Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.
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Methodenartikel
Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Technisch hergestellte Zelltherapien, die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen verwenden, haben eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei Personen mit hämatologischen Malignomen erreicht und befinden sich derzeit in der Entwicklung für die Behandlung verschiedener solider Tumoren. Bisher erfolgte die vorläufige Evaluierung neuartiger CAR-T-Zellprodukte überwiegend in Xenograft-Tumormodellen mit immundefizienten Mäusen. Dieser Ansatz wurde gewählt, um die erfolgreiche Transplantation von humanen CAR-T-Zellen in der experimentellen Umgebung zu erleichtern. Syngene Mausmodelle, in denen Tumore und CAR-T-Zellen vom selben Mausstamm abstammen, erlauben jedoch die Evaluierung neuer CAR-Technologien im Kontext eines funktionierenden Immunsystems und einer umfassenden Tumormikroumgebung (TME). Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der Generierung von CAR-T-Zellen in der Maus zu rationalisieren, indem standardisierte Methoden für die retrovirale Transduktion und die ex vivo T-Zellkultur vorgestellt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte als die in dieser Studie verwendeten angewendet werden, um eine routinemäßige Evaluierung neuer CAR-Technologien in immunkompetenten Systemen zu ermöglichen.
Einleitung
Adoptive T-Zell-Therapien, die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, haben das Gebiet der Krebsimmuntherapie revolutioniert, indem sie die Kraft des adaptiven Immunsystems nutzen, um antigenpositive Krebszellen spezifisch anzuvisieren und zu eliminieren1. Während der Erfolg von CAR-T-Zelltherapien, die auf maligne B-Zell-Erkrankungen abzielen, klinisch validiert wurde, sind präklinische Studien, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, für die Entwicklung neuer CARs, die auf solide Tumore abzielen, nach wie vor von entscheidender Bedeutung. Bisher konnte jedoch nur eine begrenzte klinische Wirksamkeit bei soliden T....
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Protokoll
Alle Tierbehandlungen wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, Protokolle AC-AABQ5551 und AC-AAAZ4470) mit 6-8 Wochen alten weiblichen BALB/c- oder CF57BL/6-Mäusen mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g durchgeführt. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Dieses Protokoll ist um die "Tage nach der Aktivierung" der murinen T-Zellen herum strukturiert, und die Virusproduktion beginnt am Tag -2. Das Retrovirus kann nach der ersten Produktion bei -80 °C gelagert werden, und für die zukünftige Verwendung dieses Protokolls kann man mit Schritt 2, der Isolierung und Aktiv....
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Ergebnisse
Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, den Prozess der murinen T-Zell-Transduktion für die Generierung von CAR-T-Zellen der Maus zu standardisieren. Abbildung 1 enthält eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte. Der Prozess beginnt mit der Produktion retroviraler Vektoren durch Co-Transfektion von viralen Komponenten in Phoenix Eco-Zellen. Abbildung 2 zeigt die optimale Dichte der Phoenix Eco-Zellen am Tag der Transfektion. Isolier.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Reagenzien, die für die retrovirale Transduktion von murinen T-Zellen zur Generierung von CAR-T-Zellen für In-vivo-Studien erforderlich sind. Durch die Optimierung der retroviralen Transduktionsbedingungen wird eine robuste CAR-Expression erreicht, ohne dass eine Viruskonzentration durch Ultrazentrifugation oder zusätzliche Reagenzien erforderlich ist. Es gibt jedoch mehrere Modifikationen, die auf diese Methodik angewendet werden können.
W.......
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Offenlegungen
Es wurden keine Interessenkonflikte deklariert.
Danksagungen
Wir danken L. Brockmann für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch NIH 1R01EB030352 und UL1 TR001873 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Filter | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL Spritze | Fisher Wissenschaftlich | 14-955-450 | |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Fisher Wissenschaftlich | 05-408-135 | |
| 10 mL Spritze | BD | 14-823-16E | |
| 100 μ m Sieb | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC behandelte Zellkulturschalen | ThermoFisher Scientific | ||
| konische 15-ml-Röhrchen | Falke | 14-959-70C | |
| 40 Zoll m Sieb | Corning | 07-201-430 | |
| konische 50-ml-Röhrchen | Falke | 14-959-49A | |
| 70 Zoll m Sieb | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Durchflusszytometer | ThermoFisher Wissenschaftlich | ||
| BALB/C, 6-8 Wochen alt | Jackson Labor | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Rinderserumalbumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), ohne Calcium und Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Maus T-Zell-Isolationskit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS-Puffer | BD | BDB554657 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES-Puffer-Lösung | Gibco | 15-630-080 | |
| Humane rekombinante IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Humane rekombinante IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Humane rekombinante IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren | Gibco | 11140-050 | |
| Maus Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Maus Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Maus Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Maus Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Maus Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Maus Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 mit Prime 95B Kamera | Nikon | ||
| Unbehandelte 24-Well-Platten | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgen | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Lösung | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco Zellen | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgen | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produziert von R.LV. | |
| Gereinigtes sfGFP | N/A | Hergestellt von R.LV. | |
| RetroNectin ("Transduktionsreagenz") | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serologische Pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serologische Pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serologische Pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-behandelte 24-Well-Platten | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blau | Gibco | 15-250-061 |
Referenzen
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen,....
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Nachdrucke und Genehmigungen
