Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65887
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

Summary

פרוטוקול זה מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי ואת התמרת תאי T מורין, ומאפשר ייצור יעיל של תאי CAR-T בעכבר.

Abstract

טיפולים תאיים מהונדסים המשתמשים בתאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T השיגו יעילות יוצאת דופן באנשים עם ממאירויות המטולוגיות ונמצאים כעת בפיתוח לטיפול בגידולים מוצקים מגוונים. עד כה, ההערכה הראשונית של תוצרי תאי CAR-T חדשים התרחשה בעיקר במודלים של גידולי קסנוגרפט באמצעות עכברים מדוכאי חיסון. גישה זו נבחרה כדי להקל על קליטה מוצלחת של תאי CAR-T אנושיים בסביבה הניסויית. עם זאת, מודלים סינגניים של עכברים, שבהם גידולים ותאי CAR-T נגזרים מאותו זן עכבר, מאפשרים הערכה של טכנולוגיות CAR חדשות בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת ומיקרו-סביבה מקיפה של הגידול (TME). הפרוטוקול המתואר כאן נועד לייעל את תהליך ייצור תאי CAR-T בעכבר על ידי הצגת שיטות סטנדרטיות להתמרה רטרו-ויראלית ולתרבית תאי T ex vivo . השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יכולות להיות מיושמות על מבני CAR אחרים מעבר לאלה המשמשים במחקר זה כדי לאפשר הערכה שגרתית של טכנולוגיות CAR חדשות במערכות הכשירות למערכת החיסון.

Introduction

טיפולים מאומצים בתאי T המבטאים קולטני אנטיגן כימריים (CARs) חוללו מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן על ידי רתימת כוחה של מערכת החיסון הנרכשת כדי להתמקד ספציפית בתאי סרטן חיוביים לאנטיגןולחסל אותם 1. בעוד ההצלחה של טיפולים בתאי CAR-T המכוונים לממאירויות של תאי B אוששה קלינית, מחקרים פרה-קליניים שבוצעו במודלים של בעלי חיים נותרו חיוניים לפיתוח CARs חדשים המכוונים לגידולים מוצקים. עם זאת, יעילות קלינית מוגבלת הוכחה באינדיקציות גידול מוצקות עד כה, ומתברר יותר ויותר כי מודלים פרה-קליניים בודדים אינם מנבאים במדויק את הפרמקודינמיקה והיעילות הקלינית של תרופה חיה 2,3. לכן, החוקרים החלו להרחיב את המחקר הפרה-קליני של תוצרי תאי CAR-T כך שיכלול הערכות מקבילות בקסנוגרפט ובמודלים סינגניים של סרטן אנושי וסרטן מורין, בהתאמה.

בניגוד למודלים של קסנוגרפט, שבהם גידולים אנושיים ותאי T מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון, מודלים סינגניים מאפשרים לבחון תגובות של תאי CAR-T בהקשר של מערכת חיסון מתפקדת. באופן ספציפי, עכברים בעלי כשירות חיסונית הנושאים גידולים סינגניים מספקים מערכת לחקר האינטראקציה בין תאי T שהועברו באופן מאומץ לבין מילייה ספציפי להקשר - כולל מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ותאי T רגולטוריים (Tregs) הידועים כמדכאים את תפקוד תאי T במיקרו-סביבה של הגידול (TME)4,5,6. יתר על כן, מודלים סינגניים מציעים פלטפורמה נוספת להערכת רעילות ממוקדת, מחוץ לגידול, ואינטראקציה של תאי CAR-T עם גורמים מארחים שעלולים להוביל לרעילות נוספת, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים7.

למרות יתרונות אלה, מספר המחקרים הסינגניים בתאי CAR-T נותר מוגבל. יש לציין כי מודלים סינגניים דורשים הנדסה אוטולוגית של תאי CAR-T מאותו זן עכבר ולכן מהווים אתגר נוסף בשל היעדר מתודולוגיה להתמרה יעילה של תאי T מורין והרחבת ex vivo 2,8. פרוטוקול זה מתאר את השיטות להשגת ביטוי CAR יציב באמצעות ייצור וקטורים רטרו-ויראליים והתמרה אופטימלית של תאי T. סכמה של התהליך כולו מוצגת באיור 1. השימוש בגישה זו מדגים התמרה רטרו-ויראלית יעילה של תאי CAR-T מורין והשגת ביטוי CAR גבוה ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. אסטרטגיות לשינוי ספציפיות האנטיגן של מבנה CAR נדונות בנוסף לביטוי משותף של טרנסגנים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אוניברסיטת קולומביה, פרוטוקולים AC-AABQ5551 ו-AC-AAAZ4470) באמצעות עכברות BALB/c או CF57BL/6 בנות 6-8 שבועות במשקל של בין 20-25 גרם. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). פרוטוקול זה בנוי סביב "הימים שלאחר ההפעלה" של תאי T מורין, וייצור נגיפים מתחיל ביום -2. רטרו-וירוס יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C לאחר הייצור הראשוני, ולשימוש עתידי של פרוטוקול זה, ניתן להתחיל עם שלב 2, בידוד תאי T והפעלה ביום 0.

1. ייצור וקטור רטרו-ויראלי

הערה: המוצרים הנגיפיים נעשו פגומים בשכפול על ידי הפרדת גני האריזה לשני פלסמידים נפרדים (ראה טבלת חומרים), מה שמקטין מאוד את הסבירות לאירועי רקומבינציה וייצור לא מכוון של וירוס כשיר שכפול.

  1. הכינו את תאי הפניקס אקו יום אחד לפני הטרנספקציה (הליך יום -2).
    1. צלחת בערך 1 x 107 תאים בצלחת 15 ס"מ מטופלת TC או צלוחיות תרבית T150, באמצעות 30 מ"ל של מדיום תרבית (מדיום תרבית הפניקס אקו, כמפורט בטבלה 1).
    2. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F). לאחר 18-24 שעות, התאים צריכים להיות כ 70% confluent ומופץ באופן אחיד כדי להבטיח תשואה ויראלית גבוהה ללא צמיחת יתר.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש בתאים עם מעבר נמוך ולעבור אותם יום לפני הציפוי לייצור נגיפי. אין לאפשר לתאי הפניקס אקו לגדול יתר על המידה במהלך תרבית שגרתית.
  2. הכינו את תערובת הטרנספקציה המכילה את ריאגנטים ליפופקציה ומשפרים, pCL-Eco (Gag/Pol) ופלסמיד ביטוי pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) במדיה מופחתת בסרום (ראו טבלת חומרים) (הליך יום -1).
    הערה: יש לבצע טרנספקציה משותפת ביחס של 1:1 של pMSCV ו-pCL-Eco.
    1. הכינו את צינור A: דללו 105 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ב-3.75 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל צלחת של 15 ס"מ וערבבו היטב על ידי ערבול או פיפטינג למעלה ולמטה.
    2. הכן צינור B: לדלל פלסמיד ביטוי pMSCV (21 מיקרוגרם) ו- pCL-Eco (21 מיקרוגרם) עם מגיב משפר 90 מיקרוליטר ל- 3.75 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל צלחת של 15 ס"מ. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
      הערה: אם אתם מייצרים מוצרים נגיפיים מרובים, הגדירו תערובת אב המכילה pCL-Eco ואת מגיב המשפר.
    3. מוסיפים את צינור A לצינור B ומערבבים היטב על ידי פיפטינג. יש לדגור במשך 10-20 דקות בטמפרטורת החדר, והתוצאה היא נפח כולל של כ-7.5 מ"ל.
    4. הסר בזהירות 10 מ"ל של מדיה של תרבית תאים מלוח Phoenix Eco והוסף את כל נפח תערובת הטרנספקציה למדיה הנותרת על ידי הטיית הצלחת והפיפטינג כלפי מטה. החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  3. שנה את המדיה על תאי Phoenix Eco נגועים 16-20 שעות לאחר הטרנספקציה (הליך יום 0).
    1. סרום טרום חם ו-β-מרקפטואתנול (2-ME, ראו טבלת חומרים) ללא תאי מורין T בינוניים (קציר נגיפי mTCM, כמפורט בטבלה 1) עד 37°C באמצעות אמבט מים או חרוזים.
    2. הסר בזהירות את מדיום התרבות Phoenix Eco על ידי הטיית הצלחת והנחת קצה פיפטה בפינה התחתונה, באמצעות ואקום במידת האפשר. הימנעו מייבוש יתר של התאים.
    3. הוסיפו בעדינות את מדיום הקציר הנגיפי mTCM המחומם לצד הצלחת המוטה על ידי פיפטציה של 30 מ"ל במצב האיטי ביותר. החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: שלב זה יכול לגרום לתאי Phoenix Eco להתנתק מהצלחת ולהפחית את הטיטרים הנגיפיים. מדיה מחוממת מראש ופיפטינג עדין ימזערו את ההפרעה.
  4. קצור את supernatant ויראלי 48 שעות לאחר transfection (הליך יום 1).
    1. קצרו את הסופרנאטנט הנגיפי וסננו אותו דרך מסנני PVDF של 0.45 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) כדי להסיר תאים ופסולת. Aliquot ולהקפיא את הנגיף ב -80 ° C או להמשיך ישירות ליום 1 של שלב 3 אם באמצעות וירוס טרי.
    2. לקבוע את titer ויראלי (יחידות מתמר/mL) על ידי ציטומטריית זרימה,כפי שתואר קודם 9. שלב זה הוא אופציונלי.
      1. קבע את הטיטר הנגיפי על ידי התמרה בקנה מידה קטן של 1 x 105 תאי T מורין פעילים בלוחות 96 בארות שאינם מטופלים בתרבית רקמה (TC), מצופים מראש ברטרונקטין (ראה טבלת חומרים) ועמוסים בדילול סדרתי משולש של סופרנאטנט רטרו-ויראלי בנפח סופי של 100 μL של מדיום קציר נגיפי mTCM.
        הערה: ראה שלבים 2 ו- 3 להלן לקבלת הוראות מפורטות על בידוד, הפעלה והעברה של תאי T.
      2. קביעת ביטוי פני השטח של CAR 4-5 ימים לאחר הטרנסדוקציה על ידי ציטומטריית זרימה.
      3. חשב את הטיטר הנגיפי על פי הנוסחה10: (N x F x D)/V, כאשר N הוא מספר התאים המותמרים, F הוא התדירות של תאים חיוביים ל- CAR, D הוא גורם הדילול, ו- V הוא נפח ההמרה ב- mL לקבלת יחידות מתמרים (TU)/mL.
        הערה: טיטר נגיפי עשוי לרדת בעת הקפאה/הפשרה; לכן, titer ויראלי נקבע באופן אידיאלי על וירוס קפוא ולאחר מכן מופשר.

2. בידוד תאי T מורין

  1. בודד והפעל תאי T מורין (הליך יום 0).
    הערה: שלבים אלה יכולים להתבצע בטמפרטורת החדר (RT) או 4 °C ויש לבצע אותם בסביבה סטרילית.
    1. קצרו את הטחול מזן העכבר המעניין (למשל, Balb/c, C57BL/6) כפי שתואר קודם לכן11 וקבלו תרחיף חד-תאי באמצעות דיסוציאציה מכנית.
    2. בעזרת גב מזרק סטרילי, מרסקים את הטחול דרך מסננת תאים של 70-100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל.
    3. לאחר הנחת המזרק בצד, שטפו את המסננת עם 5 מ"ל של מאגר בידוד תאי T (מלח חוצץ פוספט, PBS, בתוספת סרום בקר עוברי 2%, FBS).
    4. חזור על שלב המעיכה ושטוף את המסננת פעם נוספת עם 5 מ"ל של מאגר בידוד תאי T. הבא את הנפח הסופי ל- 50 מ"ל עם מאגר בידוד תאי T.
    5. ספור תאים חיים באמצעות המוציטומטר ידני או מונה תאים אוטומטי על-ידי דילול ביחס של 1:20 ולאחר מכן ערבוב ביחס של 1:1 עם כחול טריפאן.
    6. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 450 x גרם, ב 4 ° C (או RT), ו resuspend spleenocytes ב 1 x 108/mL אם באמצעות ערכת בידוד תאי T המומלצת (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: ניתן למתוח מחדש טחול באמצעות מסננת של 40-70 מיקרומטר בשלב זה כדי להסיר גושים.
  2. בודד תאי CD3+ T על-ידי בחירה שלילית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר ההפרדה המגנטית, העבירו את המבודד לצינור חרוטי של 15 מ"ל ובצעו ספירת תאים חיים סופית.
  3. שחררו את תאי ה-T המבודדים באמצעות צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-450 x גרם, ב-4°C (או RT), והשהו אותם מחדש ב-1 x 106/mL בתווך הפעלת mTCM (טבלה 1).
  4. הפעל תאי T על ידי הוספת חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים חד-שבטיים נגד CD3/anti-CD28 (ראה טבלת חומרים) ביחס של 25 μL/1 x 10,6 תאי T ו-100 U/mL IL-2.
  5. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והשאירו אותם למשך הלילה.
    הערה: בשל גודלם הקטן של תאי T, ניתן להשיג ספירה מדויקת יותר של תאי T חיים על ידי דילול ביחס של 1:10-1:20 וערבוב של 1:1 עם כחול טריפאן לספירה ידנית באמצעות המוציטומטר. טוהר עשוי להיקבע על ידי ציטומטריית זרימה על ידי צביעת תאים עם נוגדן αCD3 מצומד פלואורסצנטית. כל טחול יניב בין 7-10 x 10 6תאי T בהתאם לגיל ולזן של העכבר.

3. התמרת תאי T מורין

  1. הכינו צלחות להתמרה (הליך יום 0).
    1. ציפוי מראש צלחות סטריליות 24 בארות לא מטופלות עם 0.5 מ"ל של מגיב משפר התמרה פיברונקטין אנושי (ראה טבלת חומרים) בריכוז סופי של 20-40 מיקרוגרם / מ"ל על ידי דילול אותו PBS סטרילי ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה.
      הערה: שלב זה יכול להתבצע גם ביום הראשון על ידי ציפוי צלחות 24 בארות שאינן מטופלות עם מגיב הטרנסדוקציה ודגירתן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
  2. בצע התמרה של תאי T (הליך יום 1).
    1. מכינים את הצלחת המצופה מראש להתמרה. הסר את מגיב ההעברה מכל באר של צלחת 24 בארות מצופה מראש ובלוק עם נפח שווה ערך של PBS מסונן סטרילי + אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) (0.5 מ"ל) למשך 30 דקות ב- RT.
    2. לשטוף פעם אחת עם 0.5-1 מ"ל של PBS.
  3. הוסף 0.5-1 מ"ל של רטרו-וירוס מסודר משלב 1 או מדולל על בסיס טיטר נגיפי לכל באר מצופה מראש וצנטריפוגה למשך 90 דקות ב 2,000 x גרם ו 32 ° C.
  4. הוסף 1 מ"ל של תאי T פעילים לכל באר טעונה נגיפית וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 450 x גרם ו 32 ° C. להחזיר תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בן לילה.
  5. 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה, הסר 1-1.5 מ"ל של מדיה של תרבית תאים והחלף אותה ב- 1-1.5 מ"ל של mTCM-שלם ו- 10 ננוגרם/מ"ל של IL-7 ו- IL-15 אנושיים רקומביננטיים (ראה טבלת חומרים). החזרת תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (הליך יום 2).
    הערה: במהלך תרבית ex vivo , יש להוסיף 10 ng/mL של ציטוקינים לתרבית כל 48 שעות, ואין לדלל תאי T מעבר ל-1 x 106/mL.
  6. 48 שעות לאחר הטרנסדוקציה, מעבירים תאים מצלחת הטרנסדוקציה לצלחת טרייה של 24 בארות או 6 בארות ומחזירים תאים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (הליך יום 3).
    הערה: יכולת הקיום של תאי T עשויה להשתפר על-ידי העברת תאים ב-24 שעות עד יומיים לאחר הטרנסדוקציה, בהתאם ליכולת הקיום של תאי T מתחילים ולטיטר נגיפי.
  7. בטל את חרוז תאי T ואשר ביטוי CAR (הליך יום 5-6).
    1. השהה מחדש ביסודיות תאים כדי לנתק תאי T פעילים מהחרוזים המצופים αCD3 / CD28 (ראה טבלת חומרים) והנח את תרחיף התא על מגנט למשך 30 שניות. מעבירים את תרחיף התא לכלי התרבית הרצוי ex vivo ומחזירים אותו לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: תאי T עשויים להיות מתורבתים בצלוחיות תרבית או בצלחות תרבית עמוקות. מומלץ לצלוח לפחות 5 x 106 תאי T ב 30 מ"ל של מדיום mTCM-שלם לכל באר בבאר עמוקה של צלחת בפורמט 6 בארות (ראה טבלת חומרים).
    2. קביעת ביטוי CAR לפי ציטומטריית זרימה8.
      הערה: ביטוי GFP-CAR נקבע על ידי דגירה עם 100 ננוגרם/מ"ל של GFP מטוהר. שילוב של תג אפיטופ N-terminal יקל על איתור מבני CAR חלופיים.
  8. בצע תרבית ex vivo של תאי CAR-T (הליך יום 7-10).
    1. במהלך תרבית ex vivo , שמור על התאים על ידי הסרת 50% ממדיום התרבית והחלפתו ב- mTCM-Complete טרי + 2x 10 ng/mL של IL-7 ו- IL-15 כל 48 שעות.
      הערה: תאי CAR-T של Murine מוכנים לשימוש ביישומים במורד הזרם 7 ימים לאחר ההפעלה ואין לשמור אותם בהקפאה עקב כדאיות ירודה לאחר ההפשרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן נועד לתקנן את תהליך התמרה של תאי T מורין ליצירת תאי CAR-T עכבריים. איור 1 מספק תיאור מפורט של השלבים המעורבים. התהליך מתחיל בייצור וקטורים רטרו-ויראליים באמצעות טרנספקציה משותפת של רכיבים נגיפיים לתאי Phoenix Eco. איור 2 מספק תמונה של הצפיפות האופטימלית של תאי Phoenix Eco ביום הטרנספקציה. תאי T מבודדים מופעלים 24 שעות לאחר הטרנספקציה, או "יום 0" של פרוטוקול זה, כהכנה להתמרה ביום 1. לאחר הטרנסדוקציה, תאי CAR-T מתורבתים בנוכחות IL-7 ו- IL-15 אנושיים רקומביננטיים כדי להשיג הרחבת קיפול מספקת תוך שימור אוכלוסיות זיכרון תאי גזע.

השימוש בערכת בידוד תאי T המומלצת (ראו טבלת חומרים) עם פרוטוקול זה מניב טוהר תאי T של <98% לפני הטרנסדוקציה, כפי שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 3A). יתר על כן, ניתן להשיג שיעורי ביטוי CAR ניתנים לשחזור של 65%-75% באמצעות פרוטוקול זה והווקטור הרטרו-ויראלי pMSCV שונה כדי לבטא את מבנה ה-CAR ממקדם PGK (איור 3B,C). קביעה של טיטר רטרו-ויראלי מגלה טיטרים של עד ~2 x 107 TU/mL וביטוי CAR של 74% עם 1/3rd של supernatant נגיפי שנקצר לאחר טרנספקציה משותפת של pMSCV עם pCL-Eco (איור משלים 1).

לבסוף, תרבית ex vivo עם 10 ננוגרם/מ"ל של IL-7 ו-IL-15 מובילה להתרחבות של בערך פי 15, וכתוצאה מכך ~150 x 106 תאי T עד יום 10 לאחר ההפעלה מטחול יחיד (איור 3D). תרבית עם IL-7 ו-IL-15 מובילה לתדרי תאי T דומים מסוג CD8+ ו-CD4+ (איור 3E) ולאוכלוסיות זיכרון תאי גזע שמורות שנקבעו על-ידי ביטוי CD62L+CD44 לאחר 10 ימים של תרבית ex vivo (איור 3F).

Figure 1
איור 1: סקירת פרוטוקולים. לוח עליון: סקירה סכמטית של ציר הזמן של הפרוטוקול. לוח תחתון: הוראות שלב אחר שלב לייצור וקטור רטרו-ויראלי והתמרה של תאי T בעכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צפיפות תאים אופטימלית עבור טרנספקציה. תמונה במיקרוסקופ ברייטפילד של תאי Phoenix Eco בצפיפות האופטימלית לפני ההדבקה עם pMSCV ו-pCL-Eco. צולם באמצעות עדשת 10x אובייקטיבית. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ייצור תאי Murine CAR-T ותרבית ex vivo. (A) תרשים ציטומטריית זרימה המראה את התדירות של תאי +CD3 BALB/c לאחר בידוד תאי T מורין. (B) ייצוג סכמטי של הווקטור הרטרו-ויראלי pMSCV המשמש לביטוי GFP-CAR בתאי T מורינים. (C) היסטוגרמות ציטומטריית זרימה המדגימות ביטוי פני שטח CAR על תאי T של עכבר לאחר הדגירה עם sfGFP מטוהר. UT, ללא טרנספורמציה. (D) קפל את התפשטות תאי CAR-T עד היום ה-10 לאחר ההפעלה ותרבית עם IL-17 ו-IL-15 אנושיים רקומביננטיים. בערך 8 x 106 תאי T מורין הופעלו לפני ההתמרה והגיעו בערך 1.28 x 108 ביום 10 לאחר ההפעלה. (E) תרשים ציטומטריית זרימה המראה את התדירות של תאי CAR-T CD8+ ו- CD4+ ביום ה- 10 לאחר ההפעלה. (F) תרשים ציטומטריית זרימה המדגים את התדירות של אוכלוסיות זיכרון תאי CD8+ T שנקבעה על ידי ביטוי פני השטח CD62L ו- CD44. זיכרון תאי גזע (TSCM) מאופיין על ידי CD62L + CD44-, זיכרון מרכזי (TCM) על ידי CD62L + CD44+ וזיכרון אפקט (TEM) על ידי CD62L-CD44+ . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ניסוח מדיה של תרבית תאים. פרטי הניסוח של מדיית תרבית התא המשמשת בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים 1: ביטוי פני השטח של CAR וטיטרים רטרו-ויראליים. (A) היסטוגרמות ציטומטריית זרימה המראות ביטוי פני שטח של CAR על תאי T מסוג BALB/c לאחר הדגירה עם sfGFP מטוהר. רטרו-וירוס נוצר על ידי הדבקת תאי Phoenix Eco עם pMSCV_PGK_mGFP28z בשילוב עם pCL-Eco ו-pMD2.G (I), pCL-Eco (II) או לבד (III). תאי T הומרו ברטרו-וירוס מדולל כפי שצוין. (B) טיטרים רטרו-ויראליים הנקבעים על ידי ביטוי פני השטח של תאי T מותמרים. יחידות התמרות (TU)/mL חושבו באמצעות הנוסחה: (N∙F∙D)/V, כאשר N הוא מספר התאים המומרים (1 x 105), F הוא התדירות של תאי CAR+ , D הוא גורם הדילול, ו- V הוא נפח ההולכה במ"ל (0.2 מ"ל). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: רצף וקטורי ביטוי pMSCV. הרצף של GFP28z CAR ורצפי איגוף (נטוי) בווקטור הביטוי pMSCV, כאשר אתרי האנזימים NotI ו-BamHI מסומנים בכחול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השלבים והריאגנטים הדרושים להתמרה רטרו-ויראלית של תאי T מורין כדי ליצור תאי CAR-T עבור מחקרי in vivo . אופטימיזציה של תנאי התמרה רטרו-ויראלית משיגה ביטוי CAR חזק ללא צורך בריכוז נגיפי באמצעות אולטרה-צנטריפוגה או ריאגנטים נוספים. עם זאת, ישנם שינויים מרובים שניתן ליישם על מתודולוגיה זו.

בעוד פרוטוקול זה מתאר את הדור לדוגמה של CAR ספציפי GFP, שיטות אלה יכולות להיות מותאמות כדי ליצור תאי CAR-T עכבר המכוונים לכל אנטיגן חוץ-תאי של עניין. הווקטור הרטרו-ויראלי pMSCV_PGK המשמש במחקר זה מאפשר שחרור יעיל של רצף ננו ספציפי ל-GFP על ידי עיכול אנזימטי עם NotI ו-BamHI וניתן להחליפו בתחום זיהוי אנטיגן המוגדר על-ידי המשתמש כגון scFv, ננו-גוף או תחום קושר ליגנדים (קובץ משלים 1). כדי להקל על הערכת ביטוי CAR חלופי, מומלץ לתכנן מכוניות עם תג אפיטופ N-terminal, כגון תגי Myc (EQKLISEEDL) או Flag (DYKDDDDK), אשר ניתן לזהות באמצעות נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית12. יתר על כן, המחקר הנוכחי מדגים ייצור של טרנסגן יחיד; עם זאת, שילוב של פפטידים המתנתקים מעצמם (רצפי 2A) או אתרי כניסה פנימיים של ריבוזום (IRES) יאפשר ייצור משותף של טרנסגנים מרובים, כולל טכנולוגיות נוספות לשיפור תפקוד תאי T in vivo 8,13,14.

למרות שפרוטוקול זה פותח כדי לבטל את הצורך בציוד מיוחד על ידי השמטת אולטרה-צנטריפוגה (24,000 x גרם, 2 שעות, 4 מעלות צלזיוס), ראוי לציין כי ריכוז הסופרנאטנט הנגיפי יכול להשיג טיטרים נגיפיים גבוהים יותר ולהפחית את נפח הנגיף הדרוש להשגת ביטוי CAR גבוה8. פרוטוקול זה גם מייעל את הייצור הווקטורי הרטרו-ויראלי על ידי השגת טיטרים נגיפיים גבוהים (~ 2 x 10,7 TU/mL) וביטוי CAR יציב ללא צורך בקביעת טיטר נגיפי לפני השימוש. עם זאת, בנוסף להקלה על התקינה, קביעת טיטר נגיפי לפני התמרה של תאי T עשויה גם להגדיל את הכדאיות של תאי T על ידי הפחתת רעילות פוטנציאלית הנגרמת על ידי ריכוזים נגיפיים גבוהים שלא לצורך10,15.

תוספת של IL-7 ו- IL-15 מומלצת לקידום התרחבות תאי T ולשימור אוכלוסיות זיכרון תאי T; עם זאת, IL-2 אנושי רקומביננטי עשוי לשמש כחלופה כדי להפחית את מספר הריאגנטים הדרושים לתרבות ex vivo 16,17,18,19. אף על פי כן, השיטות ליצירת תאי CAR-T המתוארות כאן נותרו מוגבלות על ידי ההתפשטות הדלה יחסית של תאי T מורינים. עם זאת, ניתן לשפר עוד יותר את האמצעים לשיפור הכדאיות של תאי T שנדונו לעיל על ידי הכללת תוספים נוספים ו-2-ME במדיום תרבית mTCM לאורך תהליך הטרנסדוקציה20. בעוד ששינויים אלה עשויים לשפר את התרחבות תאי T מפי 15 עד פי20 פי 20, הם עשויים לגרום ליעילות התמרה נמוכה יותר ולביטוי CAR מופחת.

בסופו של דבר, הייצור של תאי CAR-T מורין מאפשר פיתוח מודלים סינגניים להערכת תפקוד תאי CAR-T בתוך מערכת חיסון שלמה - מה שמקל על הערכה ספציפית להקשר של עוצמתם, עמידותם ובטיחותם. ואילו מודלים בעכברים מדוכאי חיסון מאפשרים מחקרים פרה-קליניים חשובים של מוצר תאי T אנושיים המכוון לאנטיגן של גידול אנושי. השילוב של מערכות מודל משלימות אלה יהיה הכרחי להבנת המורכבות של הביולוגיה של תאי CAR-T, אופטימיזציה של עיצובי CAR חדשים, ובסופו של דבר תרגום ממצאים פרה-קליניים לטיפולים קליניים יעילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לל. ברוקמן על הביקורת על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01EB030352 ו- UL1 TR001873.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filters MilliporeSigma SLHVR33RS
1 mL syringe  Fisher Scientific  14-955-450
1.5 mL microcentrifuge tubes  Fisher Scientific  05-408-135
10 mL syringe  BD 14-823-16E
100 μm strainer Corning 07-201-432
15 cm TC treated cell culture dishes ThermoFisher Scientific  130183
15 mL conical tubes  Falcon 14-959-70C
40 μm strainer  Corning 07-201-430
50 mL conical tubes  Falcon 14-959-49A
70 μm strainer Corning 07-201-431
Attune NxT Flow Cytometer  ThermoFisher Scientific 
BALB/C, 6-8 week old  Jackson Laboratory 651
B-Mercaptoethanol  Gibco 21985023
Bovine Serum Albumin  GOLDBIO A-420-500
DMEM Medium Gibco 11965092
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium  Gibco 14-190-250
DynaMag-2 Magnet  Invitrogen 12-321-D
EasySep Magnet  Stemcell Technologies 18000
EasySep Mouse T cell Isolation Kit Stemcell Technologies 19851
FACS buffer  BD BDB554657
Fetal bovine serum (FBS)  Corning MT35011CV
GlutaMAX Gibco 35-050-061
G-Rex6 Wilson Wolf 80240M 
HEPES Buffer Solution  Gibco 15-630-080
Human recombinant IL-15  Miltenyi Biotec 130-095-765
Human recombinant IL-2 Miltenyi Biotec 130-097-748
Human recombinant IL-7 Miltenyi Biotec 130-095-363
Lipofectamine 3000 Invitrogen L3000008
MEM Non-Essential Amino Acids Solution  Gibco 11140-050
Mouse Anti-CD3 BV421 Biolegend 100228
Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads Gibco 11-453-D
Mouse Anti-CD4 BV605 BD 563151
Mouse Anti-CD44 APC  Biolegend 103011
Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 Tonbo SKU 60-0621-U025
Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 Tonbo SKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 with Prime 95B camera  Nikon
Non-treated 24 well plates  CytoOne CC7672-7524
Opti-MEM Gibco 31-985-062
pCL-Eco Addgene #12371
Penicillin/Streptomycin Solution Gibco 15-070-063
Phoenix Eco cells ATCC CRL-3214
pMDG.2 Addgene #12259
pMSCV_PGK_GFP28z N/A Produced by R.LV.
Purified sfGFP N/A Produced by R.LV.
RetroNectin ('transduction reagent') Takara Bio T100B
RPMI 1640 Gibco 21875
Serological pipette 10 mL Fisher Scientific  13-678-11E
Serological pipette 25 mL Fisher Scientific  13-678-11
Serological pipette 5 mL Fisher Scientific  13-678-11D
Sodium Pyruvate Gibco 11-360-070
TC-treated 24 well plates  Corning 08-772-1
Trypan blue  Gibco 15-250-061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 204
ייצור יעיל של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vincent, R. L., Li, F., Ballister,… More

Vincent, R. L., Li, F., Ballister, E. R., Arpaia, N., Danino, T. Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells. J. Vis. Exp. (204), e65887, doi:10.3791/65887 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter