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Bioengineering

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells को कुशल उत्पादन

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

यह प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल वेक्टर उत्पादन और murine टी सेल पारगमन को सुव्यवस्थित करता है, माउस CAR-T कोशिकाओं की कुशल पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है।

Abstract

काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) -टी कोशिकाओं का उपयोग करने वाले इंजीनियर सेल थेरेपी ने हेमटोलॉजिकल विकृतियों वाले व्यक्तियों में उल्लेखनीय प्रभावशीलता हासिल की है और वर्तमान में विविध ठोस ट्यूमर के उपचार के लिए विकास के दौर से गुजर रहे हैं। अब तक, उपन्यास CAR-T सेल उत्पादों का प्रारंभिक मूल्यांकन मुख्य रूप से इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों का उपयोग करके xenograft ट्यूमर मॉडल में हुआ है। इस दृष्टिकोण प्रयोगात्मक सेटिंग में मानव CAR-T कोशिकाओं के सफल engraftment की सुविधा के लिए चुना जाता है. हालांकि, सिनजेनिक माउस मॉडल, जिसमें ट्यूमर और सीएआर-टी कोशिकाएं एक ही माउस तनाव से प्राप्त होती हैं, एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली और व्यापक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के संदर्भ में नई सीएआर प्रौद्योगिकियों के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल पारगमन और पूर्व विवो टी सेल संस्कृति के लिए मानकीकृत तरीकों को पेश करके माउस CAR-T सेल पीढ़ी की प्रक्रिया को कारगर बनाने के उद्देश्य से है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को प्रतिरक्षा-सक्षम प्रणालियों में नई सीएआर प्रौद्योगिकियों के नियमित मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले लोगों से परे अन्य सीएआर निर्माणों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) को व्यक्त करने वाले दत्तक टी सेल थेरेपी ने विशेष रूप से एंटीजन-पॉजिटिवकैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने और खत्म करने के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की शक्ति का उपयोग करके कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। जबकि बी सेल दुर्दमताओं को लक्षित करने वाले सीएआर-टी सेल थेरेपी की सफलता को चिकित्सकीय रूप से मान्य किया गया है, पशु मॉडल में किए गए प्रीक्लिनिकल अध्ययन ठोस ट्यूमर को लक्षित करने वाले नए सीएआर के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, सीमित नैदानिक प्रभावकारिता ठोस ट्यूमर संकेत इस प्रकार अब तक में प्रदर्शन किया गया है, और यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि व्यक्तिगत preclinical मॉडल सही pharmacodynamics और एक जीवित दवा 2,3 की नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी नहीं करते. इसलिए, जांचकर्ताओं ने क्रमशः मानव और murine कैंसर के xenograft और syngeneic मॉडल में समानांतर आकलन शामिल करने के लिए CAR-T सेल उत्पादों के प्रीक्लिनिकल अध्ययन का विस्तार करना शुरू कर दिया है।

ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल के विपरीत, जहां मानव ट्यूमर और टी कोशिकाओं को इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में उकेरा जाता है, सिनजेनिक मॉडल एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली के संदर्भ में सीएआर-टी सेल प्रतिक्रियाओं की परीक्षा को सक्षम करते हैं। विशेष रूप से, प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों असर syngeneic ट्यूमर दत्तक स्थानांतरित टी कोशिकाओं और संदर्भ-विशिष्ट milieus के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान - ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम) और नियामक टी कोशिकाओं (Tregs) ट्यूमर microenvironment (टीएमई)4,5,6 में टी सेल समारोह को दबाने के लिए जाना जाता है. इसके अलावा, syngeneic मॉडल पर लक्ष्य का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त मंच की पेशकश, ऑफ-ट्यूमर विषाक्तता, और मेजबान कारकों है कि अतिरिक्त विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के साथ CAR-T सेल बातचीत, साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम7 सहित.

इन फायदों के बावजूद, syngeneic CAR-T सेल अध्ययन की संख्या सीमित रहती है। विशेष रूप से, syngeneic मॉडल एक ही माउस तनाव से CAR-T कोशिकाओं के ऑटोलॉगस इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है और इस प्रकार कुशल murine टी सेल पारगमन और पूर्व vivo विस्तार 2,8 के लिए कार्यप्रणाली की कमी के कारण एक अतिरिक्त चुनौती पेश करते हैं. यह प्रोटोकॉल रेट्रोवायरल वैक्टर के उत्पादन और अनुकूलित टी सेल पारगमन के माध्यम से स्थिर कार अभिव्यक्ति प्राप्त करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है। पूरी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 में दिखाया गया है. इस दृष्टिकोण का उपयोग murine CAR-T कोशिकाओं के कुशल रेट्रोवायरल पारगमन और ultracentrifugation के माध्यम से वायरल एकाग्रता की आवश्यकता के बिना उच्च कार अभिव्यक्ति की उपलब्धि को दर्शाता है। सीएआर निर्माण की एंटीजन-विशिष्टता को बदलने के लिए रणनीतियों पर अतिरिक्त ट्रांसजीन की सह-अभिव्यक्ति के अलावा चर्चा की जाती है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया (कोलंबिया विश्वविद्यालय, प्रोटोकॉल एसी AABQ5551 और एसी-AAAZ4470) 6-8 सप्ताह पुरानी महिला BALB / सी या CF57BL / 6 चूहों के बीच वजन 20-25 ग्राम. जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें)। यह प्रोटोकॉल murine टी कोशिकाओं के 'दिनों के बाद सक्रियण' के आसपास संरचित है, और वायरल उत्पादन दिन -2 पर शुरू होता है. रेट्रोवायरस प्रारंभिक उत्पादन के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और इस प्रोटोकॉल के भविष्य के उपयोग के लिए, एक चरण 2, टी सेल अलगाव और दिन 0 पर सक्रियण के साथ शुरू हो सकता है।

1. रेट्रोवायरल वेक्टर उत्पादन

नोट: वायरल उत्पादों को पैकेजिंग जीन को दो अलग-अलग प्लास्मिड ( सामग्री की तालिकादेखें) में अलग करके प्रतिकृति-दोषपूर्ण बना दिया गया है, जिससे पुनर्संयोजन घटनाओं की संभावना और प्रतिकृति-सक्षम वायरस के अनजाने उत्पादन की संभावना बहुत कम हो जाती है।

  1. अभिकर्मक (दिन -2 प्रक्रिया) से पहले एक दिन फीनिक्स इको कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. प्लेट लगभग 1 x 10एक 15 सेमी टीसी इलाज प्लेट या T150 संस्कृति फ्लास्क में 7 कोशिकाओं, संस्कृति माध्यम (फीनिक्स इको कल्चर माध्यम, तालिका 1 में विस्तृत के रूप में) के 30 एमएल का उपयोग कर.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं. 18-24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को लगभग 70% संगम और समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए ताकि अतिवृद्धि के बिना उच्च वायरल उपज सुनिश्चित हो सके।
      नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, कम मार्ग वाली कोशिकाओं का उपयोग करें और वायरल उत्पादन के लिए चढ़ाना से एक दिन पहले उन्हें पारित करें। फीनिक्स इको कोशिकाओं को नियमित संस्कृति के दौरान उगने की अनुमति न दें।
  2. कम सीरम मीडिया ( सामग्री की तालिकादेखें) (दिन -1 प्रक्रिया) में lipofection और बढ़ाने अभिकर्मकों, pCL-इको (Gag / पोल), और pMSCV अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (pMSCV_PGK_mGFP28z) युक्त अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें.
    नोट: सह-अभिकर्मक pMSCV और pCL-इको के 1:1 अनुपात में किया जाना चाहिए।
    1. ट्यूब ए तैयार करें: प्रति 15 सेमी प्लेट में कम सीरम माध्यम के 3.75 एमएल में अभिकर्मक अभिकर्मक के 105 माइक्रोन को पतला करें और भंवर या ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।
    2. ट्यूब बी तैयार करें: पीएमएससीवी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (21 माइक्रोग्राम) और पीसीएल-इको (21 माइक्रोग्राम) को 90 माइक्रोन बढ़ाने वाले अभिकर्मक के साथ 15 सेमी प्लेट प्रति सीरम माध्यम के 3.75 एमएल में पतला करें। ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: यदि कई वायरल उत्पाद उत्पन्न कर रहे हैं, तो पीसीएल-इको और बढ़ाने वाले अभिकर्मक युक्त एक मास्टर मिश्रण स्थापित करें।
    3. ट्यूब बी में ट्यूब ए जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं। कमरे के तापमान पर 10-20 मिनट के लिए सेते हैं, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 7.5 एमएल की कुल मात्रा होती है।
    4. ध्यान से फीनिक्स इको प्लेट (ओं) से सेल संस्कृति मीडिया के 10 एमएल को हटा दें और थाली झुकाव और dropwise pipetting द्वारा शेष मीडिया के लिए अभिकर्मक मिश्रण की पूरी मात्रा जोड़ें. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटाएं।
  3. ट्रांसफ़ेक्ट फीनिक्स इको कोशिकाओं पर मीडिया बदलें 16-20 घंटे अभिकर्मक के बाद (दिन 0 प्रक्रिया).
    1. प्री-वार्म सीरम और β-मर्कैप्टोथेनॉल (2-एमई, सामग्री की तालिका) देखें) -फ्री म्यूरिन टी सेल मीडियम (एमटीसीएम-वायरल हार्वेस्ट, जैसा कि तालिका 1 में सूचीबद्ध है) से 37 डिग्री सेल्सियस तक पानी या मनका स्नान का उपयोग करना।
    2. ध्यान से फीनिक्स इको संस्कृति माध्यम को हटा दें प्लेट झुकाव और नीचे कोने पर विंदुक टिप रखकर, यदि संभव हो तो एक वैक्यूम का उपयोग कर. कोशिकाओं को अधिक सुखाने से बचें।
    3. धीरे से गर्म mTCM-वायरल फसल मध्यम को सबसे धीमी सेटिंग पर 30 एमएल पाइप करके झुका हुआ प्लेट के किनारे पर जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटाएं।
      नोट: यह कदम फीनिक्स इको कोशिकाओं को प्लेट से अलग करने और वायरल टाइटर्स को कम करने का कारण बन सकता है। पूर्व-गर्म मीडिया और कोमल पाइपिंग व्यवधान को कम करेगा।
  4. वायरल सतह पर तैरनेवाला फसल 48 घंटे अभिकर्मक के बाद अभिकर्मक (दिन 1 प्रक्रिया).
    1. वायरल सतह पर तैरनेवाला फसल और कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए 0.45 माइक्रोन PVDF फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) के माध्यम से इसे छान. विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस पर वायरस फ्रीज या चरण 3 के दिन 1 के लिए सीधे आगे बढ़ना अगर ताजा वायरस का उपयोग.
    2. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा वायरल टिटर (ट्रांसड्यूसिंग यूनिट/एमएल) का निर्धारण करें, जैसा किपहले 9 वर्णित है। यह चरण वैकल्पिक है.
      1. गैर-ऊतक संस्कृति (टीसी) में 1 x 105 सक्रिय murine टी कोशिकाओं के छोटे पैमाने पर पारगमन द्वारा वायरल टिटर का निर्धारण करें-उपचारित 96-अच्छी प्लेटें, रेट्रोनेक्टिन के साथ पूर्व-लेपित ( सामग्री की तालिकादेखें) और एमटीसीएम-वायरल फसल माध्यम के 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में रेट्रोवायरल सुपरनेटेंट के तीन गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ भरी हुई।
        नोट: टी सेल अलगाव, सक्रियण और पारगमन पर विस्तृत निर्देशों के लिए नीचे चरण 2 और चरण 3 देखें।
      2. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा 4-5 दिनों के बाद पारगमन के बाद कार सतह अभिव्यक्ति निर्धारित करें।
      3. सूत्र10 के अनुसार वायरल टिटर की गणना करें: (एन एक्स एफ एक्स डी)/वी, जहां एन ट्रांसड्यूड कोशिकाओं की संख्या है, एफ सीएआर-पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति है, डी कमजोर पड़ने वाला कारक है, और वी ट्रांसड्यूसिंग इकाइयों (टीयू) / एमएल प्राप्त करने के लिए एमएल में पारगमन मात्रा है।
        नोट: वायरल टिटर फ्रीज/पिघलना पर कम हो सकता है; इसलिए, वायरल टिटर आदर्श रूप से जमे हुए और बाद में पिघले हुए वायरस पर निर्धारित किया जाता है।

2. Murine टी सेल अलगाव

  1. murine टी कोशिकाओं को अलग और सक्रिय करें (दिन 0 प्रक्रिया)।
    नोट: इन चरणों को कमरे के तापमान (आरटी) या 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जा सकता है और इसे बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए।
    1. ब्याज की माउस तनाव (जैसे, Balb/c, C57BL/6) से तिल्ली फसल (एस) के रूप में पहले11 वर्णित और यांत्रिक पृथक्करण के माध्यम से एक एकल सेल निलंबन प्राप्त.
    2. एक बाँझ सिरिंज के पीछे का प्रयोग, एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में एक 70-100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से तिल्ली (ओं) को कुचल.
    3. एक तरफ सिरिंज की स्थापना के बाद, टी सेल अलगाव बफर (फॉस्फेट बफर खारा, पीबीएस, 2% भ्रूण गोजातीय सीरम, FBS के साथ पूरक) के 5 एमएल के साथ झरनी धो लें.
    4. मैशिंग चरण दोहराएं और टी सेल अलगाव बफर के 5 एमएल के साथ एक बार फिर झरनी धो लें। टी सेल अलगाव बफर के साथ 50 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाओ.
    5. एक मैनुअल hemocytometer या एक 1:20 अनुपात में पतला और फिर trypan नीले रंग के साथ 1:1 पर मिश्रण द्वारा एक मैनुअल hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं की गणना.
    6. 4 डिग्री सेल्सियस (या आरटी) पर 450 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें, और अनुशंसित टी सेल अलगाव किट का उपयोग करते समय 1 x 108/एमएल पर प्लीनोसाइट्स को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: स्प्लीनोसाइट्स को गुच्छों को हटाने के लिए इस स्तर पर 40-70 माइक्रोन स्ट्रेनर के माध्यम से फिर से तनावपूर्ण किया जा सकता है।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए नकारात्मक चयन द्वारा CD3+ T कोशिकाओं को अलग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। चुंबकीय जुदाई के बाद, एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए अलग हस्तांतरण और एक अंतिम रहते सेल गिनती प्रदर्शन.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस (या आरटी) पर 450 x ग्राम पर 10 मिन के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पृथक टी कोशिकाओं को गोली दें, और एमटीसीएम-सक्रियण माध्यम (तालिका 1) में 1 एक्स 106/एमएल पर उन्हें फिर से निलंबित करें।
  4. 25 μL/1 x 106 T कोशिकाओं और 100 U/mL IL-2 के अनुपात में murine एंटी-CD3/एंटी-CD28 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-लेपित चुंबकीय मोती (सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर टी कोशिकाओं को सक्रिय करें।
  5. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखें और उन्हें रात भर छोड़ दें।
    नोट: टी कोशिकाओं के छोटे आकार के कारण, एक अधिक सटीक लाइव टी सेल गिनती 1:10-1:20 अनुपात में पतला करके और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मैनुअल गिनती के लिए ट्रिपैन ब्लू के साथ 1:1 पर मिलाकर प्राप्त की जा सकती है। फ्लोरोसेंटली संयुग्मित αCD3 एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को धुंधला करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता निर्धारित की जा सकती है। प्रत्येक तिल्ली उम्र और माउस के तनाव के आधार पर 7-10 x 106 टी कोशिकाओं के बीच उपज होगी.

3. Murine टी सेल पारगमन

  1. पारगमन के लिए प्लेटें तैयार करें (दिन 0 प्रक्रिया)।
    1. पूर्व-कोट गैर-उपचारित बाँझ 24-अच्छी प्लेटें 0.5 एमएल के साथ मानव फाइब्रोनेक्टिन ट्रांसडक्शन बढ़ाने वाले अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) 20-40 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता पर इसे बाँझ पीबीएस में पतला करके और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह कदम भी पारगमन अभिकर्मक के साथ गैर-इलाज 24-अच्छी प्लेटों कोटिंग और उन्हें 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करके दिन 1 पर किया जा सकता है।
  2. टी सेल पारगमन (दिन 1 प्रक्रिया) प्रदर्शन.
    1. पारगमन के लिए पूर्व लेपित थाली तैयार करें. आरटी पर 30 मिनट के लिए पूर्व-लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेट और बाँझ-फ़िल्टर किए गए पीबीएस + 2% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) (0.5 एमएल) के बराबर मात्रा के साथ ब्लॉक के प्रत्येक कुएं से पारगमन अभिकर्मक निकालें।
    2. पीबीएस के 0.5-1 एमएल के साथ एक बार धो लें।
  3. चरण 1 से साफ रेट्रोवायरस के 0.5-1 एमएल जोड़ें या वायरल टिटर के आधार पर प्रत्येक पूर्व-लेपित अच्छी तरह से पतला और 2,000 x ग्राम और 32 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  4. सक्रिय टी कोशिकाओं के 1 एमएल को प्रत्येक वायरल लोड अच्छी तरह से और 450 x ग्राम और 32 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए अपकेंद्रित्र जोड़ें। रातोंरात एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं लौटें.
  5. 24 घंटे के बाद पारगमन, सेल संस्कृति मीडिया के 1-1.5 एमएल को हटा दें और इसे एमटीसीएम-पूर्ण के 1-1.5 एमएल और पुनः संयोजक मानव आईएल -7 और आईएल -15 के 10 एनजी / एमएल के साथ बदलें ( सामग्री की तालिकादेखें)। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (दिन 2 प्रक्रिया) में लौटाएं।
    नोट: पूर्व विवो संस्कृति के दौरान, साइटोकिन्स के 10 एनजी / एमएल को हर 48 घंटे में संस्कृति में जोड़ा जाना चाहिए, और टी कोशिकाओं को 1 x 106 / एमएल से अधिक पतला नहीं किया जाना चाहिए।
  6. 48 घंटे के बाद पारगमन, एक ताजा 24 अच्छी तरह से या 6 अच्छी तरह से थाली में पारगमन प्लेट से कोशिकाओं हस्तांतरण और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (3 प्रक्रिया) के लिए कोशिकाओं वापसी.
    नोट: टी सेल व्यवहार्यता और वायरल टिटर शुरू करने के आधार पर, टी सेल व्यवहार्यता शुरू करने के आधार पर, 24 घंटे से 2 दिनों के बाद ट्रांसडक्शन पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करके टी सेल व्यवहार्यता में सुधार हो सकता है।
  7. टी कोशिकाओं डी-मनका और कार अभिव्यक्ति (दिन 5-6 प्रक्रिया) की पुष्टि.
    1. αCD3/CD28-लेपित मोतियों ( सामग्री की तालिकादेखें) से सक्रिय T कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोशिकाओं को पूरी तरह से फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को 30 s के लिए चुंबक पर रखें। सेल निलंबन को वांछित पूर्व विवो संस्कृति पोत में स्थानांतरित करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटाएं।
      नोट: टी कोशिकाओं संस्कृति फ्लास्क या गहरी अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में सुसंस्कृत किया जा सकता है. यह एक 6 अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) की एक गहरी अच्छी तरह से में अच्छी तरह से mTCM पूरा माध्यम के 30 एमएल में 30 एमएल में 5 x 106 टी कोशिकाओं की एक न्यूनतम थाली की सिफारिश की है.
    2. प्रवाह साइटोमेट्री8 द्वारा कार अभिव्यक्ति निर्धारित करें।
      नोट: जीएफपी-कार अभिव्यक्ति शुद्ध जीएफपी के 100 एनजी / एमएल के साथ इनक्यूबेशन द्वारा निर्धारित किया गया था। एन-टर्मिनल एपिटोप टैग को शामिल करने से वैकल्पिक सीएआर निर्माणों का पता लगाने में सुविधा होगी।
  8. CAR-T कोशिकाहरूको पूर्व vivo संस्कृति प्रदर्शन गर्नुहोस् (दिन 7-10 प्रक्रिया)।
    1. पूर्व विवो संस्कृति के दौरान, संस्कृति माध्यम के 50% को हटाने और आईएल -7 और आईएल -15 हर 48 घंटे के ताजा एमटीसीएम-पूर्ण + 2x 10 एनजी / एमएल के साथ इसे बदलकर कोशिकाओं को बनाए रखें।
      नोट: Murine CAR-T कोशिकाहरू डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगहरूमा 7 दिनको पोस्ट-सक्रियण प्रयोगको लागि तयार छन् र खराब व्यवहार्यता पोस्ट-पिघलना को कारणमा cryopreserved हुनुपर्छ।

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Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस CAR-T कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए murine टी सेल पारगमन की प्रक्रिया मानकीकृत करना है. चित्रा 1 शामिल चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। प्रक्रिया फीनिक्स इको कोशिकाओं में वायरल घटकों के सह-अभिकर्मक के माध्यम से रेट्रोवायरल वैक्टर के उत्पादन के साथ शुरू होती है। चित्रा 2 अभिकर्मक के दिन फीनिक्स इको कोशिकाओं के इष्टतम घनत्व की एक छवि प्रदान करता है। पृथक टी कोशिकाओं तो 24 घंटे के बाद अभिकर्मक, या इस प्रोटोकॉल के 'दिन 0' सक्रिय कर रहे हैं, दिन 1 पर पारगमन के लिए तैयारी में. पारगमन के बाद, CAR-T कोशिकाओं को पुनः संयोजक मानव IL-7 और IL-15 की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जाता है ताकि स्टेम सेल मेमोरी आबादी को संरक्षित करते हुए पर्याप्त गुना विस्तार प्राप्त किया जा सके।

इस प्रोटोकॉल के साथ अनुशंसित murine टी सेल अलगाव किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 3A)द्वारा निर्धारित के रूप में पारगमन से पहले <98% की टी सेल शुद्धताओं' की पैदावार करता है। इसके अलावा, 65% -75% की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कार अभिव्यक्ति दर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है और पीएमएससीवी रेट्रोवायरल वेक्टर को पीजीके प्रमोटर(चित्रा 3बी,सी)से सीएआर निर्माण को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया गया है। रेट्रोवायरल टिटर के निर्धारण से ~ 2 x 107 टीयू/एमएल तक के टाइटर्स और 74% की सीएआर अभिव्यक्ति का पता चलता है, जिसमें पीसीएल-इको (पूरक चित्रा 1) के साथ पीएमएससीवी के सह-अभिकर्मक के बाद वायरल सतह पर तैरनेवाला काटा जाता है।

अंत में, आईएल-7 और आईएल-15 के 10 एनजी/एमएल के साथ पूर्व विवो संस्कृति लगभग 15 गुना विस्तार की ओर ले जाती है, जिसके परिणामस्वरूप ~ 150 x 106 टी कोशिकाएं एक एकल तिल्ली(चित्रा 3डी)से दिन 10 के बाद सक्रियण करती हैं। आईएल -7 और आईएल -15 के साथ संस्कृति तुलनीय सीडी 8 + और सीडी 4 + टी सेल आवृत्तियों (चित्रा 3ई) की ओर जाता है और सीडी 62 एल + सीडी44 द्वारा निर्धारित संरक्षित स्टेम सेल मेमोरी आबादी पूर्व विवो संस्कृति(चित्रा 3एफ)के 10 दिनों के बाद अभिव्यक्ति।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल अवलोकन। शीर्ष पैनल: प्रोटोकॉल समयरेखा का एक योजनाबद्ध अवलोकन। बॉटमपैनल: रेट्रोवायरल वेक्टर उत्पादन और माउस टी सेल ट्रांसडक्शन के लिए चरण-दर-चरण निर्देश। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अभिकर्मक के लिए इष्टतम सेल घनत्व। "pMSCV और pCL-इको के साथ अभिकर्मक से पहले इष्टतम घनत्व पर फीनिक्स इको कोशिकाओं की ब्राइटफ़ील्ड माइक्रोस्कोपी छवि"। 10x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके कैप्चर किया गया। स्केल बार = 200 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: murine CAR-टी सेल उत्पादन और पूर्व विवो संस्कृति। (ए) फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट बीएएलबी/सी सीडी 3+ कोशिकाओं के बाद मुरीन टी सेल अलगाव की आवृत्ति दिखा रहा है। (बी)murine टी कोशिकाओं में GFP-कार अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल pMSCV रेट्रोवायरल वेक्टर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (सी)प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम शुद्ध sfGFP के साथ इनक्यूबेशन के बाद माउस टी कोशिकाओं पर कार सतह अभिव्यक्ति का प्रदर्शन. यूटी, अनट्रांसड्यूड। (डी) पुनः संयोजक मानव आईएल -17 और आईएल -15 के साथ दिन 10 के बाद सक्रियण और संस्कृति द्वारा सीएआर-टी कोशिकाओं का गुना विस्तार। लगभग 8 x 106 murine टी कोशिकाओं पारगमन से पहले सक्रिय थे और लगभग 1.28 एक्स10 8 दिन 10 बाद सक्रियण तक पहुंच गया. (E) फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट दिन 8 के बाद सक्रियण पर CD4+ और CD10+ CAR-T कोशिकाओं की आवृत्ति दिखा रहा है। (एफ) फ्लो साइटोमेट्री प्लॉट सीडी 62 एल और सीडी 44 सतह अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित सीडी 8 + टी सेल मेमोरी आबादी की आवृत्ति का प्रदर्शन करता है। स्टेम सेल मेमोरी (TSCM) CD62L+CD44-, CD62L+CD44+ द्वारा सेंट्रल मेमोरी (TCM), और CD62L-CD44+ द्वारा प्रभावक मेमोरी (TEM) की विशेषता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: सेल संस्कृति मीडिया सूत्रीकरण। प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सेल संस्कृति मीडिया के लिए सूत्रीकरण विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 1: कार सतह अभिव्यक्ति और रेट्रोवायरल टाइटर्स। (ए)शुद्ध sfGFP के साथ इनक्यूबेशन के बाद BALB/c T कोशिकाओं पर CAR सतह अभिव्यक्ति दिखा प्रवाह cytometry हिस्टोग्राम. रेट्रोवायरस फीनिक्स इको कोशिकाओं को पीसीएल-इको और पीएमडी 2.जी (आई), पीसीएल-इको (द्वितीय), या अकेले (III) के संयोजन में pMSCV_PGK_mGFP28z के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करके उत्पन्न किया गया था। टी कोशिकाओं को पतला रेट्रोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था जैसा कि संकेत दिया गया था। (बी)रेट्रोवायरल टाइटर्स ट्रांसड्यूड टी कोशिकाओं की सीएआर सतह अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित। ट्रांसड्यूसिंग इकाइयों (टीयू)/एमएल की गणना सूत्र का उपयोग करके की गई थी: (एन∙एफ∙डी)/वी, जहां एन ट्रांसड्यूड कोशिकाओं की संख्या है (1 x 105), एफ सीएआर + कोशिकाओं की आवृत्ति है, डी कमजोर पड़ने का कारक है, और वी एमएल (0.2 एमएल) में पारगमन मात्रा है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: pMSCV अभिव्यक्ति वेक्टर अनुक्रम. pMSCV अभिव्यक्ति वेक्टर में GFP28z CAR और फ़्लैंकिंग अनुक्रमों (इटैलिक) का अनुक्रम, NotI और BamHI एंजाइम साइटों के साथ नीले रंग में हाइलाइट किया गया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल विवो अध्ययनों में CAR-T कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए murine T कोशिकाओं के रेट्रोवायरल पारगमन के लिए आवश्यक चरणों और अभिकर्मकों का वर्णन करता है। रेट्रोवायरल ट्रांसडक्शन स्थितियों का अनुकूलन अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन या अतिरिक्त अभिकर्मकों के माध्यम से वायरल एकाग्रता की आवश्यकता के बिना मजबूत सीएआर अभिव्यक्ति प्राप्त करता है। हालाँकि, ऐसे कई संशोधन हैं जिन्हें इस पद्धति पर लागू किया जा सकता है।

जबकि यह प्रोटोकॉल GFP-विशिष्ट CAR की उदाहरण पीढ़ी का वर्णन करता है, इन विधियों को माउस CAR-T कोशिकाओं को ब्याज के किसी भी बाह्य प्रतिजन को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले pMSCV_PGK रेट्रोवायरल वेक्टर NotI और BamHI के साथ एंजाइमेटिक पाचन द्वारा GFP-विशिष्ट नैनो अनुक्रम के कुशल रिलीज की अनुमति देता है और इसे उपयोगकर्ता-परिभाषित एंटीजन मान्यता डोमेन जैसे scFv, नैनोबॉडी, या लिगैंड-बाइंडिंग डोमेन (पूरक फ़ाइल 1) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। वैकल्पिक कार अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की सुविधा के लिए, यह एक एन-टर्मिनल epitope टैग के साथ कार डिजाइन करने के लिए सिफारिश की है, जैसे कि Myc (EQKLISEEDL) या ध्वज (DYKDDDDK) टैग, फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी12 का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है. इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन एक एकल ट्रांसजीन के उत्पादन को दर्शाता है; हालांकि, स्व-क्लीविंग पेप्टाइड्स (2 ए अनुक्रम) या आंतरिक राइबोसोम एंट्री साइट्स (आईआरईएस) का समावेश विवो 8,13,14 में टी सेल फ़ंक्शन को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त तकनीकों सहित कई ट्रांसजीन के सह-उत्पादन को सक्षम करेगा।

यद्यपि इस प्रोटोकॉल को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (24,000 x ग्राम, 2 एच, 4 डिग्री सेल्सियस) को छोड़कर विशेष उपकरणों की आवश्यकता को खत्म करने के लिए विकसित किया गया था, यह ध्यान देने योग्य है कि वायरल सतह पर तैरनेवाला की एकाग्रता उच्च वायरल टाइटर्स प्राप्त कर सकती है और उच्च कार अभिव्यक्ति8 प्राप्त करने के लिए आवश्यक वायरस की मात्रा को कम कर सकती है। यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त रूप से उपयोग करने से पहले वायरल टिटर निर्धारण की आवश्यकता के बिना प्रजनन योग्य रूप से उच्च वायरल टाइटर्स (~ 2 x 107 टीयू / एमएल) और स्थिर कार अभिव्यक्ति प्राप्त करके रेट्रोवायरल वेक्टर उत्पादन को सुव्यवस्थित करता है। हालांकि, मानकीकरण की सुविधा के अलावा, टी सेल पारगमन से पहले वायरल अनुमापांक का निर्धारण भी अनावश्यक रूप से उच्च वायरल सांद्रता10,15 की वजह से संभावित विषाक्तता को कम करके टी सेल व्यवहार्यता में वृद्धि हो सकती है.

आईएल -7 और आईएल -15 के साथ पूरक टी सेल विस्तार को बढ़ावा देने और टी सेल मेमोरी आबादी को संरक्षित करने की सिफारिश की है; हालांकि, पुनः संयोजक मानव आईएल -2 पूर्व विवो संस्कृति 16,17,18,19 के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की संख्या को कम करने के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. बहरहाल, यहां उल्लिखित सीएआर-टी सेल पीढ़ी के तरीके murine टी कोशिकाओं के अपेक्षाकृत खराब विस्तार से सीमित रहते हैं। हालांकि, ऊपर चर्चा टी सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के उपायों आगे पारगमन प्रक्रिया20 भर में एमटीसीएम संस्कृति माध्यम में अतिरिक्त पूरक और 2-एमई सहित बढ़ाया जा सकता है. हालांकि ये संशोधन टी सेल विस्तार को 15 गुना से 20 गुना20 गुना तक सुधार सकते हैं, इसके परिणामस्वरूप कम पारगमन दक्षता और कम सीएआर अभिव्यक्ति हो सकती है।

अंततः, murine CAR-T कोशिकाओं का उत्पादन एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली के भीतर CAR-T सेल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए syngeneic मॉडल के विकास को सक्षम बनाता है - उनकी शक्ति, स्थायित्व और सुरक्षा के संदर्भ-विशिष्ट मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करता है। जबकि इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में मॉडल मानव ट्यूमर एंटीजन को लक्षित करने वाले मानव टी सेल उत्पाद के महत्वपूर्ण प्रीक्लिनिकल अध्ययन की अनुमति देते हैं। इन पूरक मॉडल प्रणालियों का संयोजन CAR-T सेल बायोलॉजी की जटिलता को समझने, नए CAR डिज़ाइनों को अनुकूलित करने और अंततः प्रभावी नैदानिक उपचारों में प्रीक्लिनिकल निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए अपरिहार्य होगा।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए एल ब्रॉकमैन को धन्यवाद देते हैं। यह काम एनआईएच 1R01EB030352 और UL1 TR001873 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

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References

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Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells को कुशल उत्पादन
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Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

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