Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Effektiv generering af murine kimære antigenreceptorceller (CAR)-T-celler

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

Denne protokol strømliner retroviral vektorproduktion og murine T-celletransduktion, hvilket letter effektiv generering af muse-CAR-T-celler.

Abstract

Konstruerede celleterapier ved hjælp af kimære antigenreceptorceller (CAR)-T-celler har opnået bemærkelsesværdig effektivitet hos personer med hæmatologiske maligniteter og er i øjeblikket under udvikling til behandling af forskellige faste tumorer. Indtil videre har den foreløbige evaluering af nye CAR-T-celleprodukter overvejende fundet sted i xenografttumormodeller ved hjælp af immundefekte mus. Denne tilgang er valgt for at lette en vellykket indgravering af humane CAR-T-celler i forsøgsmiljøet. Imidlertid tillader syngeneiske musemodeller, hvor tumorer og CAR-T-celler stammer fra den samme musestamme, evaluering af nye CAR-teknologier i forbindelse med et funktionelt immunsystem og omfattende tumormikromiljø (TME). Protokollen beskrevet her sigter mod at strømline processen med muse-CAR-T-cellegenerering ved at præsentere standardiserede metoder til retroviral transduktion og ex vivo T-cellekultur. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes på andre CAR-konstruktioner ud over dem, der anvendes i denne undersøgelse, for at muliggøre rutinemæssig evaluering af nye CAR-teknologier i immunkompetente systemer.

Introduction

Adoptive T-celleterapier, der udtrykker kimære antigenreceptorer (CAR'er), har revolutioneret kræftimmunterapiområdet ved at udnytte kraften i det adaptive immunsystem til specifikt at målrette og eliminere antigenpositive kræftceller1. Mens succesen med CAR-T-celleterapier rettet mod B-cellemaligniteter er blevet klinisk valideret, er prækliniske undersøgelser udført i dyremodeller fortsat afgørende for udviklingen af nye CAR'er rettet mod solide tumorer. Imidlertid er begrænset klinisk effekt hidtil blevet påvist i solide tumorindikationer, og det bliver stadig mere tydeligt, at individuelle prækliniske modeller ikke nøjagtigt forudsiger farmakodynamikken og den kliniske effekt af et levende lægemiddel 2,3. Derfor er forskere begyndt at udvide den prækliniske undersøgelse af CAR-T-celleprodukter til at omfatte parallelle vurderinger i xenograft og syngeneic modeller af henholdsvis human og murine kræft.

I modsætning til xenograftmodeller, hvor humane tumorer og T-celler er indpodet i immundefekte mus, muliggør syngeneiske modeller undersøgelse af CAR-T-celleresponser i forbindelse med et funktionelt immunsystem. Specifikt giver immunkompetente mus med syngeneiske tumorer et system til at studere interaktionen mellem adoptivt overførte T-celler og kontekstspecifikke miljøer - herunder tumorassocierede makrofager (TAM'er) og regulatoriske T-celler (Tregs), der vides at undertrykke T-cellefunktion i tumormikromiljøet (TME)4,5,6. Desuden tilbyder syngeneiske modeller en yderligere platform til vurdering af on-target, off-tumor toksicitet og CAR-T-celleinteraktion med værtsfaktorer, der kan føre til yderligere toksiciteter, herunder cytokinfrigivelsessyndrom7.

På trods af disse fordele er antallet af syngeneiske CAR-T-celleundersøgelser fortsat begrænset. Især kræver syngeneiske modeller autolog konstruktion af CAR-T-celler fra den samme musestamme og udgør derfor en yderligere udfordring på grund af manglen på metode til effektiv murine T-celletransduktion og ex vivo-ekspansion 2,8. Denne protokol skitserer metoderne til at opnå stabil CAR-ekspression gennem produktion af retrovirale vektorer og optimeret T-celletransduktion. Et skema over hele processen er vist i figur 1. Anvendelsen af denne fremgangsmåde demonstrerer effektiv retroviral transduktion af murin CAR-T-celler og opnåelse af høj CAR-ekspression uden behov for viral koncentration gennem ultracentrifugering. Strategier til ændring af antigenspecificiteten af CAR-konstruktionen diskuteres ud over co-ekspressionen af yderligere transgener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protokollerne AC-AABQ5551 og AC-AAAZ4470) med 6-8 uger gamle kvindelige BALB / c eller CF57BL / 6 mus, der vejer mellem 20-25 g. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Denne protokol er struktureret omkring 'dage efter aktivering' af murine T-celler, og viral produktion begynder på dag -2. Retrovirus kan opbevares ved -80 °C efter indledende produktion, og til fremtidig brug af denne protokol kan man begynde med trin 2, T-celleisolering og aktivering på dag 0.

1. Retroviral vektorproduktion

BEMÆRK: De virale produkter er gjort replikationsdefekte ved adskillelse af emballagegenerne i to separate plasmider (se materialetabel), hvilket i høj grad reducerer sandsynligheden for rekombinationshændelser og utilsigtet produktion af replikationskompetent virus.

  1. Forbered Phoenix Eco-celler en dag før transfektion (dag -2-procedure).
    1. Plade ca. 1 x 107 celler i en 15 cm TC-behandlet plade eller T150-dyrkningskolbe med 30 ml dyrkningsmedium (Phoenix Eco-kulturmedium, som vist i tabel 1).
    2. Der inkuberes natten over ved 37 °C. Efter 18-24 timer skal cellerne være ca. 70% sammenflydende og jævnt fordelt for at sikre et højt virusudbytte uden tilgroning.
      BEMÆRK: For optimale resultater skal du bruge celler med lav passage og passere dem dagen før plettering til viral produktion. Lad ikke Phoenix Eco-celler vokse under rutinemæssig kultur.
  2. Forbered transfektionsblandingen indeholdende lipofektions- og forstærkerreagenser, pCL-Eco (Gag / Pol) og pMSCV-ekspressionsplasmid (pMSCV_PGK_mGFP28z) i reducerede serummedier (se materialetabel) (dag -1-procedure).
    BEMÆRK: Co-transfektion skal udføres i forholdet 1:1 mellem pMSCV og pCL-Eco.
    1. Forbered rør A: Fortynd 105 μL transfektionsreagenset i 3,75 ml reduceret serummedium pr. 15 cm plade og bland grundigt ved hvirvelstrøm eller pipettering op og ned.
    2. Forbered rør B: Fortynd pMSCV-ekspressionsplasmid (21 μg) og pCL-Eco (21 μg) med 90 μL forstærkerreagens til 3,75 ml reduceret serummedium pr. 15 cm plade. Bland godt ved pipettering op og ned.
      BEMÆRK: Hvis du genererer flere virale produkter, skal du oprette en masterblanding, der indeholder pCL-Eco og forstærkerreagenset.
    3. Tilsæt rør A til rør B og bland grundigt ved pipettering. Inkuber i 10-20 minutter ved stuetemperatur, hvilket resulterer i et samlet volumen på ca. 7,5 ml.
    4. Fjern forsigtigt 10 ml cellekulturmedier fra Phoenix Eco-pladen/-pladerne, og tilsæt hele volumenet af transfektionsblandingen til det resterende medie ved at vippe pladen og pipettere dråbevis. Cellerne sættes tilbage i en inkubator på 37 °C.
  3. Skift mediet på transfekterede Phoenix Eco-celler 16-20 timer efter transfektion (dag 0-procedure).
    1. Forvarmt serum og β-mercaptoethanol (2-ME, se materialetabel)-frit murin T-cellemedium (mTCM-viral høst, som anført i tabel 1) til 37 °C ved hjælp af et vand- eller perlebad.
    2. Fjern forsigtigt Phoenix Eco-kulturmediet ved at vippe pladen og placere pipettespidsen i nederste hjørne, om muligt ved hjælp af vakuum. Undgå overtørring af cellerne.
    3. Tilsæt forsigtigt det opvarmede mTCM-virale høstmedium til siden af den vippede plade ved at pipettere 30 ml på den langsomste indstilling. Cellerne sættes tilbage i en inkubator på 37 °C.
      BEMÆRK: Dette trin kan få Phoenix Eco-celler til at løsne sig fra pladen og reducere virale titere. Forvarmede medier og skånsom pipettering minimerer forstyrrelser.
  4. Virussupernatanten høstes 48 timer efter transfektion (dag 1-proceduren).
    1. Høst den virale supernatant og filtrer den gennem 0,45 μm PVDF-filtre (se materialetabellen) for at fjerne celler og snavs. Alikvote og frys virussen ved -80 °C eller fortsæt direkte til dag 1 i trin 3, hvis der anvendes frisk virus.
    2. Den virale titer (transduceringsenheder/ml) bestemmes ved flowcytometri, som tidligere beskrevet9. Dette trin er valgfrit.
      1. Virustiteren bestemmes ved transduktion i lille skala af 1 x 105 aktiverede murin T-celler i ikke-vævskultur (TC)-behandlede plader med 96 huller, præbelagt med retronectin (se materialetabel) og fyldt med trefoldige serielle fortyndinger af retroviral supernatant i et slutvolumen på 100 μL mTCM-viralt høstmedium.
        BEMÆRK: Se trin 2 og trin 3 nedenfor for detaljerede instruktioner om T-celleisolering, aktivering og transduktion.
      2. Bestem CAR-overfladeekspression 4-5 dage efter transduktion ved flowcytometri.
      3. Beregn den virale titer i henhold til formlen10: (N x F x D) / V, hvor N er antallet af transducerede celler, F er frekvensen af CAR-positive celler, D er fortyndingsfaktoren, og V er transduktionsvolumenet i ml for at opnå transduceringsenheder (TU) / ml.
        BEMÆRK: Viral titer kan falde ved frysning / optøning; Derfor bestemmes viral titer ideelt på frosset og efterfølgende optøet virus.

2. Isolering af murin T-celle

  1. Isoler og aktiver murin T-celler (dag 0-procedure).
    BEMÆRK: Disse trin kan udføres ved stuetemperatur (RT) eller 4 °C og skal udføres i et sterilt miljø.
    1. Milten/milten høstes fra den relevante musestamme (f.eks. Balb/c, C57BL/6) som tidligere beskrevet11 , og der opnås en enkeltcellesuspension gennem mekanisk dissociation.
    2. Brug bagsiden af en steril sprøjte til at knuse milten (e) gennem en 70-100 μm cellesil ind i et 50 ml konisk rør.
    3. Når sprøjten er sat til side, vaskes sien med 5 ml T-celleisolationsbuffer (fosfatbufret saltvand, PBS, suppleret med 2% føtalt bovint serum, FBS).
    4. Gentag mæskningstrinnet, og vask sien igen med 5 ml T-celleisoleringsbuffer. Bring det endelige volumen til 50 ml med T-celleisoleringsbuffer.
    5. Tæl levende celler ved hjælp af et manuelt hæmocytometer eller en automatisk celletæller ved fortynding i forholdet 1:20 og derefter blanding ved 1:1 med trypanblåt.
    6. Pellet cellerne ved centrifugering i 10 minutter ved 450 x g, ved 4 °C (eller RT), og genopslæm milten ved 1 x 108/ml, hvis du bruger det anbefalede T-celleisolationssæt (se materialetabel).
      BEMÆRK: Miltocytter kan genspændes gennem en 40-70 μm sil på dette stadium for at fjerne klumper.
  2. Isoler CD3+ T-celler ved negativ markering ved at følge producentens anvisninger (se materialetabellen). Efter magnetisk adskillelse overføres isolatet til et 15 ml konisk rør og udføres en endelig strømførende celletælling.
  3. De isolerede T-celler pelleteres ved centrifugering i 10 minutter ved 450 x g ved 4 °C (eller RT), og de opslæmmes igen ved 1 x 106/ml i mTCM-aktiveringsmediet (tabel 1).
  4. Aktivér T-celler ved at tilføje murine anti-CD3/anti-CD28 monoklonale antistofbelagte magnetiske perler (se materialetabel) i et forhold på 25 μL/1 x 106 T-celler og 100 U/ml IL-2.
  5. Anbring cellerne i en inkubator ved 37 °C og lad dem stå natten over.
    BEMÆRK: På grund af den lille størrelse af T-celler kan et mere nøjagtigt levende T-celletal opnås ved fortynding i forholdet 1: 10-1: 20 og blanding ved 1: 1 med trypanblåt til manuel tælling ved hjælp af et hæmocytometer. Renheden kan bestemmes ved flowcytometri ved farvning af celler med et fluorescerende konjugeret αCD3-antistof. Hver milt vil give mellem 7-10 x 106 T-celler afhængigt af musens alder og belastning.

3. Rensning af T-celle

  1. Forbered plader til transduktion (dag 0-procedure).
    1. Ikke-behandlede sterile plader med 24 huller forbelægges med 0,5 ml humant fibronectintransduktionsforstærkerreagens (se materialetabel) i en slutkoncentration på 20-40 μg/ml ved fortynding i steril PBS og opbevares ved 4 °C natten over.
      BEMÆRK: Dette trin kan også udføres på dag 1 ved at belægge ubehandlede plader med 24 brønde med transduktionsreagenset og inkubere dem ved stuetemperatur i 2 timer.
  2. Udfør T-celletransduktion (dag 1-procedure).
    1. Forbered den forcoatede plade til transduktion. Transduktionsreagenset fjernes fra hvert hul i den forcoatede plade med 24 huller og blok med et ækvivalent volumen sterilfiltreret PBS + 2 % bovint serumalbumin (BSA) (0,5 ml) i 30 minutter ved RT.
    2. Vask en gang med 0,5-1 ml PBS.
  3. Tilsæt 0,5-1 ml rent retrovirus fra trin 1 eller fortyndet baseret på viral titer til hvert forbelagt hul og centrifuger i 90 minutter ved 2.000 x g og 32 °C.
  4. Der tilsættes 1 ml aktiverede T-celler til hvert viralt belastet hul, og centrifugeres i 10 minutter ved 450 x g og 32 °C. Cellerne sættes tilbage i en inkubator på 37 °C natten over.
  5. 24 timer efter transduktion fjernes 1-1,5 ml cellekulturmedier og erstattes med 1-1,5 ml mTCM-komplet og 10 ng/ml rekombinant human IL-7 og IL-15 (se materialetabel). Cellerne sættes tilbage i en inkubator på 37 °C (dag 2-proceduren).
    BEMÆRK: Under ex vivo-kultur skal der tilsættes 10 ng / ml cytokiner til kulturen hver 48 timer, og T-celler bør ikke fortyndes ud over 1 x 106 / ml.
  6. 48 timer efter transduktion overføres celler fra transduktionspladen til en frisk plade med 24 huller eller 6 huller, og cellerne returneres til en inkubator med 37 °C (dag 3-proceduren).
    BEMÆRK: T-cellelevedygtigheden kan forbedres ved at overføre celler 24 timer til 2 dage efter transduktion, afhængigt af start af T-cellelevedygtighed og viral titer.
  7. Perle T-cellerne og bekræft CAR-ekspression (dag 5-6-proceduren).
    1. Cellerne suspenderes grundigt igen for at adskille aktiverede T-celler fra αCD3/CD28-belagte perler (se materialetabellen), og cellesuspensionen anbringes på en magnet i 30 sekunder. Cellesuspensionen overføres til den ønskede ex vivo-kulturbeholder og returneres til en 37 °C-inkubator.
      BEMÆRK: T-celler kan dyrkes i dyrkningskolber eller dybe brøndkulturplader. Det anbefales at plade mindst 5 x 106 T-celler i 30 ml mTCM-komplet medium pr. brønd i en dyb brønd i en 6-brønds formatplade (se materialetabel).
    2. Bestem CAR-ekspression ved flowcytometri8.
      BEMÆRK: GFP-CAR-ekspression blev bestemt ved inkubation med 100 ng/ml renset GFP. Inkorporering af et N-terminalt epitopmærke vil gøre det lettere at opdage alternative CAR-konstruktioner.
  8. Udfør ex vivo-dyrkning af CAR-T-celler (dag 7-10-proceduren).
    1. Under ex vivo-kultur vedligeholdes cellerne ved at fjerne 50% af dyrkningsmediet og erstatte det med frisk mTCM-komplet + 2x 10 ng / ml IL-7 og IL-15 hver 48 timer.
      BEMÆRK: Murin CAR-T-celler er klar til brug i downstream-applikationer 7 dage efter aktivering og bør ikke kryopræserveres på grund af dårlig levedygtighed efter optøning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet her sigter mod at standardisere processen med murine T-celletransduktion til generering af muse-CAR-T-celler. Figur 1 giver en detaljeret beskrivelse af de involverede trin. Processen begynder med produktion af retrovirale vektorer via co-transfektion af virale komponenter til Phoenix Eco-celler. Figur 2 giver et billede af den optimale tæthed af Phoenix Eco-celler på transfektionsdagen. Isolerede T-celler aktiveres derefter 24 timer efter transfektion eller 'dag 0' i denne protokol som forberedelse til transduktion på dag 1. Efter transduktion dyrkes CAR-T-celler i nærvær af rekombinant human IL-7 og IL-15 for at opnå tilstrækkelig foldudvidelse, samtidig med at stamcellehukommelsespopulationer bevares.

Brugen af det anbefalede murine T-celleisoleringssæt (se materialetabel) med denne protokol giver T-cellerenheder på <98% før transduktion, bestemt ved flowcytometri (figur 3A). Desuden kan reproducerbare CAR-ekspressionshastigheder på 65%-75% opnås ved hjælp af denne protokol, og den retrovirale pMSCV-vektor modificeres til at udtrykke CAR-konstruktionen fra en PGK-promotor (figur 3B,C). Bestemmelse af retroviral titer afslører titere på op til ~2 x 107 TU/ml og CAR-ekspression på 74% med 1/3rd af den virale supernatant høstet efter co-transfektion af pMSCV med pCL-Eco (supplerende figur 1).

Endelig fører ex vivo-kultur med 10 ng / ml IL-7 og IL-15 til ca. 15 gange ekspansion, hvilket resulterer i ~ 150 x 106 T-celler ved dag 10 efter aktivering fra en enkelt milt (figur 3D). Kultur med IL-7 og IL-15 fører til sammenlignelige CD8+ og CD4+ T-cellefrekvenser (figur 3E) og bevarede stamcellehukommelsespopulationer bestemt ved CD62L+CD44-ekspression efter 10 dages ex vivo-kultur (figur 3F).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokol. Toppanel: En skematisk oversigt over protokollens tidslinje. Bundpanel: Trin-for-trin instruktioner til retroviral vektorproduktion og mus T-celletransduktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Optimal celletæthed til transfektion. Brightfield mikroskopi billede af Phoenix Eco celler ved den optimale tæthed før transfektion med pMSCV og pCL-Eco. Optaget ved hjælp af et 10x objektiv. Skalabjælke = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Produktion af CAR-T-celler i murin og ex vivo-kultur. (A) Flowcytometriplot, der viser hyppigheden af BALB/c CD3+-celler efter murin T-celleisolering. (B) Skematisk repræsentation af den retrovirale pMSCV-vektor, der anvendes til GFP-CAR-ekspression i murine T-celler. C) Flowcytometrihistogrammer, der viser CAR-overfladeekspression på muse-T-celler efter inkubation med renset sfGFP. UT, utransduced. (D) Fold udvidelse af CAR-T-celler på dag 10 efter aktivering og dyrkning med rekombinant human IL-17 og IL-15. Ca. 8 x 106 murine T-celler blev aktiveret før transduktion og nåede ca. 1,28 x 108 på dag 10 efter aktivering. (E) Flowcytometriplot, der viser frekvensen af CD8+ og CD4+ CAR-T-celler på dag 10 efter aktivering. (F) Flowcytometriplot, der viser frekvensen af CD8+ T-cellehukommelsespopulationer bestemt ved CD62L- og CD44-overfladeekspression. Stamcellehukommelse (TSCM) er kendetegnet ved CD62L + CD44-, central hukommelse (TCM) ved CD62L + CD44 + og effektorhukommelse (TEM) ved CD62L-CD44 +. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Formulering af cellekulturmedier. Formuleringsdetaljerne for cellekulturmedier, der anvendes i protokollen. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: CAR-overfladeekspression og retrovirale titere. (A) Flowcytometrihistogrammer, der viser CAR-overfladeekspression på BALB/c T-celler efter inkubation med renset sfGFP. Retrovirus blev genereret ved transfektering af Phoenix Eco-celler med pMSCV_PGK_mGFP28z i kombination med pCL-Eco og pMD2.G (I), pCL-Eco (II) eller alene (III). T-celler blev transduceret med fortyndet retrovirus som angivet. B) Retrovirale titere bestemt ved CAR-overfladeekspression af transducerede T-celler. Transduceringsenheder (TU) / ml blev beregnet ved hjælp af formlen: (N∙F∙D) / V, hvor N er antallet af transducerede celler (1 x 105), F er frekvensen af CAR + celler, D er fortyndingsfaktoren, og V er transduktionsvolumenet i ml (0,2 ml). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: pMSCV-ekspressionsvektorsekvens. Sekvensen af GFP28z CAR og flankerende sekvenser (kursiv) i pMSCV-ekspressionsvektoren med NotI- og BamHI-enzymsteder fremhævet med blåt. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver de trin og reagenser, der er nødvendige for retroviral transduktion af murine T-celler til generering af CAR-T-celler til in vivo-undersøgelser . Optimering af retrovirale transduktionsbetingelser opnår robust CAR-ekspression uden behov for viral koncentration gennem ultracentrifugering eller yderligere reagenser. Der er dog flere ændringer, der kan anvendes på denne metode.

Mens denne protokol beskriver eksempelgenerering af en GFP-specifik CAR, kan disse metoder tilpasses til at generere muse-CAR-T-celler, der er målrettet mod ethvert ekstracellulært antigen af interesse. Den pMSCV_PGK retrovirale vektor, der anvendes i denne undersøgelse, muliggør effektiv frigivelse af den GFP-specifikke nanobodysekvens ved enzymatisk fordøjelse med NotI og BamHI og kan erstattes med et brugerdefineret antigengenkendelsesdomæne såsom et scFv, nanobody eller ligandbindende domæne (supplerende fil 1). For at lette vurderingen af alternative CAR-udtryk anbefales det at designe CAR'er med et N-terminalt epitopmærke, såsom Myc (EQKLISEEDL) eller Flag (DYKDDDDK) tags, som kan detekteres ved hjælp af fluorescerende konjugerede antistoffer12. Desuden viser den aktuelle undersøgelse produktionen af et enkelt transgen; inkorporering af selvspaltende peptider (2A-sekvenser) eller interne ribosomindgangssteder (IRES) ville imidlertid muliggøre samproduktion af flere transgener, herunder yderligere teknologier til forbedring af T-cellefunktionen in vivo 8,13,14.

Selvom denne protokol blev udviklet for at eliminere behovet for specialudstyr ved at udelade ultracentrifugering (24.000 x g, 2 timer, 4 °C), er det værd at bemærke, at koncentrationen af viral supernatant kan opnå højere virale titere og reducere den mængde virus, der kræves for at opnå høj CAR-ekspression8. Denne protokol strømliner desuden retroviral vektorproduktion ved at opnå reproducerbart høje virale titere (~ 2 x 107 TU / ml) og stabil CAR-ekspression uden behov for viral titerbestemmelse før brug. Ud over at lette standardisering kan bestemmelse af viral titer før T-celletransduktion imidlertid også øge T-cellelevedygtigheden ved at reducere potentiel toksicitet forårsaget af unødigt høje virale koncentrationer10,15.

Tilskud med IL-7 og IL-15 anbefales at fremme T-celleudvidelse og bevare T-cellehukommelsespopulationer; rekombinant humant IL-2 kan dog anvendes som et alternativ til at reducere antallet af nødvendige reagenser til ex vivo-dyrkning 16,17,18,19. Ikke desto mindre er metoderne til CAR-T-cellegenerering, der er skitseret her, fortsat begrænset af den relativt dårlige udvidelse af murin T-celler. Imidlertid kan de foranstaltninger til forbedring af T-cellelevedygtigheden, der er diskuteret ovenfor, forbedres yderligere ved at inkludere yderligere kosttilskud og 2-ME i mTCM-kulturmediet gennem hele transduktionsprocessen20. Selvom disse ændringer kan forbedre T-celleudvidelsen fra 15 gange til op til 20 gange20, kan de resultere i lavere transduktionseffektivitet og reduceret CAR-ekspression.

I sidste ende muliggør produktionen af murin CAR-T-celler udviklingen af syngeneiske modeller til evaluering af CAR-T-cellefunktion i et intakt immunsystem - hvilket letter en kontekstspecifik vurdering af deres styrke, holdbarhed og sikkerhed. Mens modeller i immundefekte mus giver mulighed for vigtige prækliniske undersøgelser af et humant T-celleprodukt rettet mod et humant tumorantigen. Kombinationen af disse komplementære modelsystemer vil være uundværlig for at forstå kompleksiteten af CAR-T-cellebiologi, optimere nye CAR-design og i sidste ende omsætte prækliniske fund til effektive kliniske terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen erklærede interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker L. Brockmann for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af NIH 1R01EB030352 og UL1 TR001873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 204
Effektiv generering af murine kimære antigenreceptorceller (CAR)-T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vincent, R. L., Li, F., Ballister,… More

Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter