Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Эффективная генерация мышиных химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

Этот протокол оптимизирует производство ретровирусных векторов и трансдукцию мышиных Т-клеток, способствуя эффективной генерации мышиных CAR-T-клеток.

Abstract

Инженерная клеточная терапия с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR)-T-клеток достигла замечательной эффективности у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время разрабатывается для лечения различных солидных опухолей. До сих пор предварительная оценка новых продуктов CAR-T-клеток проводилась преимущественно на моделях ксенотрансплантатов опухолей с использованием мышей с иммунодефицитом. Этот подход выбран для того, чтобы способствовать успешному приживлению CAR-T-клеток человека в экспериментальных условиях. Тем не менее, сингенные мышиные модели, в которых опухоли и CAR-T-клетки получены из одной и той же линии мышей, позволяют оценивать новые технологии CAR в контексте функциональной иммунной системы и комплексного опухолевого микроокружения (TME). Протокол, описанный здесь, направлен на оптимизацию процесса генерации мышиных CAR-T-клеток путем представления стандартизированных методов ретровирусной трансдукции и культуры ex vivo Т-клеток. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR, помимо тех, которые использовались в данном исследовании, чтобы обеспечить рутинную оценку новых технологий CAR в иммунокомпетентных системах.

Introduction

Адоптивная Т-клеточная терапия, экспрессирующая химерные антигенные рецепторы (CAR), произвела революцию в области иммунотерапии рака, используя возможности адаптивной иммунной системы для специфического нацеливания и уничтожения антиген-позитивных раковыхклеток. В то время как успех терапии CAR-T-клетками, направленной на злокачественные опухоли В-клеток, был клинически подтвержден, доклинические исследования, проведенные на животных моделях, остаются жизненно важными для разработки новых CAR, нацеленных на солидные опухоли. Тем не менее, до сих пор была продемонстрирована ограниченная клиническая эффективность при солидных опухолях, и становится все более очевидным, что отдельные доклинические модели не могут точно предсказать фармакодинамику и клиническую эффективность живого лекарственного средства 2,3. Поэтому исследователи начали расширять доклинические исследования продуктов CAR-T-клеток, чтобы включить параллельные оценки в ксенотрансплантатах и сингенных моделях рака человека и мышей соответственно.

В отличие от ксенотрансплантатов, в которых человеческие опухоли и Т-клетки приживаются мышам с иммунодефицитом, сингенные модели позволяют исследовать реакцию CAR-T-клеток в контексте функциональной иммунной системы. В частности, иммунокомпетентные мыши с сингенными опухолями представляют собой систему для изучения взаимодействия между адоптивно перенесенными Т-клетками и контекстно-зависимыми средами, включая опухоль-ассоциированные макрофаги (TAM) и регуляторные Т-клетки (Tregs), которые, как известно, подавляют функцию Т-клеток в опухолевом микроокружении (TME)4,5,6. Кроме того, сингенные модели предлагают дополнительную платформу для оценки целевой и внеопухолевой токсичности и взаимодействия CAR-T-клеток с факторами хозяина, которые могут приводить к дополнительной токсичности, включая синдром высвобождения цитокинов7.

Несмотря на эти преимущества, количество исследований сингенных CAR-T-клеток остается ограниченным. Примечательно, что сингенные модели требуют аутологичной инженерии CAR-T-клеток из одной и той же линии мышей и, таким образом, представляют собой дополнительную проблему из-за отсутствия методологии для эффективной трансдукции мышиных Т-клеток и экспансии ex vivo 2,8. В этом протоколе описаны методы достижения стабильной экспрессии CAR за счет производства ретровирусных векторов и оптимизированной трансдукции Т-клеток. Схема всего процесса показана на рисунке 1. Использование данного подхода демонстрирует эффективную ретровирусную трансдукцию мышиных CAR-T-клеток и достижение высокой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с помощью ультрацентрифугирования. Обсуждаются стратегии изменения антиген-специфичности конструкции CAR в дополнение к коэкспрессии дополнительных трансгенов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (Колумбийский университет, протоколы AC-AABQ5551 и AC-AAAZ4470) с использованием 6-8-недельных самок мышей BALB/c или CF57BL/6 весом от 20 до 25 г. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Этот протокол построен вокруг «дней после активации» мышиных Т-клеток, а выработка вируса начинается на 2-й день. Ретровирус может храниться при температуре -80 °C после первоначального производства, и для будущего использования этого протокола можно начать с шага 2, выделения и активации Т-клеток на 0-й день.

1. Производство ретровирусных векторов

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные продукты стали дефектными для репликации путем разделения генов-упаковок на две отдельные плазмиды (см. таблицу материалов), что значительно снижает вероятность событий рекомбинации и непреднамеренного образования репликационно-компетентного вируса.

  1. Подготовьте клетки Phoenix Eco за день до трансфекции (процедура 2-го дня).
    1. Поместите примерно 1 x 107 клеток в 15-сантиметровую пробирку, обработанную ТС, или колбу для культивирования T150, используя 30 мл питательной среды (питательная среда Phoenix Eco, как подробно описано в таблице 1).
    2. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C. Через 18-24 ч клетки должны сливаться примерно на 70% и равномерно распределяться, чтобы обеспечить высокий выход вируса без чрезмерного роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов используйте клетки с низким проходом и проходите их за день до нанесения покрытия на вирусную продукцию. Не допускайте перерастания клеток Phoenix Eco во время рутинного культивирования.
  2. Приготовьте трансфекционную смесь, содержащую реагенты для липофектации и энхансера, pCL-Eco (Gag/Pol) и плазмиду экспрессии pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) в среде с восстановленной сывороткой (см. Таблицу материалов) (процедура 1-го дня).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Котрансфекцию следует проводить в соотношении 1:1 pMSCV и pCL-Eco.
    1. Подготовьте пробирку А: Разведите 105 мкл реагента для трансфекции в 3,75 мл восстановленной сывороточной среды на 15-сантиметровую пластину и тщательно перемешайте, вихревая или пипетируя вверх и вниз.
    2. Подготовьте пробирку B: разбавьте плазмиду экспрессии pMSCV (21 мкг) и pCL-Eco (21 мкг) 90 мкл реагента-энхансера в 3,75 мл восстановленной сывороточной среды на 15-сантиметровую пластину. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы генерируете несколько вирусных продуктов, создайте мастер-смесь, содержащую pCL-Eco и реагент энхансер.
    3. Добавьте пробирку А в пробирку Б и тщательно перемешайте пипеткой. Выдерживают 10-20 мин при комнатной температуре, в результате чего общий объем составляет примерно 7,5 мл.
    4. Осторожно извлеките 10 мл среды для клеточной культуры из планшета (планшетов) Phoenix Eco и добавьте весь объем смеси для трансфекции к оставшейся среде, наклонив планшет и пипетируя по каплям. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C.
  3. Смените среду на трансфицированных клетках Phoenix Eco через 16-20 ч после трансфекции (процедура 0-го дня).
    1. Предварительно нагрейте сыворотку и мышиную Т-клеточную среду без β-меркаптоэтанола (2-ME, см. таблицу материалов) (сбор мТКМ-вируса, как указано в таблице 1) до 37 °C с помощью водяной или шариковой ванны.
    2. Осторожно извлеките питательную среду Phoenix Eco, наклонив пластину и поместив наконечник пипетки в нижний угол, по возможности используя вакуум. Избегайте пересушивания клеток.
    3. Осторожно добавьте подогретую среду для сбора вируса mTCM на боковую сторону наклоненной пластины, пипетируя 30 мл на самой медленной настройке. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может привести к отделению клеток Phoenix Eco от планшета и снижению титров вируса. Предварительно нагретый фильтрующий материал и щадящее пипетирование сведут к минимуму перебои в работе.
  4. Соберите вирусную надосадочную жидкость через 48 ч после трансфекции (процедура 1-го дня).
    1. Соберите вирусную надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через фильтры PVDF 0,45 мкм (см. Таблицу материалов), чтобы удалить клетки и мусор. Аликвотируйте и замораживайте вирус при -80 °C или переходите непосредственно к 1-му дню шага 3, если используете свежий вирус.
    2. Определяют титр вируса (трансдуцирующие единицы/мл) методом проточной цитометрии, как описано ранее9. Этот шаг не является обязательным.
      1. Определяют титр вируса путем мелкомасштабной трансдукции 1 x 10,5 активированных мышиных Т-клеток в 96-луночных планшетах, обработанных нетканевой культурой (ТС), предварительно покрытых ретронектином (см. таблицу материалов) и загруженных трехкратными серийными разведениями ретровирусной надосадочной жидкости в конечном объеме 100 мкл среды для сбора мТКМ-вируса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по выделению, активации и трансдукции Т-клеток см. в шагах 2 и 3 ниже.
      2. Определяют поверхностную экспрессию CAR через 4-5 дней после трансдукции методом проточной цитометрии.
      3. Рассчитайте титр вируса по формуле10: (N x F x D)/V, где N — количество трансдуцированных клеток, F — частота CAR-положительных клеток, D — коэффициент разведения, V — объем трансдукции в мл для получения трансдуцирующих единиц (TU)/мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса может уменьшаться при замораживании/оттаивании; Поэтому титр вируса в идеале определяется по замороженному, а затем размороженному вирусу.

2. Выделение мышиных Т-клеток

  1. Выделение и активация мышиных Т-клеток (процедура 0-го дня).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги можно выполнять при комнатной температуре (RT) или 4 °C и следует проводить в стерильной среде.
    1. Возьмите селезенку (селезенки) из интересующего штамма мыши (например, Balb/c, C57BL/6), как описано выше, и получите одноклеточную суспензию путем механической диссоциации.
    2. Используя заднюю часть стерильного шприца, измельчите селезенку (селезенки) через ситечко с клетками 70-100 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл.
    3. Отложив шприц в сторону, промойте ситечко 5 мл буфера для выделения Т-клеток (фосфатно-солевой буфер, PBS, дополненный 2% фетальной бычьей сывороткой, FBS).
    4. Повторите этап затирания и еще раз промойте ситечко 5 мл буфера для выделения Т-клеток. Доведите окончательный объем до 50 мл с помощью буфера для выделения Т-клеток.
    5. Подсчитывают живые клетки с помощью ручного гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, разбавляя их в соотношении 1:20 и затем смешивая в соотношении 1:1 с трипановым синим.
    6. Гранулируют клетки центрифугированием в течение 10 мин при 450 x g, при 4 °C (или RT) и повторно суспендируют сплиеноциты при концентрации 1 x 108/мл при использовании рекомендованного набора для выделения Т-клеток (см. таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе спленоциты можно повторно процедить через ситечко 40-70 мкм для удаления комков.
  2. Изолируйте CD3+ Т-клетки методом отрицательного отбора, следуя инструкциям производителя (см. таблицу материалов). После магнитной сепарации переложите изолят в коническую пробирку объемом 15 мл и выполните окончательный подсчет живых клеток.
  3. Изолированные Т-клетки гранулируют центрифугированием в течение 10 мин при 450 x g, при 4 °C (или RT) и повторно суспендируют их при 1 x 106/мл в среде активации mTCM (табл. 1).
  4. Активируйте Т-клетки, добавляя мышиные магнитные шарики, покрытые моноклональными антителами (см. таблицу материалов) в соотношении 25 мкл/1 x 106 Т-клеток и 100 ед/мл IL-2.
  5. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 °C и оставьте на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого размера Т-клеток более точное количество живых Т-клеток может быть достигнуто путем разведения в соотношении 1:10-1:20 и смешивания в соотношении 1:1 с трипановым синим для ручного подсчета с помощью гемоцитометра. Чистоту можно определить с помощью проточной цитометрии путем окрашивания клеток флуоресцентно конъюгированным антителом αCD3. Каждая селезенка будет давать от 7 до 10 x 106 Т-клеток в зависимости от возраста и штамма мыши.

3. Мышиная трансдукция Т-клеток

  1. Подготовьте пластины для трансдукции (процедура 0-го дня).
    1. Необработанные стерильные 24-луночные планшеты предварительно покрыть 0,5 мл реагента для усиления трансдукции фибронектина человека (см. таблицу материалов) в конечной концентрации 20-40 мкг/мл, разбавив его в стерильном PBS, и хранить при температуре 4 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап также можно выполнить на 1-й день, покрыв необработанные 24-луночные планшеты трансдукционным реагентом и инкубируя их при комнатной температуре в течение 2 часов.
  2. Провести трансдукцию Т-клеток (процедура 1-го дня).
    1. Подготовьте пластину с предварительно нанесенным покрытием к трансдукции. Извлеките трансдукционный реагент из каждой лунки предварительно покрытой 24-луночной пластины и заблокируйте эквивалентным объемом стерильно отфильтрованного PBS + 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (0,5 мл) в течение 30 мин при RT.
    2. Промойте один раз 0,5-1 мл PBS.
  3. Добавьте 0,5-1 мл чистого ретровируса с этапа 1 или разбавленного в зависимости от титра вируса в каждую лунку с предварительно покрытым покрытием и центрифугу в течение 90 мин при 2000 x g и 32 °C.
  4. Добавьте 1 мл активированных Т-клеток в каждую лунку с вирусной нагрузкой и центрифугируйте в течение 10 мин при 450 x g и 32 °C. Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C на ночь.
  5. Через 24 ч после трансдукции удаляют 1-1,5 мл клеточной питательной среды и заменяют ее 1-1,5 мл mTCM-complete и 10 нг/мл рекомбинантных человеческих IL-7 и IL-15 (см. таблицу материалов). Верните клетки в инкубатор с температурой 37 °C (процедура 2-го дня).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время культивирования ex vivo каждые 48 ч в культуру необходимо добавлять 10 нг/мл цитокинов, а Т-клетки не следует разбавлять более 1 x 106/мл.
  6. Через 48 ч после трансдукции перенести клетки из трансдукционной пластины в свежую 24-луночную или 6-луночную планшет и вернуть клетки в инкубатор при температуре 37 °C (процедура 3-го дня).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность Т-клеток может улучшиться при переносе клеток через 24-2 дня после трансдукции, в зависимости от исходной жизнеспособности Т-клеток и титра вируса.
  7. Удалить Т-клетки и подтвердить экспрессию CAR (процедура 5-6 дня).
    1. Тщательно ресуспендируйте клетки, чтобы диссоциировать активированные Т-клетки от гранул, покрытых αCD3/CD28 (см. таблицу материалов), и поместите клеточную суспензию на магнит на 30 с. Перенесите клеточную суспензию в желаемый культуральный сосуд ex vivo и верните его в инкубатор с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Т-клетки можно культивировать в культуральных колбах или глубоких культуральных планшетах. Рекомендуется помещать не менее 5 x 106 Т-клеток в 30 мл среды mTCM-complete на лунку в глубокой лунке 6-луночного формата (см. таблицу материалов).
    2. Определение экспрессии CAR методом проточной цитометрии8.
      Примечание: экспрессию GFP-CAR определяли путем инкубации со 100 нг/мл очищенного GFP. Включение N-концевой метки эпитопа облегчит обнаружение альтернативных конструкций CAR.
  8. Провести культивирование ex vivo CAR-T-клеток (процедура 7-10 дня).
    1. Во время культивирования ex vivo поддерживайте клетки, удаляя 50% питательной среды и заменяя ее свежей mTCM-complete + 2x 10 нг/мл IL-7 и IL-15 каждые 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные CAR-T-клетки готовы к использованию в последующих приложениях через 7 дней после активации и не должны подвергаться криоконсервации из-за низкой жизнеспособности после оттаивания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол, описанный здесь, направлен на стандартизацию процесса трансдукции мышиных Т-клеток для получения мышиных CAR-T-клеток. На рисунке 1 приведено подробное описание необходимых шагов. Процесс начинается с производства ретровирусных векторов путем котрансфекции вирусных компонентов в клетки Phoenix Eco. На рисунке 2 представлено изображение оптимальной плотности клеток Phoenix Eco в день трансфекции. Затем изолированные Т-клетки активируются через 24 часа после трансфекции, или «День 0» по этому протоколу, для подготовки к трансдукции в 1-й день. После трансдукции CAR-T-клетки культивируют в присутствии рекомбинантных человеческих IL-7 и IL-15 для достижения достаточного расширения складки при сохранении популяций памяти стволовых клеток.

Использование рекомендуемого набора для выделения мышиных Т-клеток (см. таблицу материалов) с этим протоколом позволяет получить чистоту Т-клеток <98% до трансдукции, что определено с помощью проточной цитометрии (рис. 3A). Кроме того, с помощью этого протокола и ретровирусного вектора pMSCV, модифицированного для экспрессии конструкции CAR из промотора PGK, можно достичь воспроизводимых показателей экспрессии экспрессии CAR экспрессии в 65%-75% (рис. 3B, C). Определение титра ретровирусов выявляет титры до ~2 x 107 МЕ/мл и экспрессию CAR 74% при этом 1/3вирусной надосадочной жидкости получают после совместной трансфекции pMSCV с pCL-Eco (дополнительный рисунок 1).

Наконец, культивирование ex vivo с 10 нг/мл IL-7 и IL-15 приводит к примерно 15-кратному расширению, в результате чего к 10-му дню после активации из одной селезенки образуется ~150 x 106 Т-клеток (рис. 3D). Культивирование с IL-7 и IL-15 приводит к сопоставимым частотам CD8+ и CD4+ Т-клеток (рис. 3E) и сохраненным популяциям памяти стволовых клеток, определяемым экспрессией CD62L+CD44- после 10 дней культивирования ex vivo (рис. 3F).

Figure 1
Рисунок 1: Обзор протокола. Верхняя панель: схематический обзор временной шкалы протокола. Нижняя панель: Пошаговые инструкции по производству ретровирусных векторов и трансдукции мышиных Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Оптимальная плотность клеток для трансфекции. Светлопольное микроскопическое изображение клеток Phoenix Eco при оптимальной плотности перед трансфекцией pMSCV и pCL-Eco. Снято с помощью объектива с 10-кратным увеличением. Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Производство мышиных CAR-T-клеток и культивирование ex vivo. (A) График проточной цитометрии, показывающий частоту выделения CD3+ клеток BALB/c после выделения мышиных Т-клеток. (B) Схематическое изображение ретровирусного вектора pMSCV, используемого для экспрессии GFP-CAR в мышиных Т-клетках. (C) Гистограммы проточной цитометрии, демонстрирующие поверхностную экспрессию CAR на мышиных Т-клетках после инкубации с очищенным sfGFP. УЗК, нетрансдуцированный. (D) Складчатое расширение CAR-T-клеток к 10-му дню после активации и культивирование с рекомбинантными человеческими IL-17 и IL-15. Примерно 8 x 106 мышиных Т-клеток активировались до трансдукции и достигали примерно 1,28 x 10,8 к 10-му дню после активации. (E) График проточной цитометрии, показывающий частоту CD8+ и CD4+ CAR-T-клеток на 10-й день после активации. (F) График проточной цитометрии, демонстрирующий частоту популяций памяти CD8+ Т-клеток, определяемую поверхностной экспрессией CD62L и CD44. Память стволовых клеток (TSCM) характеризуется CD62L+CD44-, центральная память (TCM) — CD62L+CD44+, а эффекторная память (TEM) — CD62L-CD44+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Рецептура питательных сред для клеточных культур. Подробная информация о рецептуре питательных сред для клеток, используемых в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Поверхностная экспрессия CAR и титры ретровирусов. (A) Гистограммы проточной цитометрии, показывающие поверхностную экспрессию CAR на Т-клетках BALB/c после инкубации с очищенным sfGFP. Ретровирус был получен путем трансфекции клеток Phoenix Eco pMSCV_PGK_mGFP28z в комбинации с pCL-Eco и pMD2.G (I), pCL-Eco (II) или отдельно (III). Т-клетки трансдуцировали разбавленным ретровирусом, как указано. (B) Титры ретровирусов, определяемые поверхностной экспрессией трансдуцированных Т-клеток. Единицы измерения (TU)/мл рассчитывали по формуле: (N∙F∙D)/V, где N — количество трансдуцируемых клеток (1 x 105), F — частота клеток CAR+ , D — коэффициент разведения, V — объем трансдукции в мл (0,2 мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: последовательность векторов экспрессии pMSCV. Последовательность GFP28z CAR и фланговые последовательности (курсив) в векторе экспрессии pMSCV, при этом синим цветом выделены сайты ферментов NotI и BamHI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает этапы и реагенты, необходимые для ретровирусной трансдукции мышиных Т-клеток для получения CAR-T-клеток для исследований in vivo . Оптимизация условий ретровирусной трансдукции позволяет достичь устойчивой экспрессии CAR без необходимости концентрации вируса с помощью ультрацентрифугирования или дополнительных реагентов. Тем не менее, существует множество модификаций, которые могут быть применены к этой методологии.

Несмотря на то, что этот протокол описывает пример генерации GFP-специфичного CAR, эти методы могут быть адаптированы для генерации мышиных CAR-T-клеток, нацеленных на любой интересующий внеклеточный антиген. Ретровирусный вектор pMSCV_PGK, использованный в данном исследовании, позволяет эффективно высвобождать GFP-специфичную последовательность нановируса путем ферментативного расщепления с NotI и BamHI и может быть заменен определяемым пользователем доменом распознавания антигена, таким как scFv, нанотело или лиганд-связывающий домен (Дополнительный файл 1). Для облегчения оценки альтернативной экспрессии CAR рекомендуется конструировать CAR с N-концевой эпитопной меткой, такой как метки Myc (EQKLISEEDL) или Flag (DYKDDDDK), которые могут быть обнаружены с помощью флуоресцентно конъюгированных антител12. Более того, настоящее исследование демонстрирует продукцию одного трансгена; однако включение саморасщепляющихся пептидов (последовательностей 2A) или внутренних сайтов входа рибосом (IRES) позволит совместно производить несколько трансгенов, включая дополнительные технологии для усиления функции Т-клеток in vivo 8,13,14.

Несмотря на то, что этот протокол был разработан для устранения необходимости в специализированном оборудовании за счет отказа от ультрацентрифугирования (24 000 x g, 2 ч, 4 °C), стоит отметить, что концентрация вирусной надосадочной жидкости позволяет достичь более высоких титров вируса и уменьшить объем вируса, необходимый для достижения высокой экспрессии CAR8. Этот протокол дополнительно оптимизирует производство ретровирусных векторов за счет достижения воспроизводимо высоких титров вируса (~2 x 10,7 МЕ/мл) и устойчивой экспрессии CAR без необходимости определения титра вируса перед использованием. Однако, помимо облегчения стандартизации, определение титра вируса до трансдукции Т-клеток может также повысить жизнеспособность Т-клеток за счет снижения потенциальной токсичности, вызванной чрезмерно высокими концентрациями вируса10,15.

Добавки с IL-7 и IL-15 рекомендуются для стимулирования экспансии Т-клеток и сохранения популяций памяти Т-клеток; однако рекомбинантный человеческий IL-2 может быть использован в качестве альтернативы для уменьшения количества необходимых реагентов для культуры ex vivo 16,17,18,19. Тем не менее, методы генерации CAR-T-клеток, описанные здесь, остаются ограниченными из-за относительно слабого распространения мышиных Т-клеток. Тем не менее, меры по улучшению жизнеспособности Т-клеток, о которых говорилось выше, могут быть дополнительно усилены путем включения дополнительных добавок и 2-ME в питательную среду мТКМ на протяжении всего процесса трансдукции20. Хотя эти модификации могут улучшить экспансию Т-клеток с 15 до 20раз, они могут привести к снижению эффективности трансдукции и уменьшению экспрессии CAR.

В конечном счете, производство мышиных CAR-T-клеток позволяет разрабатывать сингенные модели для оценки функции CAR-T-клеток в интактной иммунной системе, облегчая контекстно-зависимую оценку их эффективности, долговечности и безопасности. В то время как модели на мышах с иммунодефицитом позволяют проводить важные доклинические исследования человеческого Т-клеточного продукта, нацеленного на человеческий опухолевый антиген. Комбинация этих взаимодополняющих модельных систем будет незаменима для понимания сложности биологии CAR-T-клеток, оптимизации новых конструкций CAR-клеток и, в конечном итоге, для преобразования доклинических результатов в эффективные клинические методы лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов не декларируется.

Acknowledgments

Благодарим Л. Брокмана за критическое рецензирование рукописи. Эта работа была поддержана NIH 1R01EB030352 и UL1 TR001873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 204
Эффективная генерация мышиных химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vincent, R. L., Li, F., Ballister,… More

Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter