Summary
Drosophila är en väletablerad modell för att studera nyckelmolekyler som reglerar myogenes. Nuvarande metoder är dock otillräckliga för att bestämma mRNA-transkriptionsdynamik och rumslig fördelning inom syncytia. För att ta itu med denna begränsning optimerade vi en RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetod som möjliggör detektion och kvantifiering av mRNA på en skala med en enda molekyl.
Abstract
Skelettmuskler är stora syncytier som består av många buntade myofibrer som producerar krafter och möjliggör kroppsrörelse. Drosophila är en klassisk modell för att studera muskelbiologi. Kombinationen av både Drosophila-genetik och avancerade omics-metoder ledde till identifieringen av viktiga bevarade molekyler som reglerar muskelmorfogenes och regenerering. Transkriptionsdynamiken hos dessa molekyler och den rumsliga fördelningen av deras budbärar-RNA inom syncytian kan dock inte bedömas med konventionella metoder. Här optimerade vi en befintlig enmolekylär RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetod (smFISH) för att möjliggöra detektion och kvantifiering av enskilda mRNA-molekyler i vuxna flygmuskler och deras muskelstamceller. Som ett proof of concept har vi analyserat mRNA-uttrycket och fördelningen av två evolutionära bevarade transkriptionsfaktorer, Mef2 och Zfh1/Zeb. Vi visar att denna metod effektivt kan detektera och kvantifiera enstaka mRNA-molekyler för både transkript i muskelprekursorceller, vuxna muskler och muskelstamceller.
Introduction
Vuxna skelettmuskler är gjorda av differentierade multinukleära myofibrer vars sammandragande egenskaper genererar rörelser. Muskeltillväxt, underhåll och regenerering är beroende av muskelstamceller och muskelstamceller (MuSC) som specificeras under embryonal utveckling1. Det myogena programmet styrs fint av en uppsättning centrala myogena transkriptionsfaktorer (TF) (t.ex. Pax3/7, MYOD, Mef2 och ZEB)2,3,4. Att dechiffrera de molekylära mekanismer som reglerar muskelbiologi är viktigt för att belysa grundläggande myologirelaterade frågor och för möjlig terapeutisk användning vid behandling av muskeldegenerativa sjukdomar.
Drosophila har en lång historia som genetisk modell för att studera myogenes5. Det har nyligen dykt upp som en ny modell för att undersöka muskelregenerering 6,7,8. Muskelstrukturen och de myogena kärnprogrammen är mycket bevarade mellan flugor och däggdjur. Till exempel har TF Mef2 och Zfh1/ZEB en bevarad funktion för att reglera muskelutveckling och regenerering 3,9,10,11. Vuxna Drosophila-muskler, såsom Indirect Flight Muscles (IFM), bildas från en specifik population av MuSCs, känd som Adult Muscle Progenitors (AMPs)12. Dessa AMP specificeras under embryogenesen och associeras med epitelstrukturer såsom ving- och benskivor. Under embryonala stadier och larvstadier förblir AMP odifferentierade fram till metamorfos då de deltar i differentiering och fusion för att bilda IFMs13,14. TF Spalt major (spalt, salm) uttrycks under flygmuskelutveckling och är nödvändig för att bestämma deras strukturella identitet15. Mef2 är en annan viktig myogen TF som är avgörande för vuxen muskelbildning16,17. Den uttrycks i AMP och upprätthålls i IFMför vuxna 10,18. Medan majoriteten av AMPs differentieras till funktionella muskler, undgår en delmängd differentiering och bildar de vuxna MuSCs11. I likhet med ryggradsdjur krävs TF Zfh1/ZEB för att förhindra för tidig differentiering av de vuxna MuSC och för att bibehålla deras stam 9,10.
Genuttrycksdynamik har visat sig reglera olika muskelbiologiska processer19,20. Tillkomsten av RNA-sekvenseringstekniker med hög genomströmning av encelliga och enskilda kärnor har möjliggjort en omfattande utforskning av denna transkriptionsdynamik21,22. En anmärkningsvärd begränsning med dessa tillvägagångssätt är deras oförmåga att tillhandahålla den rumsliga fördelningen av mRNA-molekyler i de multinukleära muskelfibrerna. Dessa egenskaper kan undersökas genom fluorescens in situ-hybridisering (smFISH) som avslöjar två typer av mRNA-kroppar: 1. Enskilda mRNA-molekyler utspridda i cytoplasman och representerar det mogna RNA:t och 2. Maximalt två ljusa kärnhärdar motsvarar det begynnande transkriptet och avslöjar de transkriptionellt aktiva allelerna23. Därför är smFISH en metod för kvantifiering av enskilda mRNA-molekyler, som undersöker deras rumsliga fördelning och ger ögonblicksbilder av gentranskriptionsdynamiken.
smFISH-metoden bygger på en uppsättning korta fluorescerande oligonukleotidsonder som är särskilt utformade för att vara komplementära till måltranskriptet. Vid glödgning genererar den högintensiva punktkällor som möjliggör detektion av mRNA på en enda molekylnivå med hjälp av konfokalmikroskopi24. Denna metod används i allt högre grad för en mängd olika celltyper, inklusive däggdjurs muskelvävnader 19,20. Men i Drosophila, liksom i andra djurmodeller, kommer det mesta av kunskapen om genuttryck i vuxna muskler från molekylära bulkanalyser, som saknar kvantitativ information om mRNA-molekylernas rumsliga placering. Här optimerade vi en metod för att utföra smFISH på muskelprekursorceller och vuxna Drosophila-muskler 23,25. Detta protokoll innehåller en helautomatisk analyspipeline för segmentering av kärnor och räkning och lokalisering av mRNA.
Protocol
1. Dissektion och förberedelse av vingskivor och vuxna muskler
OBS: Rengör dissektionsbänken och alla dissektionsinstrument med RNAse-hämmarlösning (Materialförteckning). Laboratoriehandskar bör bäras under hela försöksförfarandet.
- Vinge skiva
- Placera L3-larverna i kall 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (Figur 1A).
- Skölj larverna 3x med 1x PBS och förvara dem i denna lösning i 5 min.
- Använd två par vassa pincetter, håll larven från den främre delen och dra och släng resten av kroppsvävnaderna (cirka 2/3).
- Håll både den första 1/3 av larven med en pincett och munkrokarna med det andra paret. Dra tillbaka munkrokarna inuti larven tills den är helt inverterad.
OBS: Dissekera cirka 30 larver per försök för att säkerställa lämplig provstorlek för analys. - Observera att vingskivorna är nära förbundna med de två primära grenarna av luftstruparna, som löper längs vardera sidan av larven.
- Ta bort alla andra larvkomponenter (benskivor och hjärna) för att få en ren uppochnedvänd larvkropp med ett par vingskivor fästa vid luftstrupen (figur 1B).
- Placera proverna i ett 1 ml centrifugrör och fixera dem i 4 % paraformaldehyd (PFA) utspädd i 1x PBS i 45 minuter vid rumstemperatur under omrörning.
OBS: Provomrörningen uppnås med en oscillerande omrörare (materialförteckning). - Tvätta proverna 3 x 5 min med 70 % etanol (EtOH, utspätt i RNAse-fritt vatten) och förvara dem i samma tvättlösning vid 4 °C i minst 2 dagar och upp till 1 vecka.
- Indirekta flygmuskler
- Bedöva de vuxna flugorna på en CO2 flugdyna och ta bort huvuden, buken, benen och vingarna.
- Placera de dissekerade bröstkorgarna i kall 1x PBS och fortsätt att göra det tills alla prover har dissekerats (Figur 1D).
- Prefixet för bröstkorgarna i 4 % PFA (1 % Triton) i 20 minuter vid rumstemperatur under omrörning.
- Skölj proverna 3 x 5 min med 1x PBT-tvättlösning (1% Triton i 1x PBS).
- Placera bröstkorgarna på en dubbelhäftande tejp (Materialtabell) på ett glasglas och dela dem med ett vasst mikrotomblad för att producera två hemi-thoraces (Figur 1E,F).
- Fixera proverna i 4 % PFA (1 % Triton) i 45 minuter vid rumstemperatur under omrörning.
- Tvätta 2 x 20 min med 1x PBT-tvättlösning (1 % Triton, 1 x PBS) i rumstemperatur under omrörning.
- Placera hemi-thoraces i kall 1x PBS och använd pincetten för att försiktigt isolera IFM från hemi-thorace (Figur 1G).
OBS: För att uppnå detta är det viktigt att ta bort nagelbandet så noggrant som möjligt. - För att permeabilisera proverna, förvara de isolerade IFM:erna i 70 % EtOH-lösning i minst 2 dagar och upp till 1 vecka vid 4 °C.
OBS: Isolera IFM från cirka 10 bröstkorgar per experiment för att säkerställa lämplig provstorlek för analys.
2. Hybridisering, immunfärgning och montering
OBS: Liknande hybridiseringsprocedur tillämpas för både vingskivor och IFM-prover. Det är viktigt att isolera vingskivorna från larvkropparna och placera dem i 200 μl buffert A innan hybridiseringen inleds.
- Återsuspendera sonderna i 400 μL TE-buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) för en slutlig stamlösning på 12,5 μM.
- Överför proverna till ett 0.5 ml centrifugrör som innehåller buffert A (materialförteckning).
OBS: Genom att minska behållarens volym blir det lättare att visualisera proverna och undvika att förlora dem under tvättprocessen. - Tvätta proverna 2 x 20 min med buffert A.
- Aspirera buffert A, ersätt den med 400 μL hybridiseringsbuffert (materialförteckning) och förhybridisera proverna i 30 minuter vid 37 °C i en termisk blandare (materialförteckning).
- Späd sonderna till en slutlig koncentration på 125 nM för vingdiskar och 200 nM för vuxna muskler i hybridiseringsbufferten och tillsätt den primära antikroppen.
OBS: Antikroppsutspädningen varierar beroende på vilken specifik antikropp som används (Materialförteckning). Det är valfritt att lägga till antikroppar. Användare kan välja att avstå från proteinfärgning och istället använda ett liknande smFISH-protokoll som inte inkluderar tillsats av antikroppar. - Aspirera hybridiseringsbufferten och ersätt den med 100 μL hybridiseringsbuffert som innehåller sonden och antikroppen.
- Inkubera provexemplaren i mörker vid 37 °C i minst 16 timmar under omrörning av 300 varv per minut i en termisk blandare.
- Värm upp en alikvot buffert A vid 37 °C.
- Tvätta proverna i 3 x 10 minuter i termomixern vid 37 °C under 300 rpm omrörning.
- Under den sista tvätten späds sekundärantikroppen (1/200) och DAPI (1/10 000) i buffert A och proverna inkuberas i denna lösning vid 37 °C i minst 1 timme.
- Tvätta proverna i 3 x 20 min med buffert B (materialförteckning).
- Överför försiktigt proverna på ett objektglas, torka av den kvarvarande bufferten B och tillsätt 30 μL monteringsmedium och täck med en 18 x 18 mm täckglas. Använd ett nagellack för att försegla preparatet.
- Förvara proverna i upp till 1 vecka vid 4 °C.
OBS: Det rekommenderas dock att utföra avbildningen så snart som möjligt för att undvika försämring av sondsignalen.
3. Bildbehandling
- Ta bilder med ett xyz-insamlingsläge med hjälp av ett konfokalmikroskop utrustat med 40x och 63x oljenedsänkningsobjektiv (Materialförteckning). smFISH-signalen detekteras av HyD-detektorn via ett fotonräkningsläge.
- Leta reda på samples med hjälp av DAPI-signalen och UV lamp.
- För att avbilda vingskivassocierade muskelprogenitorer och IFM:er (figur 2 och figur 3), använd följande inställning för laserlinjer och emissionsfilter: välj DAPI (excitation (ex.) 405 nm, emission (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm) och Quasar 670 för smFISH-sonderna (ex. 647 nm, em. 670 nm).
- För att avbilda de vuxna MuSC (Figur 2D), använd följande inställning för laserlinjer och emissionsfilter: välj DAPI (ex. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm) och Quasar 670 för smFISH-sonderna (ex. 647 nm, em. 670 nm).
OBS: För avbildningen kan våglängderna anpassas efter de färgämnen som är associerade med sekundära antikroppar och sonder. - Spara de konfokala bilderna som . TIFF-filer.
4. Analys efter avbildning
- För att komma igång, starta ImageJ och navigera till menyn Plugins . Därifrån väljer du Makron | Redigera för att öppna makrots källkod.
OBS: Detta gör det möjligt att justera parametrarna efter behov, och vid behov ändra mappkatalogen för varje kanal i makrots källkod. - För att följa detta protokoll och kvantifiera Mef2 smFISH-fläckar i larver, använd följande inställningar: Log_radius = 3,0 och Log_quality = 20,0. Segement Mef2-positiva kärnor med oskärpa = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
- I muskelfibrer, använd följande parametrar: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; oskärpa = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
- För att initiera makrot, kör helt enkelt körkommandot och vänta tills makrot automatiskt laddar alla bilder från den angivna mappen och kvantifierar dem på ett sekventiellt sätt.
OBS: Observera att varaktigheten för denna process kan variera från några sekunder till flera timmar, beroende på mängden data som analyseras. - Leta efter resultaten som visas i två nya .csv-filer: file_FISH_results och file_nuclei_results. Den första visar antalet transkriptionsplatser och deras genomsnittliga och maximala intensitet. Den andra ger både det totala antalet kärnor och antalet fläckar inuti varje kärna.
Representative Results
I detta protokoll använde vi kommersiellt producerade prober riktade mot Mef2 och zfh1 mRNA. Vi designade sonderna med tillverkarens FISH-sonddesigner (Table of Materials). Mef2-uppsättningen riktar sig mot de exoner som är gemensamma för alla Mef2 RNA-isoformer (från exon 3 till exon 10). zfh1-uppsättningen riktar sig mot den tredje exonen som är gemensam för både zfh1-RB och zfh1-RE isoformer10. Båda sonderna är konjugerade till det fluorescerande färgämnet Quasar 670.
Vi genererade ett makro internt som var kompatibelt med ImageJ-programvaran för att automatiskt analysera rådata .tif data. Makrot tillåter 3D-segmentering av kärnorna av Cellpose26 med Fiji-pluginet BIOP och transkriptionell spotkvantifiering av en Laplacian av Gaussian som implementerats i Trackmate-plugin27. MorpholibJ plugin28 används för efterbehandling (Supplemental File 1).
Som ett första steg utförde vi smFISH på imaginära vingskivor, där Mef2 och zfh1 är kända för att uttryckas i AMPs. Dessa data visar att båda transkripten är enhetligt detekterade i AMPs-populationen som färgats med antingen Mef2- eller Zfh1-antikroppar (Figur 2A,B). Aktiva transkriptionsställen (TS) kan avslöjas och särskiljas från mogna mRNA av smFISH eftersom de tenderar att vara större och ha mer intensiva signaler än enskilda cytoplasmatiska transkript eller mogna nukleära transkript. Konsekvent skiljer högre förstoringar av AMP mellan TS-foci och moget mRNA spridda i cytoplasman (Figur 2A',B'), vilket validerar känsligheten hos detta smFISH-protokoll. Det bör dock nämnas att vi observerade en aktiv TS per kärna för både zfh1 och Mef2 (Figur 2A',B'). Dessa data validerar ytterligare noggrannheten i sonddesignen eftersom transkriptionsmönstren Mef2 och zfh1 i AMP:erna samlokaliseras med detektionen av deras respektive proteiner (figur 2).
I ett andra steg undersökte vi transkriptionsstället och distributionen av Mef2- och zfh1-mRNA i differentierade IFM:er hos vuxna och associerade stamceller (Figur 2C,D). Dessa data illustrerar tydligt Mef2 TS i syncytialmuskelkärnorna och Mef2 mRNA-distribution i hela cytoplasman (Figur 2C,C'). Zfh1 markerar specifikt MuSCs population10,11. Med hjälp av detta smFISH-protokoll lyckades vi detektera zfh1-transkription i MuSCs markerade med Zfh1-Gal4 > GFP-uttryck. Högre förstoring illustrerar detektionen av både zfh1 TS och cytoplasmatiska enkla mRNA (Figur 2D').
Slutligen använde vi vårt egenbyggda ImageJ-makro för att kvantitativt analysera Mef2-transkriptionsdynamik och rumslig fördelning. Beräkningspipelinen kan effektivt detektera och segmentera Mef2-fläckar och muskelkärnor (figur 3A-C). På grund av problem med signal-brusförhållandet kan det dock hända att vissa fläckar inte upptäcks i vissa fall (figur 3A',B'). Vi använde denna automatiserade metod för att undersöka om Mef2 mRNA-förekomsten varierar mellan muskelprekursorceller (AMP) och differentierade IFM:er hos vuxna. Vår analys visar att antalet Mef2 mRNA per cellkärna i vuxna IFM och AMP inte skiljer sig signifikant åt (Figur 3D).
För att få insikt i den rumsliga fördelningen av Mef2-transkript i vuxna IFM-muskler kvantifierade vi fraktionen av cytoplasmatiska kontra nukleära Mef2 mRNA-fläckar (Figur 3E,F). Med hjälp av vårt program räknade vi både det totala antalet Mef2 mRNA-fläckar och antalet Mef2 mRNA-fläckar som överlappar med kärnfärgning (Mef2). Subtrahering av det kärnassocierade mRNA:t från det totala mRNA-antalet ger antalet cytoplasmatiska mRNA-fläckar. Våra resultat visar att cirka 92 % av Mef2 mRNA finns i cytoplasman, medan de återstående 8 % är associerade med muskelkärnor, som visas i figur 3E,F.
Figur 1: Procedur för att dissekera och förbereda vingskivor och IFM-prover för smFISH. A) L3-larver i stadieindelning. (B) Dissekerad och inverterad främre ände av larven. Pilar indikerar vingskivorna. (C) Isolerad vingskiva. (D) Dissekerade vuxna bröstkorgar. (E) Vuxen bröstkorg orienterad på ett dubbelhäftande band före bisektion (streckad linje). (F) Hemithorax hos vuxna. g) Isolerade IFM:er. (H) Arbetsflöde för smFISH-protokollet. Förkortningar: IFMs = indirect flight muscles; smFISH = RNA-fluorescens in situ-hybridisering med en enda molekyl; EtOH = etanol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder av Mef2 och zfh1 smFISH i vingskivor och vuxna IFM. (A,B) Mef2 och zfh1 mRNA (lila) detekteras likformigt i AMPs och samlokaliseras med (A,A') Mef2 respektive (B,B') Zfh1-proteiner (gröna). (A'',B'') Högre förstoring av AMP. (C) Mef2-mRNA och Mef2-protein påvisas i IFM hos vuxna. (C') Högre förstoring av det inramade området i C. (D) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP-uttryck (grönt) etiketter för vuxna MuSC. zfh1 RNA detekteras i vuxna MuSC. (D') Högre förstoring av det inramade området i D. Zfh1-transkriptionsstartställen och enstaka mRNA indikeras med pilar respektive pilspetsar. DAPI-färgning (blå). Skalstreck = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Förkortningar: IFMs = indirect flight muscles; smFISH = RNA-fluorescens in situ-hybridisering med en enda molekyl; AMP = vuxna muskelstamfäder; MuSC = muskelstamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering av Mef2-transkription och cytoplasmatisk mRNA-ackumulering med smFISH. (A) Fördelning av Mef2-transkript (lila) och Mef2-protein (grönt) i vildtyps-IFM hos vuxna. (A') Högre förstoring av boxat område i A. Transkriptionens startplatser och enskilda mRNA indikeras med pilar respektive pilspetsar. (B,C) Automatisk Mef2-spotsökning och nukleär segmentering. Cytoplasmatiska och nukleära Mef2-mRNA indikeras i grönt respektive magenta. (B',C') Högre förstoringar av inramade områden i B och C. Asterisker anger punkter som inte räknas av makrot. (D) Exempel på Mef2-punktkvantifiering i AMP och IFM för vuxna, i förhållande till det totala antalet kärnor. (p = 0,0785, Students t-test, vingskivor (n = 4), IFM (n = 11)). (E) Exempel på kvantifiering av Mef2-spotfördelning i IFM för vuxna. (*** p< 0,0007, Studentens t-test, n = 5). (F) Procentandel Mef2 mRNA-fläckar som detekteras inuti och utanför kärnorna (n = 5). Skalstreck = 10 μm (A,A'). Förkortningar: IFMs = indirect flight muscles; smFISH = RNA-fluorescens in situ-hybridisering med en enda molekyl; AMPs = vuxna muskelstamfäder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Makro som används för efterbehandling. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Tillämpningen av smFISH-metoden har blivit populär på senare tid, och dess användning sträcker sig till olika celltyper och modellorganismer. Men när det gäller Drosophila kommer majoriteten av kunskapen om genuttryck för vuxna muskler från molekylära bulkanalyser, som inte ger kvantitativ information om den exakta rumsliga placeringen av mRNA-molekyler. För att ta itu med detta gap har vi optimerat en metod för att utföra smFISH på muskelprekursorceller och vuxna Drosophila-muskler . Detta tillvägagångssätt har anpassats från ett tidigare publicerat protokoll23 och optimerats för Drosophilas muskelvävnader.
Det största hindret för att få högkvalitativa smFISH-bilder är tjockleken på vuxna muskler, vilket hindrar optimal penetration av sonder. Därför är det viktigt att separera de vuxna musklerna från djurets andra vävnader och utföra hybridiseringsprocessen med mild omrörning. Detta speciella steg säkerställer effektiv permeabilisering av vävnaderna.
En annan kritisk aspekt är att signal-brusförhållandet kan göra att beräkningspipelinen misslyckas med att detektera vissa mRNA-fläckar. Vi fann att en ökning av signal-brusförhållandet kan uppnås genom att hitta den optimala koncentrationen av sonder. Den optimala utspädningen kan variera beroende på sammansättningen av varje sonduppsättning, inklusive det konjugerade färgämnet och oligonukleotidsammansättningen. Vi rekommenderar att du provar olika spädningar; En slutlig utspädning på 200 nM gav det bästa signal-brusförhållandet för vuxna vävnader i dessa experiment.
Med smFISH-metoden är det möjligt att kvantifiera antalet nysyntetiserade RNA vid TS-härdarna. När en gen transkriberas aktivt produceras flera begynnande RNA samtidigt vid TS. Som ett resultat kommer TS:s intensitet att överträffa den för moget cytoplasmatiskt RNA, och denna funktion, i kombination med dess kärnlokalisering, kan skilja TS från enskilda cytoplasmatiska RNA. I samband med muskelbiologi är TS-detektion och kvantifiering särskilt viktig för att bestämma synkroniseringen av transkriptionen av en specifik gen bland muskelkärnor inom samma syncytium. Denna beräkningspipeline är dock inte utformad för att skilja mellan cytoplasmatiska mRNA- och TS-signaler. Som ett alternativ föreslår vi att man kombinerar denna smFISH-metod med andra väletablerade smFISH-analysverktyg, såsom BayFISH eller FISH-quant29,30. Dessa verktyg har visat sig underlätta automatiserad segmentering och fluorescensintensitetsberäkningar av RNA-aggregat med anmärkningsvärd precision.
Slutligen, medan smFISH detekterar mRNA-molekyler med hög rumslig upplösning, är den begränsad till att analysera ett litet antal mRNA samtidigt. Flerskaliga metoder som merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) möjliggör samtidig analys av ett stort antal olika mRNA31. Genom att kombinera oligonukleotidprober och felrättande koder underlättar denna metod detektion av hundratals RNA-arter i enskilda celler.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi tackar Alain Vincent för hans kritiska läsning av manuskriptet. Vi tackar Ruth Lehmann för att ha tillhandahållit Zfh1-antikroppen. Vi tackar Stephanie Dutertre och Xavier Pinson för konfokalmikroskopi vid MRic Imaging Platform. EL stöds av ett doktorandstipendium från ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA stöds av AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP finansieras av ett Chan Zuckerberg Initiative DAF-bidrag till T.P. (2019-198009). HB stöds av CNRS, Atip Avenir-programmet och AFM-Telethon trampolinbidrag 23108.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
References
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
- Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
- Bothe, I., Baylies, M. K.
- Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
- Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
- Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
- Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
- Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
- Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
- Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
- Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
- Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
- Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
- Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
- Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
- Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
