokunun altına nazikçe pipetleyerek ve tamponu suya batırılana kadar dokunun üstüne atarak karıştırın.
- 6 μL 3 μM stoğu 95 °C'de 90 saniye ısıtarak ve karanlık bir çekmecede 30 dakika oda sıcaklığına soğutarak 18 pM firkete h1 ve 18 pM firkete h2'yi ayrı ayrı hazırlayın. Bir termal döngüleyicide ısıtırken saç tokalarının buharlaşmasını önlemek için PCR tüplerinin sıkıca kapatıldığından emin olun.
NOT: Zaman kazanmak için, adım 6.1'deki 4. yıkama adımında adım 6.4 başlatılabilir. Çapraz reaksiyonu önlemek için saç tokaları ayrı ayrı ısıtılmalıdır. Saç tokaları bu adımda herhangi bir tampon ile seyreltilmemelidir. Saç tokaları, problarla birlikte prob üreticisinden satın alınabilir. - Adım 6.3'te eklenen amplifikasyon tamponunu, 100 μL amplifikasyon tamponu ile birlikte ısıtılmış saç tokalarını (adım 6.4'ten itibaren) içeren bir karışımla değiştirin. Tipik bir reaksiyon 6 μL h1, 6 μL h2 ve 100 μL amplifikasyon tamponu içerecektir.
NOT: Saç tokaları h1 ve h2, oda sıcaklığına soğutulduktan sonra birleştirilebilir ve daha sonra 100 μL amplifikasyon tamponuna eklenebilir. Doku örneklerinin bir tüpten diğerine aktarılmasını önlemek için, adım 6.3'teki amplifikasyon tamponu çıkarılabilir ve amplifikasyon tamponunda seyreltilmiş saç tokası karışımı ile değiştirilebilir. - Dokuyu gece boyunca inkübe edin ve nutatörün varsayılan hızını kullanarak oda sıcaklığında karanlıkta nutat edin.
7. Montaj dokusu örneği
- İnkübe edilmiş dokudaki amplifikasyon tamponunu 300 μL 5x SSCT (Tween-20'de seyreltilmiş sodyum klorür-sodyum sitrat) ile seyreltin.
NOT: Seyreltme, viskoziteyi azaltmaya yardımcı olur ve amplifikasyon tamponunun dokudan çıkarılmasını kolaylaştırır. Hücre zarını geçirgen hale getirmek için ajanlar olarak eylemlerindeki farklılıklar nedeniyle ön fiksatif için Triton-X 100 ve fiksasyon sonrası adım için Tween-20 kullandık. - Dokuyu oda sıcaklığında 400 μL 5x SSCT ile 5x yıkayın.
NOT: Gerekirse, mendili takılmaya hazır olana kadar geçici olarak 4 °C'de saklayın. Görüntülemeden önce 2 günü geçmedik. - Bir cam slayt üzerine 5 damla montaj çözeltisi yapın. 200 μL'lik bir pipet ucunun ucunu daha geniş hale getirmek için kesin ve dokuyu yeni bir cam slayta aktarın.
- Doku örneklerini forseps ile tabanlarından tutun ve bir dizi montaj solüsyonu damlacığına hafifçe daldırın ve durulayın. Bu adımda dokuları kırmamaya dikkat edin.
- Montaj solüsyonu ile monte edin, lamel yerleştirin ve oje ile kapatın. Konfokal mikroskop kullanarak in situ doku örneklerini görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anopheles anteninde kemosensör genlerin sağlam tespiti
Sivrisinek koku dokularında kemosensör reseptörlerinin ekspresyonunu saptamak için HCR FISH yönteminin (Şekil 1) duyarlılığını araştırdık. Dişi Anofel sivrisinek anteninde daha önce bildirilen RNA transkript verilerinin rehberliğinde, çeşitli IR'leri hedeflemek için problar ürettik. Dört bağımsız anten transkriptom çalışmasından elde edilen ortalama transkript değerleri, Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM) ve Ir7t'nin (13 RPKM), Ir25a (197 RPKM) ve Ir76b (193 RPKM) ko-reseptörlerine kıyasla antende daha az bol olduğunu ortaya koydu.5,11,12,13,14. Ir41t.1, Ir75d ve Ir7t'yi hedeflemek için problar ürettik. IR64a (31 RPKM), transkript seviyesinin, ilgilenilen aday genler arasındaki en düşük transkript değerinden yaklaşık 3 kat daha fazla olduğu göz önüne alındığında da hedeflenmiştir. Burada, transkriptomik çalışmalardan elde edilen RPKM değerlerinin, tüm antenden alınan transkriptlerin toplu bir ölçümünü temsil ettiğine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, sadece birkaç nöron bir IR gen transkriptini yüksek oranda ifade ediyor olabilir veya bir IR geninin birçok hücrede düşük bir şekilde eksprese edilmesi olabilir. Bu nedenle RPKM değerleri, bir nöron içindeki bir IR'nin bolluk seviyesine karşılık gelmeyebilir. Ek olarak, HCR yöntemi tarafından sağlanan sinyal amplifikasyonu, floresan sinyallere dayalı nöronal transkript seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için bu yöntemin kullanılmasını da zorlaştırabilir. Son yayınımız bu kavramları daha ayrıntılı olarak tartıştı5. Veriler, HCR WM-FISH'in Şekil 2'de gösterildiği gibi anten dokularından mRNA transkriptlerini tespit etmeye oldukça duyarlı olduğunu göstermektedir.
Kemosensoriyel eklerde farklı RNA hedeflerinin çoğullanmış birlikte etiketlenmesi
RNA hedeflerinin birlikte lokalizasyonunu incelemek için, farklı floroforlara konjuge problar ürettik. Koku reseptörü ko-reseptör geninin (Orco) ve en geniş şekilde eksprese edilen iyonotropik reseptör ko-reseptör geninin (Ir25a) transkriptlerini hedefleyen çift in situ hibridizasyon, bu farklı kemosensör reseptör ailelerinin antendeki hücre popülasyonlarının bir alt kümesinde (Şekil 3A) ve maksiller palp'ta (Şekil 3B) birlikte lokalizasyonunu ortaya çıkardı. Ayrıca üç IR-koreseptör geninin (Ir8a, Ir25a ve Ir76b) transkriptlerinin kolokalizasyonunu araştırdık. Kolokalizasyon paternleri, Ir76b-pozitif hücrelerin Ir25a'yı eksprese ettiğini, Ir8a-pozitif hücrelerin ise Ir76b ve Ir25a ile kısmen birlikte lokalize olduğunu göstermektedir (Şekil 4). IR-koreseptörlerinin birlikte ekspresyon analizi, çoğullanmış çalışmalar için HCR WM-FISH kullanımının sağlamlığını göstermektedir.
Şekil 1: İn situ hibridizasyon zincir reaksiyonunun şeması. Bu yöntem iki adımda çalışır: algılama ve amplifikasyon. İn situ hibridizasyon zincir reaksiyonu için bir prob seti, bir bölünmüş başlatıcı ve RNA hedefine özgü bir nükleik asit dizisi içerir. RNA hedefindeki birkaç bölgeyi hibritleştirmek için birden fazla prob seti çifti tasarlanabilir; Bu, algılama adımını tanımlar. Amplifikasyon adımı, florofor etiketli saç tokalarının (h1 ve h2) bir prob setine konjuge edilmiş başlatıcıya spesifik olarak bağlanmasını gerektirir. Bağlanma üzerine, florofor tarafından etiketlenen RNA sinyali, florofor etiketli saç tokalarının tekrar tekrar bağlanmasıyla amplifiye edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: IR kemosensoriyel genlerinin RNA lokalizasyonu. IR'leri hedeflemek için dişi Anopheles coluzzii antenlerinin HCR WM-FISH'i. RNA probları arasında (A) IR41t.1, (B) IR75d, (C) IR7t ve (D) IR64a bulunur. Beyaz kesikli kutulardaki iç kısımlar, dokudan büyütülmüş görüntülerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Anten ve maksiller palp'ta kemosensoriyel genlerin çift in situ birlikte lokalizasyonu. Dişi Anopheles coluzzii sivrisineklerinin (A) anteninde ve (B) maksiller palpında Ir25a (yeşil) ve Orco (macenta) eksprese eden hücrelerin konfokal Z-yığını görüntüleri. Beyaz kesikli kutulardaki iç kısımlar, dokudan büyütülmüş görüntülerdir. Ölçek 10 μm'dir. Şekil 3B,15'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Birden fazla RNA hedefinin uzamsal kolokalizasyonunun haritalanması. Sivrisinek anteninde IR25a (macenta), IR8a (yeşil) ve IR76b (mavi) olmak üzere üç IR koreseptörünün kolokalizasyon modellerini gösteren yerinde görüntüler. Beyaz oklar, üç IR koreseptörünü (IR25a, IR8a ve IR76b) ifade eden hücrelere işaret eder. Ölçek 20 μm'dir. Bu rakam5'ten değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: İn situ hibridizasyon zincir reaksiyonu için reaktifler. Hibridizasyon zincir reaksiyonu tam montajlı floresan in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için gerekli reaktifler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR), birkaç RNA hedefini görselleştirme konusundaki duyarlılığı ve sağlamlığı ile dikkat çekicidir8. HCR WM-FISH, Drosophila, tavuk, fare ve zebra balığı embriyolarının yanı sıra nematod ve zebra balığılarvalarında başarıyla kullanılmıştır 10,16,17. Sivrisinek antenleri ve maksiller palplar tipik olarak yüksek otofloresan ve zayıf prob penetrasyonuna eğilimlidir ve bunlar geleneksel tam montajlı in situ yöntemler yürütülürken özellikle zordur. Bu dezavantajlar, sinyal-arka plan oranını iyileştiren ve koku alma kemoreseptörü mRNA transkriptlerinin saptanmasına izin veren HCR protokolüne entegre edilmiş sinyal amplifikasyon adımı ile azaltılmıştır (Şekil 2). HCR protokol tasarımı, başlatıcı probların amplifikasyon polimerlerine bağlanmasını sağlar, bu da RNA hedeflerinin düşük sinyalle görüntülenmesine izin verir. Çoğullanmış kurulumda, farklı ortogonal HCR amplifikatörleri, spektral olarak benzersiz floroforlara bağlandı. Bu yaklaşım, komşu bir görüntüleme kanalından spektral sızıntıyı önlemek için kritikti.
HCR yöntemini sivrisinek uzantıları ile kullanım için optimize etmek için birkaç gözlem yaptık. HCR amplifikatörleri ışığa duyarlıdır ve her zaman -20 ° C'lik bir dondurucuda bir kutuda saklanmalıdır. Deneyimlerimize göre, dokuların CCD tamponu, proteinaz K içinde geniş inkübasyonu veya paraformaldehitte kısa fiksasyon süresi, yıkama adımları sırasında antenlerin veya avuç içlerinin kırılmasına neden olabilir. Antenler ve maksiller palplar da kırılmayı önlemek için her zaman tabandan tutulmalıdır. Bu protokolü uyarlamanın ilk aşamasında, bir dizi tampon değişimi sırasında sürekli olarak doku kaybettik (adım 5 ve 6). Bu kayıpları en aza indirmek için deneyin başlangıcında doku sayısı iki katına çıkarılmış, mikroskop altında yıkama adımları ve tampon değişimleri gerçekleştirilmiş ve tamponları dokulardan uzaklaştırmak için 0,5 mm'den daha geniş olmayan jel yükleme uçları kullanılmıştır.
HCR WM-FISH, Anopheles gambiae 5,15 ve Aedes aegypti 4,18 sivrisinek vektörlerinin periferik koku uzantılarında başarılı olmuştur ve protokol daha da optimize edilebilir ve diğer böcek dokusu parçalarına veya farklı hayvanlara uyarlanabilir. Üretici tarafından tasarlanan orijinal protokol, CCD tamponunda inkübasyonu içermez. Bu adım, kitinöz kütikülü sindirmek ve geçirgen hale getirmek için protokole entegre edildi. Prob penetrasyonu için daha fazla zaman vermek için prob setlerindeki inkübasyon süresini iki gece uzattık, bu da üreticinin bir slayttaki jenerik numuneler için iyi çalışan 16 saatlik bir inkübasyon süresi öneren bir modifikasyonudur. Bu protokolün diğer böcek dokusu parçaları için optimizasyonu, CCD tamponundaki inkübasyon süresinin değiştirilmesini gerektirecektir; Kalın kütiküllere sahip periferik doku parçaları muhtemelen daha uzun inkübasyon süresi gerektirecektir. Proteinaz K konsantrasyonu, bu protokolü hayvanların farklı doku veya gelişim aşamaları için uyarlarken deneysel olarak da ayarlanmalıdır. 5 mm'den daha kalın dokularla çalışırken, prob penetrasyonu zorlaşır. Böyle bir durumda, doku kriyoseksiyonu yapmak veya bu çalışmada açıklanan protokolü daha da değiştirmek için ek çabalara ihtiyaç vardır.
HCR WM-FISH, potansiyel olarak binlerce genin aynı anda görüntülenmesine izin verebilecek uzamsal transkriptomiklere kıyasla bir seferde yalnızca birkaç gen hedefini aynı anda görselleştirmekle sınırlıdır19. RNA problarının ticari sentezi pahalıdır; Alternatif, probları ve amplifikatörleri laboratuvarda üretmek olabilir, ancak bu çoğu grup için zor olabilir ve emek yoğun ve zaman alıcıdır. Bu protokol aynı zamanda, protokolde değişiklikler (örneğin, adım 2 doku hazırlığı) veya sağlam dokunun kesit alınmasını gerektirebilen, tam montajlı kalın numunelerden RNA probu penetrasyonunun karşılaştığı zorluklarla da sınırlıdır. Burada tarif edilen HCR WM-FISH yöntemi, bir koku ekinde bir RNA transkripti tespit edemezse, gen sadece birkaç hücrede eksprese edilebilir ve dokunun kapsamlı bir şekilde araştırılmasını gerektirebilir, muhtemelen kopyalanmamış olabilir veya bu yöntemin saptama sınırının altında bir seviyede kopyalanabilir. Bu tür bulguları doğrulamak için kantitatif RT-PCR veya RNA dizilimi gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Margo Herre ve Leslie Vosshall laboratuvarına, Aedes aegypti koku uzantıları için yerinde hibridizasyon protokollerini paylaştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden C.J.P.'ye (NIAID R01Al137078), HHMI Hanna Gray'in JIR'a bursu, JIR'ye Johns Hopkins Doktora Sonrası Hızlandırıcı Ödülü ve Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü Doktora Sonrası Bursu'na verilen hibelerle desteklenmiştir. Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü ve Bloomberg Philanthropies'e destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al.
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al.
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
