Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Abstract

Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerini kullanan tasarlanmış hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan bireylerde dikkate değer bir etkinlik elde etmiştir ve şu anda çeşitli katı tümörlerin tedavisi için geliştirilmektedir. Şimdiye kadar, yeni CAR-T hücre ürünlerinin ön değerlendirmesi, ağırlıklı olarak immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft tümör modellerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, deney ortamında insan CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde aşılanmasını kolaylaştırmak için seçilmiştir. Bununla birlikte, tümörlerin ve CAR-T hücrelerinin aynı fare suşundan türetildiği sinjeneik fare modelleri, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ve kapsamlı tümör mikroçevresi (TME) bağlamında yeni CAR teknolojilerinin değerlendirilmesine izin verir. Burada açıklanan protokol, retroviral transdüksiyon ve ex vivo T hücre kültürü için standartlaştırılmış yöntemler sunarak fare CAR-T hücre üretimi sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bağışıklığı yeterli sistemlerde yeni CAR teknolojilerinin rutin olarak değerlendirilmesini sağlamak için bu çalışmada kullanılanların ötesinde diğer CAR yapılarına da uygulanabilir.

Introduction

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden evlat edinen T hücresi tedavileri, antijen pozitif kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için adaptif bağışıklık sisteminin gücünden yararlanarak kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır1. B hücreli maligniteleri hedef alan CAR-T hücre tedavilerinin başarısı klinik olarak doğrulanmış olsa da, hayvan modellerinde gerçekleştirilen klinik öncesi çalışmalar, katı tümörleri hedefleyen yeni CAR'ların geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar katı tümör endikasyonlarında sınırlı klinik etkinlik gösterilmiştir ve bireysel klinik öncesi modellerin canlı bir ilacın farmakodinamiğini ve klinik etkinliğini doğru bir şekilde tahmin etmediği giderek daha belirgin hale gelmektedir 2,3. Bu nedenle, araştırmacılar, CAR-T hücre ürünlerinin klinik öncesi çalışmasını, sırasıyla insan ve fare kanserlerinin ksenogreft ve sinjeneik modellerinde paralel değerlendirmeleri içerecek şekilde genişletmeye başladılar.

İnsan tümörlerinin ve T hücrelerinin immün yetmezliği olan farelere aşılandığı ksenogreft modellerinin aksine, sinjeneik modeller, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi bağlamında CAR-T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar. Spesifik olarak, sinjeneik tümörler taşıyan bağışıklığa yetkin fareler, tümör mikroçevresinde (TME) T hücresi fonksiyonunu baskıladığı bilinen tümörle ilişkili makrofajlar (TAM'lar) ve düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) dahil olmak üzere, evlat edinilmiş olarak transfer edilen T hücreleri ile bağlama özgü ortamlar arasındaki etkileşimi incelemek için bir sistem sağlar4,5,6. Ayrıca, sinjeneik modeller, sitokin salınım sendromu7 dahil olmak üzere ek toksisitelere yol açabilecek konakçı faktörlerle hedefte, tümör dışı toksisiteyi ve CAR-T hücre etkileşimini değerlendirmek için ek bir platform sunar.

Bu avantajlara rağmen, sinjeneik CAR-T hücre çalışmalarının sayısı sınırlı kalmaktadır. Özellikle, sinjeneik modeller, aynı fare suşundan CAR-T hücrelerinin otolog mühendisliğini gerektirir ve bu nedenle, verimli murin T hücresi transdüksiyonu ve ex vivo genişleme için metodoloji eksikliği nedeniyle ek bir zorluk sunar 2,8. Bu protokol, retroviral vektörlerin üretimi ve optimize edilmiş T hücresi transdüksiyonu yoluyla kararlı CAR ekspresyonu elde etme yöntemlerini özetlemektedir. Tüm sürecin bir şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. Bu yaklaşımın kullanımı, murin CAR-T hücrelerinin verimli retroviral transdüksiyonunu ve ultrasantrifüjleme yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan yüksek CAR ekspresyonunun elde edildiğini göstermektedir. CAR yapısının antijen özgüllüğünü değiştirme stratejileri, ek transgenlerin birlikte ekspresyonuna ek olarak tartışılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (Columbia Üniversitesi, AC-AABQ5551 ve AC-AAAZ4470 protokolleri) onayı ile 20-25 g ağırlığındaki 6-8 haftalık dişi BALB/c veya CF57BL/6 fareler kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Bu protokol, murin T hücrelerinin 'aktivasyonundan sonraki günler' etrafında yapılandırılmıştır ve viral üretim -2. günde başlar. Retrovirüs, ilk üretimden sonra -80 ° C'de saklanabilir ve bu protokolün gelecekteki kullanımı için, 0. günde 2. adım, T hücresi izolasyonu ve aktivasyonu ile başlanabilir.

1. Retroviral vektör üretimi

NOT: Viral ürünler, paketleme genlerinin iki ayrı plazmide ayrılmasıyla replikasyon kusurlu hale getirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu), rekombinasyon olayları olasılığını ve replikasyona yetkin virüsün yanlışlıkla üretilmesini büyük ölçüde azaltır.

  1. Transfeksiyondan bir gün önce Phoenix Eco hücrelerini hazırlayın (Gün -2 prosedürü).
    1. 30 mL kültür ortamı (Tablo 1'de detaylandırıldığı gibi Phoenix Eco kültür ortamı) kullanarak, 15 cm TC ile muamele edilmiş bir plaka veya T150 kültür şişesinde yaklaşık 1 x10 7 hücre plakalayın.
    2. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. 18-24 saat sonra, aşırı büyüme olmadan yüksek bir viral verim sağlamak için hücreler yaklaşık% 70 birleşik olmalı ve düzgün bir şekilde dağılmalıdır.
      NOT: En iyi sonuçlar için, düşük geçişli hücreler kullanın ve viral üretim için kaplamadan bir gün önce bunları geçirin. Phoenix Eco hücrelerinin rutin kültür sırasında aşırı büyümesine izin vermeyin.
  2. İndirgenmiş serum ortamında lipofeksiyon ve arttırıcı reaktifler, pCL-Eco (Gag / Pol) ve pMSCV ekspresyon plazmidini (pMSCV_PGK_mGFP28z) içeren transfeksiyon karışımını hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) (Gün -1 prosedürü).
    NOT: Ko-transfeksiyon, pMSCV ve pCL-Eco'nun 1:1 oranında gerçekleştirilmelidir.
    1. Tüp A'yı Hazırlayın: 105 μL transfeksiyon reaktifini 15 cm'lik plaka başına 3.75 mL indirgenmiş serum ortamında seyreltin ve yukarı ve aşağı girdap veya pipetleme ile iyice karıştırın.
    2. Tüp B'yi hazırlayın: pMSCV ekspresyon plazmidini (21 μg) ve pCL-Eco'yu (21 μg) 90 μL arttırıcı reaktif ile 15 cm'lik plaka başına 3.75 mL indirgenmiş serum ortamına seyreltin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
      NOT: Birden fazla viral ürün oluşturuyorsanız, pCL-Eco ve arttırıcı reaktif içeren bir ana karışım oluşturun.
    3. Tüp A'yı Tüp B'ye ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10-20 dakika inkübe edin, toplam hacim yaklaşık 7,5 mL'dir.
    4. Phoenix Eco plakasından/plakalarından 10 mL hücre kültürü ortamını dikkatlice çıkarın ve plakayı eğerek ve damla damla pipetleyerek transfeksiyon karışımının tüm hacmini kalan ortama ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
  3. Transfekte edilmiş Phoenix Eco hücrelerindeki ortamı, transfeksiyondan 16-20 saat sonra değiştirin (Gün 0 prosedürü).
    1. Bir su veya boncuk banyosu kullanarak serum ve β-merkaptoetanol (2-ME, Malzeme Tablosuna bakınız) içermeyen murin T hücresi ortamını ( Tablo 1'de listelendiği gibi mTCM-viral hasat) 37 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
    2. Plakayı eğerek ve pipet ucunu alt köşeye yerleştirerek, mümkünse bir vakum kullanarak Phoenix Eco kültür ortamını dikkatlice çıkarın. Hücreleri aşırı kurutmaktan kaçının.
    3. Isıtılmış mTCM-viral hasat ortamını, en yavaş ayarda 30 mL pipetleyerek eğimli plakanın yan tarafına yavaşça ekleyin. Hücreleri 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
      NOT: Bu adım, Phoenix Eco hücrelerinin plakadan ayrılmasına ve viral titreleri azaltmasına neden olabilir. Önceden ısıtılmış ortam ve hassas pipetleme, bozulmayı en aza indirir.
  4. Viral süpernatanı transfeksiyondan 48 saat sonra hasat edin (1. gün prosedürü).
    1. Viral süpernatanı toplayın ve hücreleri ve kalıntıları gidermek için 0.45 μm PVDF filtrelerinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) süzün. Virüsü alın ve -80 °C'de dondurun veya taze virüs kullanıyorsanız doğrudan 3. adımın 1. gününe geçin.
    2. Daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi ile viral titreyi (dönüştürücü birimler / mL) belirleyin9. Bu adım isteğe bağlıdır.
      1. Doku kültürü (TC) ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakalarda 1 x 105 aktif murin T hücrelerinin küçük ölçekli transdüksiyonu ile viral titreyi belirleyin, retronektin ile önceden kaplanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu) ve 100 μL mTCM-viral hasat ortamının nihai hacminde retroviral süpernatantın üç kat seri dilüsyonları ile yüklenmiştir.
        NOT: T hücresi izolasyonu, aktivasyonu ve transdüksiyonu hakkında ayrıntılı talimatlar için aşağıdaki 2. ve 3. adımlara bakın.
      2. Akış sitometrisi ile transdüksiyondan 4-5 gün sonra CAR yüzey ekspresyonunu belirleyin.
      3. Viral titreyiformül 10'a göre hesaplayın: (N x F x D) / V, burada N dönüştürülen hücre sayısıdır, F, CAR pozitif hücrelerin frekansıdır, D seyreltme faktörüdür ve V, dönüştürücü birimler (TU) / mL elde etmek için mL cinsinden iletim hacmidir.
        NOT: Viral titre donma/çözülme üzerine azalabilir; Bu nedenle, viral titre ideal olarak donmuş ve daha sonra çözülmüş virüs üzerinde belirlenir.

2. Murin T hücresi izolasyonu

  1. Murin T hücrelerini izole edin ve aktive edin (Gün 0 prosedürü).
    NOT: Bu adımlar oda sıcaklığında (RT) veya 4 °C'de gerçekleştirilebilir ve steril bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
    1. Dalak (lar) daha önce tarif edildiği gibi ilgilenilen fare suşundan (örneğin, Balb / c, C57BL / 6)hasat edin 11 ve mekanik ayrışma yoluyla tek hücreli bir süspansiyon elde edin.
    2. Steril bir şırınganın arkasını kullanarak, dalakları 70-100 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik konik bir tüpe ezin.
    3. Şırıngayı bir kenara koyduktan sonra, süzgeci 5 mL T hücresi izolasyon tamponu (fosfat tamponlu salin, PBS,% 2 fetal sığır serumu, FBS ile desteklenmiş) ile yıkayın.
    4. Ezme adımını tekrarlayın ve süzgeci 5 mL T hücre izolasyon tamponu ile bir kez daha yıkayın. T hücresi izolasyon tamponu ile son hacmi 50 mL'ye getirin.
    5. Manuel hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri 1:20 oranında seyrelterek ve ardından 1:1'de tripan mavisi ile karıştırarak sayın.
    6. Hücreleri 450 x g'da, 4 °C'de (veya RT'de) 10 dakika santrifüjleme ile pelet yapın ve önerilen T hücresi izolasyon kitini kullanıyorsanız spleenositleri 1 x 108 / mL'de yeniden süspanse edin (bkz.
      NOT: Spleenositler, kümeleri çıkarmak için bu aşamada 40-70 μm'lik bir süzgeçten tekrar süzülebilir.
  2. CD3+ T hücrelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek negatif seçimle izole edin (bkz. Malzeme Tablosu). Manyetik ayırmadan sonra, izolatı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve son bir canlı hücre sayımı yapın.
  3. İzole edilmiş T hücrelerini 450 x g'da, 4 ° C'de (veya RT'de) 10 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin ve mTCM aktivasyon ortamında 1 x 106 / mL'de yeniden süspanse edin (Tablo 1).
  4. 25 μL / 1 x 106 T hücre ve 100 U / mL IL-2 oranında murin anti-CD3 / anti-CD28 monoklonal antikor kaplı manyetik boncuklar (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek T hücrelerini aktive edin.
  5. Hücreleri 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin ve gece boyunca bırakın.
    NOT: T hücrelerinin küçük boyutu nedeniyle, bir hemositometre kullanılarak manuel sayım için 1:10-1:20 oranında seyreltilerek ve 1:1'de tripan mavisi ile karıştırılarak daha doğru bir canlı T hücresi sayımı elde edilebilir. Saflık, hücrelerin floresan konjuge αCD3 antikoru ile boyanmasıyla akış sitometrisi ile belirlenebilir. Her dalak, farenin yaşına ve türüne bağlı olarak 7-10 x 106 T hücre verecektir.

3. Murin T hücresi transdüksiyonu

  1. Transdüksiyon için plakaları hazırlayın (Gün 0 prosedürü).
    1. İşlem görmemiş steril 24 oyuklu plakaları 0.5 mL insan fibronektin transdüksiyon arttırıcı reaktif (Malzeme Tablosuna bakınız) ile steril PBS içinde seyrelterek 20-40 μg / mL'lik bir son konsantrasyonda önceden kaplayın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu adım, işlem görmemiş 24 oyuklu plakaların transdüksiyon reaktifi ile kaplanması ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilmesiyle 1. günde de gerçekleştirilebilir.
  2. T hücresi transdüksiyonu gerçekleştirin (1. gün prosedürü).
    1. Önceden kaplanmış plakayı transdüksiyon için hazırlayın. Transdüksiyon reaktifini önceden kaplanmış 24 oyuklu plakanın her bir oyuğundan çıkarın ve RT'de 30 dakika boyunca eşdeğer hacimde steril filtrelenmiş PBS +% 2 sığır serum albümini (BSA) (0.5 mL) ile bloke edin.
    2. 0.5-1 mL PBS ile bir kez yıkayın.
  3. 1. adımdan itibaren 0.5-1 mL saf retrovirüs ekleyin veya önceden kaplanmış her bir kuyucuğa viral titreye göre seyreltilmiş ve 2.000 x g ve 32 ° C'de 90 dakika santrifüjleyin.
  4. Viral olarak yüklenen her kuyuya 1 mL aktif T hücresi ekleyin ve 450 x g ve 32 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun.
  5. Transdüksiyondan 24 saat sonra, 1-1.5 mL hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1-1.5 mL mTCM-tam ve 10 ng / mL rekombinant insan IL-7 ve IL-15 ile değiştirin (bkz. Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun (2. gün prosedürü).
    NOT: Ex vivo kültür sırasında, kültüre her 48 saatte bir 10 ng/mL sitokin eklenmeli ve T hücreleri 1 x 106/mL'nin üzerinde seyreltilmemelidir.
  6. Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri transdüksiyon plakasından yeni bir 24 oyuklu veya 6 oyuklu plakaya aktarın ve hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatöre geri koyun (3. Gün prosedürü).
    NOT: T hücresi canlılığı, T hücresi canlılığına ve viral titreye bağlı olarak, transdüksiyondan 24 saat ila 2 gün sonra hücrelerin aktarılmasıyla iyileşebilir.
  7. T hücrelerini ayırın ve CAR ekspresyonunu onaylayın (Gün 5-6 prosedürü).
    1. Aktive edilmiş T hücrelerini αCD3/CD28 kaplı boncuklardan ayırmak için hücreleri iyice yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre süspansiyonunu 30 saniye boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu istenen ex vivo kültür kabına aktarın ve 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
      NOT: T hücreleri, kültür şişelerinde veya derin kuyu kültür plakalarında kültürlenebilir. 6 oyuklu formatlı bir plakanın derin bir kuyusunda oyuk başına 30 mL mTCM-tam ortamda en az 5 x 106 T hücrenin kaplanması önerilir (bkz.
    2. Akış sitometrisi ile CAR ekspresyonunu belirleyin8.
      NOT: GFP-CAR ekspresyonu, 100 ng/mL saflaştırılmış GFP ile inkübasyon ile belirlendi. Bir N-terminal epitop etiketinin dahil edilmesi, alternatif CAR yapılarının tespitini kolaylaştıracaktır.
  8. CAR-T hücrelerinin ex vivo kültürünü gerçekleştirin (7-10. gün prosedürü).
    1. Ex vivo kültür sırasında, kültür ortamının% 50'sini çıkararak ve her 48 saatte bir taze mTCM-tam + 2x 10 ng / mL IL-7 ve IL-15 ile değiştirerek hücreleri koruyun.
      NOT: Murin CAR-T hücreleri, aktivasyondan 7 gün sonra aşağı akış uygulamalarında kullanıma hazırdır ve çözülme sonrası zayıf canlılık nedeniyle dondurularak saklanmamalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan protokol, fare CAR-T hücrelerinin üretilmesi için murin T hücresi transdüksiyon sürecini standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Şekil 1 , ilgili adımların ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Süreç, viral bileşenlerin Phoenix Eco hücrelerine birlikte transfeksiyonu yoluyla retroviral vektörlerin üretilmesiyle başlar. Şekil 2 , transfeksiyon gününde Phoenix Eco hücrelerinin optimal yoğunluğunun bir görüntüsünü sağlar. İzole edilmiş T hücreleri daha sonra transfeksiyondan 24 saat sonra veya bu protokolün '0. gününde' aktive edilir ve 1. günde transdüksiyona hazırlanır. Transdüksiyonu takiben, CAR-T hücreleri, kök hücre bellek popülasyonlarını korurken yeterli kat genişlemesi elde etmek için rekombinant insan IL-7 ve IL-15 varlığında kültürlenir.

Bu protokolle önerilen murin T hücresi izolasyon kitinin (bkz. Malzeme Tablosu) kullanımı, akış sitometrisi ile belirlendiği gibi, transdüksiyondan önce% <98'lik T hücresi saflıkları verir (Şekil 3A). Ayrıca, bu protokol ve bir PGK promotöründen CAR yapısını ifade etmek için modifiye edilmiş pMSCV retroviral vektörü kullanılarak %65-75'lik tekrarlanabilir CAR ekspresyon oranları elde edilebilir (Şekil 3B,C). Retroviral titrenin belirlenmesi, pMSCV'nin pCL-Eco ile birlikte transfeksiyonunu takiben hasat edilen viral süpernatantın1/3'ü ile ~2 x 107 TU/mL'ye kadar titreler ve %74'lük CAR ekspresyonunu ortaya çıkarır (Ek Şekil 1).

Son olarak, 10 ng/mL IL-7 ve IL-15 içeren ex vivo kültür, yaklaşık 15 kat genişlemeye yol açar ve tek bir dalaktan aktivasyon sonrası 10. günde ~ 150 x10 6 T hücre ile sonuçlanır (Şekil 3D). IL-7 ve IL-15 ile kültür, karşılaştırılabilir CD8+ ve CD4+ T hücre frekanslarına (Şekil 3E) ve 10 günlük ex vivo kültürü takiben CD62L+CD44- ekspresyonu ile belirlenen korunmuş kök hücre bellek popülasyonlarına yol açar (Şekil 3F).

Figure 1
Şekil 1: Protokole genel bakış. Üst panel: Protokol zaman çizelgesine şematik bir genel bakış. Alt panel: Retroviral vektör üretimi ve fare T hücresi transdüksiyonu için adım adım talimatlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Transfeksiyon için optimal hücre yoğunluğu. pMSCV ve pCL-Eco ile transfeksiyondan önce optimum yoğunlukta Phoenix Eco hücrelerinin Brightfield mikroskobu görüntüsü. 10x objektif lens kullanılarak çekilmiştir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Murin CAR-T hücre üretimi ve ex vivo kültür. (A) Murin T hücresi izolasyonu sonrası BALB / c CD3 + hücrelerinin sıklığını gösteren akış sitometrisi grafiği. (B) Murin T hücrelerinde GFP-CAR ekspresyonu için kullanılan pMSCV retroviral vektörünün şematik gösterimi. (C) Saflaştırılmış sfGFP ile inkübasyondan sonra fare T hücrelerinde CAR yüzey ekspresyonunu gösteren akış sitometrisi histogramları. UT, aktarılmamış. (D) CAR-T hücrelerinin aktivasyon sonrası 10. günde genişlemesi ve rekombinant insan IL-17 ve IL-15 ile kültürlenmesi. Transdüksiyondan önce yaklaşık 8 x 106 murin T hücresi aktive edildi ve aktivasyondan sonra 10. günde yaklaşık 1.28 x10 8'e ulaştı. (E) Aktivasyondan sonraki 10. günde CD8+ ve CD4+ CAR-T hücrelerinin sıklığını gösteren akış sitometrisi grafiği. (F) CD62L ve CD44 yüzey ekspresyonu ile belirlenen CD8+ T hücre belleği popülasyonlarının sıklığını gösteren akış sitometrisi grafiği. Kök hücre belleği (TSCM) CD62L+CD44-, merkezi bellek (TCM) CD62L+CD44+ ve efektör bellek (TEM) CD62L-CD44+ ile karakterize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Hücre kültürü ortamı formülasyonu. Protokolde kullanılan hücre kültürü ortamı için formülasyon ayrıntıları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: CAR yüzey ekspresyonu ve retroviral titreler. (A) Saflaştırılmış sfGFP ile inkübasyondan sonra BALB / c T hücrelerinde CAR yüzey ekspresyonunu gösteren akış sitometrisi histogramları. Retrovirüs, Phoenix Eco hücrelerinin pCL-Eco ve pMD2.G (I), pCL-Eco (II) ile kombinasyon halinde veya tek başına (III) pMSCV_PGK_mGFP28z ile transfekte edilmesiyle üretildi. T hücreleri, belirtildiği gibi seyreltilmiş retrovirüs ile transdüksiyona tabi tutuldu. (B) Transdüksiyona uğramış T hücrelerinin CAR yüzey ekspresyonu ile belirlenen retroviral titreler. Dönüştürücü birimler (TU) / mL aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı: (N∙F∙D)/V, burada N dönüştürülen hücre sayısıdır (1 x 105), F CAR+ hücrelerinin frekansıdır, D seyreltme faktörüdür ve V, mL (0.2 mL) cinsinden transdüksiyon hacmidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: pMSCV ifade vektör dizisi. GFP28z CAR'ın dizisi ve pMSCV ekspresyon vektöründeki yan diziler (italik), NotI ve BamHI enzim bölgeleri mavi renkle vurgulanmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, in vivo çalışmalar için CAR-T hücreleri üretmek üzere murin T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için gerekli adımları ve reaktifleri açıklar. Retroviral transdüksiyon koşullarının optimize edilmesi, ultrasantrifüjleme veya ek reaktifler yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan sağlam CAR ekspresyonu sağlar. Ancak, bu metodolojiye uygulanabilecek birden fazla değişiklik vardır.

Bu protokol, GFP'ye özgü bir CAR'ın örnek oluşumunu açıklarken, bu yöntemler, ilgilenilen herhangi bir hücre dışı antijeni hedefleyen fare CAR-T hücreleri oluşturmak için uyarlanabilir. Bu çalışmada kullanılan pMSCV_PGK retroviral vektör, NotI ve BamHI ile enzimatik sindirim yoluyla GFP'ye özgü nanokor dizisinin verimli bir şekilde salınmasına izin verir ve bir scFv, nano gövde veya ligand bağlama alanı gibi kullanıcı tanımlı bir antijen tanıma alanı ile değiştirilebilir (Ek Dosya 1). Alternatif CAR ekspresyonunun değerlendirilmesini kolaylaştırmak için, floresan konjuge antikorlar12 kullanılarak tespit edilebilen Myc (EQKLISEEDL) veya Bayrak (DYKDDDDK) etiketleri gibi bir N-terminal epitop etiketine sahip CAR'ların tasarlanması önerilir. Ayrıca, mevcut çalışma tek bir transgenin üretimini göstermektedir; bununla birlikte, kendi kendini parçalayan peptitlerin (2A dizileri) veya dahili ribozom giriş bölgelerinin (IRES) dahil edilmesi, in vivo 8,13,14 T hücresi fonksiyonunu geliştirmek için ek teknolojiler de dahil olmak üzere çoklu transgenlerin birlikte üretilmesini sağlayacaktır.

Bu protokol, ultrasantrifüjlemeyi (24.000 x g, 2 saat, 4 °C) atlayarak özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırmak için geliştirilmiş olsa da, viral süpernatant konsantrasyonunun daha yüksek viral titreler elde edebileceğini ve yüksek CAR ekspresyonu elde etmek için gereken virüs hacmini azaltabileceğini belirtmekte fayda var8. Bu protokol ayrıca, kullanımdan önce viral titre tayinine gerek kalmadan tekrarlanabilir şekilde yüksek viral titreler (~ 2 x 107 TU / mL) ve sabit CAR ekspresyonu elde ederek retroviral vektör üretimini kolaylaştırır. Bununla birlikte, standardizasyonu kolaylaştırmanın yanı sıra, T hücresi transdüksiyonundan önce viral titrenin belirlenmesi, gereksiz yere yüksek viral konsantrasyonların neden olduğu potansiyel toksisiteyi azaltarak T hücresi canlılığını da artırabilir10,15.

T hücresi genişlemesini teşvik etmek ve T hücresi bellek popülasyonlarını korumak için IL-7 ve IL-15 ile takviye önerilir; bununla birlikte, rekombinant insan IL-2, ex vivo kültür 16,17,18,19 için gerekli reaktiflerin sayısını azaltmak için bir alternatif olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, burada özetlenen CAR-T hücresi üretimi yöntemleri, murin T hücrelerinin nispeten zayıf genişlemesi ile sınırlı kalmaktadır. Bununla birlikte, yukarıda tartışılan T hücresi canlılığını iyileştirmeye yönelik önlemler, transdüksiyon işlemi20 boyunca mTCM kültür ortamına ek takviyeler ve 2-ME dahil edilerek daha da geliştirilebilir. Bu modifikasyonlar T hücresi genişlemesini 15 kattan 20 kata kadar artırabilirken, daha düşük transdüksiyon verimliliğine ve azalmış CAR ekspresyonuna neden olabilir.

Sonuç olarak, murin CAR-T hücrelerinin üretimi, sağlam bir bağışıklık sistemi içinde CAR-T hücre fonksiyonunu değerlendirmek için sinjeneik modellerin geliştirilmesini sağlar - potansiyellerinin, dayanıklılıklarının ve güvenliklerinin bağlama özgü bir değerlendirmesini kolaylaştırır. İmmün yetmezliği olan farelerdeki modeller, bir insan tümör antijenini hedefleyen bir insan T hücresi ürününün önemli klinik öncesi çalışmalarına izin verir. Bu tamamlayıcı model sistemlerinin kombinasyonu, CAR-T hücre biyolojisinin karmaşıklığını anlamak, yeni CAR tasarımlarını optimize etmek ve nihayetinde klinik öncesi bulguları etkili klinik tedavilere dönüştürmek için vazgeçilmez olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan edilmedi.

Acknowledgments

Makalenin eleştirel incelemesi için L. Brockmann'a teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH 1R01EB030352 ve UL1 TR001873 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 204
Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vincent, R. L., Li, F., Ballister,… More

Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter