Summary
Drosophila er en veletablert modell for å studere nøkkelmolekyler som regulerer myogenese. Imidlertid er dagens metoder utilstrekkelige til å bestemme mRNA-transkripsjonsdynamikk og romlig fordeling innen syncyti. For å løse denne begrensningen optimaliserte vi en RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetode som tillater deteksjon og kvantifisering av mRNA på en enkeltmolekylskala.
Abstract
Skjelettmuskler er store syncytier som består av mange buntet myofibre som produserer krefter og muliggjør kroppsbevegelse. Drosophila er en klassisk modell for å studere muskelbiologi. Kombinasjonen av både Drosophila-genetikk og avanserte omics-tilnærminger førte til identifisering av viktige konserverte molekyler som regulerer muskelmorfogenese og regenerering. Imidlertid kan transkripsjonsdynamikken til disse molekylene og den romlige fordelingen av deres messenger RNA i syncytien ikke vurderes ved konvensjonelle metoder. Her optimaliserte vi en eksisterende enkeltmolekylær RNA-fluorescens in situ hybridisering (smFISH) metode for å muliggjøre deteksjon og kvantifisering av individuelle mRNA-molekyler i voksne flymuskler og deres muskelstamceller. Som et bevis på konsept har vi analysert mRNA-uttrykket og distribusjonen av to evolusjonære konserverte transkripsjonsfaktorer, Mef2 og Zfh1 / Zeb. Vi viser at denne metoden effektivt kan påvise og kvantifisere enkle mRNA-molekyler for både transkripsjoner i muskelforløperceller, voksne muskler og muskelstamceller.
Introduction
Voksne skjelettmuskler er laget av differensierte multinukleerte myofibre hvis kontraktile egenskaper genererer bevegelser. Muskelvekst, vedlikehold og regenerering er avhengig av muskelforfedre og muskelstamceller (MuSC) som er spesifisert under embryonal utvikling1. Det myogene programmet styres fint av et sett med myogene kjernetranskripsjonsfaktorer (TF) (f.eks. Pax3/7, MYOD, Mef2 og ZEB)2,3,4. Dechiffrering av molekylære mekanismer som regulerer muskelbiologi er viktig for å belyse grunnleggende myologirelaterte spørsmål og for mulig terapeutisk bruk i behandling av muskeldegenerative sykdommer.
Drosophila har en lang historie som en genetisk modell for å studere myogenese5. Det har nylig dukket opp som en ny modell for å undersøke muskelregenerering 6,7,8. Muskelstrukturen og kjernemyogene programmer er svært konservert mellom fluer og pattedyr. For eksempel har TFene Mef2 og Zfh1/ZEB en konservert funksjon i regulering av muskelutvikling og regenerering 3,9,10,11. Voksne Drosophila-muskler, som Indirect Flight Muscles (IFM), dannes fra en spesifikk populasjon av MuSCs, kjent som Adult Muscle Progenitors (AMPs)12. Disse forsterkerne er spesifisert under embryogenese og assosieres med epitelstrukturer som vinge- og benskiver. Gjennom embryonale stadier og larvestadier forblir AMPer udifferensierte til metamorfose når de engasjerer seg i differensiering og fusjon for å danne IFM13,14. TF Spalt major (spalt, salm) uttrykkes under utvikling av flymuskel og er nødvendig for å bestemme deres strukturelle identitet15. Mef2 er en annen viktig myogen TF som er avgjørende for voksen muskeldannelse16,17. Det uttrykkes i forsterkerne og opprettholdes i de voksne IFMene10,18. Mens flertallet av AMP-er skiller seg ut i funksjonelle muskler, unnslipper en delmengde differensiering og danner de voksne MuSC-ene11. I likhet med virveldyr er TF Zfh1/ZEB nødvendig for å forhindre for tidlig differensiering av de voksne MuSCene og for å opprettholde stammen 9,10.
Genekspresjonsdynamikk har vist seg å regulere ulike muskelbiologiske prosesser19,20. Fremkomsten av høy-gjennomstrømning enkeltcelle- og enkeltkjerner RNA-sekvenseringsteknikker har muliggjort en omfattende utforskning av disse transkripsjonsdynamikkene21,22. En bemerkelsesverdig begrensning av disse tilnærmingene er deres manglende evne til å gi den romlige fordelingen av mRNA-molekyler i de multinukleerte muskelfibrene. Disse egenskapene kan undersøkes ved enkeltmolekylfluorescens in situ hybridisering (smFISH) som avslører to typer mRNA-legemer: 1. Individuelle mRNA-molekyler spredt ut i cytoplasma og representerer det modne RNA og 2. Maksimalt to lyse nukleære foci tilsvarer den gryende transkripsjonen og avslører de transkripsjonelt aktive allelene23. Derfor er smFISH en metode som velges for individuell mRNA-molekylkvantifisering, undersøker deres romlige fordeling og gir øyeblikksbilder av gentranskripsjonsdynamikken.
SmFISH-metoden er avhengig av et sett med korte fluorescerende oligonukleotidprober som er spesielt designet for å være komplementære til måltranskripsjonen. Ved glødning genererer den punktkilder med høy intensitet som tillater deteksjon av mRNA på et enkeltmolekylnivå ved bruk av konfokalmikroskopi24. Denne metoden brukes i økende grad for et bredt spekter av celletyper, inkludert pattedyrmuskelvev 19,20. Imidlertid, i Drosophila som andre dyremodeller, er det meste av kunnskapen om voksen muskelgenuttrykk avledet fra bulkmolekylære analyser, som mangler kvantitativ informasjon om den romlige plasseringen av mRNA-molekyler. Her optimaliserte vi en metode for å utføre smFISH på muskelforløperceller og voksne Drosophila-muskler 23,25. Denne protokollen inkluderer en helautomatisk analyserørledning for kjernesegmentering og mRNA-telling og lokalisering.
Protocol
1. Vingeskive og voksen muskeldisseksjon og forberedelse
MERK: Rydd opp disseksjonsbenken og alle disseksjonsinstrumentene med RNAse-inhibitorløsning (materialfortegnelse). Laboratoriehansker skal brukes under hele eksperimentelle prosedyren.
- Vingeskive
- Plasser L3-iscenesatte larver i kaldt 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (figur 1A).
- Skyll larvene 3x med 1x PBS og hold dem i denne løsningen i 5 min.
- Bruk to par skarpe tang, hold larven fra den fremre delen og trekk og kast resten av kroppsvevet (rundt 2/3).
- Hold både den første 1/3 av larven med ett par tang og munnkrokene med det andre paret. Trekk munnkrokene inn i larven til den er helt invertert.
MERK: Dissekere ca. 30 larver per forsøk, for å sikre tilstrekkelig prøvestørrelse for analyse. - Legg merke til at vingeskivene er nært forbundet med de to primære grenene av luftrøret, som går langs hver side av larven.
- Fjern alle de andre larvekomponentene (benskiver og hjerne) for å få et rent, omvendt larvekadaver med et par vingeskiver festet til luftrøret (figur 1B).
- Plasser prøvene i et 1 ml sentrifugerør og fest dem i 4% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i 1x PBS i 45 minutter ved romtemperatur under omrøring.
MERK: Prøveomrøringen oppnås ved hjelp av en oscillerende omrører (materialfortegnelse). - Vask prøvene 3 x 5 min med 70 % etanol (EtOH, fortynnet i RNAse-fritt vann) og oppbevar dem i samme vaskeoppløsning ved 4 °C i minst 2 dager og opptil 1 uke.
- Indirekte flymuskler
- Bedøv de voksne fluene på en CO2 fluepute og fjern hodene, magen, bena og vingene.
- Plasser de dissekerte brystkassene i kald 1x PBS og fortsett å gjøre det til alle prøvene er dissekert (figur 1D).
- Prefiks thoraxene i 4% PFA, (1% Triton) i 20 minutter ved romtemperatur under omrøring.
- Skyll prøvene 3 x 5 min med 1x PBT vaskeoppløsning (1% Triton i 1x PBS).
- Plasser brystaksene på en dobbeltsidig tape (materialfortegnelse) på et glassglass og kryss dem med et skarpt mikrotomblad for å produsere to hemi-thoraces (figur 1E, F).
- Fest prøvene i 4% PFA (1% Triton) i 45 min ved romtemperatur under omrøring.
- Vask 2 x 20 min med 1x PBT vaskeoppløsning (1% Triton, 1x PBS) ved romtemperatur under omrøring.
- Plasser hemi-thoraces i kald 1x PBS og bruk tangen til å forsiktig isolere IFM fra hemi-thorace (figur 1G).
NOTAT: For å oppnå dette er det viktig å fjerne neglebåndet så grundig som mulig. - For å permeabilisere prøvene, oppbevar de isolerte IFM-ene i 70 % EtOH-oppløsning i minst 2 dager og opptil 1 uke ved 4 °C.
MERK: Isoler IFM-ene fra ca. 10 brystakser per eksperiment for å sikre tilstrekkelig prøvestørrelse for analyse.
2. Hybridisering, immunfarging og montering
MERK: Lignende hybridiseringsprosedyre brukes for både vingeskiver og IFM-prøver. Det er viktig å isolere vingeskivene fra larvekroppene og sette dem i 200 μL buffer A før hybridiseringen starter.
- Resuspender sondene i 400 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) for en endelig stamløsning på 12,5 μM.
- Overfør prøvene til et 0,5 ml sentrifugerør som inneholder buffer A (materialfortegnelse).
NOTAT: Ved å redusere beholderens volum blir det lettere å visualisere prøvene og unngå å miste dem under vaskeprosessen. - Vask prøvene 2 x 20 min med buffer A.
- Aspiratbuffer A, erstatt den med 400 μL hybridiseringsbuffer (materialfortegnelse), og prehybridiser prøvene i 30 minutter ved 37 °C i en termisk mikser (materialfortegnelse).
- Fortynn sondene til en endelig konsentrasjon på 125 nM for vingeskiver og 200 nM for voksne muskler, i hybridiseringsbufferen og tilsett det primære antistoffet.
MERK: Antistofffortynningen varierer avhengig av det spesifikke antistoffet som brukes (materialfortegnelse). Tilsetning av antistoffer er valgfritt. Brukere kan velge å avstå fra proteinfarging og i stedet bruke en lignende smFISH-protokoll som ikke inkluderer tilsetning av antistoffer. - Aspirer hybridiseringsbufferen og erstatt den med 100 μL hybridiseringsbuffer som inneholder sonden og antistoffet.
- Inkuber prøvene i mørket ved 37 °C i minst 16 timer under omrøring ved 300 o/min i en termisk mikser.
- Varm opp en alikot buffer A ved 37 °C.
- Vask prøvene i 3 x 10 min under omrøring ved 37 °C under 300 o/min.
- Under siste vask fortynnes sekundært antistoff (1/200) og DAPI (1/10 000) i buffer A og inkuberer prøvene i denne oppløsningen ved 37 °C i minst 1 time.
- Vask prøvene i 3 x 20 min med buffer B (materialfortegnelse).
- Overfør prøvene forsiktig på et mikroskoplysbilde, tørk av den gjenværende bufferen B, og tilsett 30 μL monteringsmedium, og dekk med et deksel på 18 x 18 mm. Bruk neglelakk for å forsegle preparatet.
- Oppbevar prøvene i opptil 1 uke ved 4 °C.
MERK: Det anbefales imidlertid å utføre avbildningen så snart som mulig for å unngå forringelse av sondesignalet.
3. Bildebehandling
- Skaff bilder med en xyz-oppkjøpsmodus ved hjelp av et konfokalmikroskop utstyrt med 40x og 63x oljenedsenkingsmål (materialfortegnelse). SmFISH-signalet detekteres av HyD-detektoren via en fotontellingsmodus.
- Finn prøvene ved hjelp av DAPI-signalet og UV-lampen.
- For å avbilde vingeskiveassosierte muskelprogenitorer og IFM (figur 2 og figur 3), bruk følgende oppsett for laserlinjer og emisjonsfiltre: velg DAPI (eksitasjon (eks.) 405 nm, emisjon (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), og Quasar 670 for smFISH-sondene (eks. 647 nm, em. 670 nm).
- For å avbilde de voksne MuSC-ene (figur 2D), bruk følgende oppsett for laserlinjer og utslippsfiltre: velg DAPI (f.eks. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (eks. 555 nm, em. 565 nm), og Quasar 670 for smFISH-sondene (eks. 647 nm, em. 670 nm).
MERK: For avbildningen kan bølgelengdene tilpasses i henhold til fargestoffene forbundet med sekundære antistoffer og sonder. - Lagre de konfokale bildene som . TIFF-filer.
4. Post bildeanalyse
- For å komme i gang, start ImageJ og naviger til Plugins-menyen . Derfra velger du Makroer | Rediger for å åpne makrokildekoden.
Dette gjør det mulig å justere parameterne etter behov, og om nødvendig endre mappekatalogen for hver kanal i makroens kildekode. - For å følge denne protokollen og kvantifisere Mef2 smFISH-flekker i larver, bruk følgende innstillinger: Log_radius = 3,0 og Log_quality = 20,0. Segement Mef2-positive kjerner med uskarphet = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
- I muskelfibre, bruk følgende parametere: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; uskarphet = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
- For å starte makroen, utfør ganske enkelt kjør-kommandoen og vent på at makroen automatisk laster alle bilder fra den angitte mappen og kvantifiserer dem på en sekvensiell måte.
MERK: Vær oppmerksom på at varigheten av denne prosessen kan variere fra noen få sekunder til flere timer, avhengig av volumet av data som analyseres. - Se etter resultatene som vises i to nye .csv filer: file_FISH_results og file_nuclei_results. Den første viser antall transkripsjonspunkter og deres gjennomsnittlige og maksimale intensiteter. Den andre gir både totalt antall kjerner og antall flekker inne i hver kjerne.
Representative Results
I denne protokollen brukte vi kommersielt produserte sonder rettet mot Mef2 og zfh1 mRNA. Vi designet sondene sammen med produsentens FISH-sondedesigner (Table of Materials). Mef2-settet retter seg mot eksonene som er felles for alle Mef2 RNA-isoformer (fra ekson 3 til ekson 10). Zfh1-settet retter seg mot det tredje eksonet som er felles for både zfh1-RB og zfh1-RE isoformer10. Begge sondene er konjugert til Quasar 670 fluorescerende fargestoff.
Vi genererte en makro internt som var kompatibel med ImageJ-programvaren for automatisk å analysere rå .tif data. Makroen tillater 3D-segmentering av kjernene av Cellpose26 med Fiji plugin BIOP og transkripsjonell spot kvantifisering av en laplacian av Gaussian som implementert i Trackmate plugin27. MorpholibJ plugin28 brukes til etterbehandling (tilleggsfil 1).
Som et første skritt utførte vi smFISH på vingebildeskiver, hvor Mef2 og zfh1 er kjent for å bli uttrykt i AMP-ene. Disse dataene viser at begge transkripsjonene er ensartet detektert i AMP-populasjonen sammen farget med enten Mef2- eller Zfh1-antistoffer (figur 2A,B). Aktive transkripsjonssteder (TS) kan avsløres og skilles fra modent mRNA ved smFISH, da de pleier å være større og har mer intense signaler enn individuelle cytoplasmatiske transkripsjoner eller modne nukleære transkripsjoner. Konsekvent skiller høyere forstørrelser av AMP-er mellom TS-foci og modent mRNA spredt i cytoplasma (figur 2A', B'), og validerer sensitiviteten til denne smFISH-protokollen. Det bør imidlertid nevnes at vi observerte én aktiv TS per kjerne for både zfh1 og Mef2 (figur 2A',B'). Disse dataene validerer nøyaktigheten av sondedesignet ytterligere, siden Mef2- og zfh1-transkripsjonsmønstre i AMP-ene samlokaliserer med deteksjonen av deres respektive proteiner (figur 2).
I et andre trinn undersøkte vi transkripsjonsstedet og distribusjonen av Mef2 og zfh1 mRNA i differensierte voksne IFM og tilhørende stamceller (figur 2C, D). Disse dataene illustrerer tydelig Mef2 TS i syncytiale muskelkjerner og Mef2 mRNA-fordeling gjennom cytoplasma (figur 2C,C'). Zfh1 markerer spesifikt MuSCs befolkning10,11. Ved hjelp av denne smFISH-protokollen oppdaget vi vellykket zfh1-transkripsjon i MuSCs merket med Zfh1-Gal4 > GFP-uttrykk. Høyere forstørrelse illustrerer påvisning av både zfh1 TS og cytoplasmatiske enkelt-mRNA (figur 2D').
Til slutt brukte vi vår egenbygde ImageJ-makro til kvantitativt å analysere Mef2-transkripsjonsdynamikk og romlig fordeling. Beregningspipelinen kan effektivt oppdage og segmentere Mef2-flekker og muskelkjerner (figur 3A-C). På grunn av problemer med signal-støy-forholdet kan det imidlertid hende at enkelte flekker ikke oppdages i visse tilfeller (figur 3A', B'). Vi brukte denne automatiserte metoden for å undersøke om Mef2 mRNA-overflod varierer mellom muskelforløperceller (AMP) og differensierte voksne IFM-er. Vår analyse viser at antall Mef2 mRNA per kjerner i voksne IFM og AMPene ikke er signifikant forskjellige (figur 3D).
For å få innsikt i den romlige fordelingen av Mef2-transkripter i voksne IFM-muskler, kvantifiserte vi fraksjonen av cytoplasmatiske versus nukleære Mef2 mRNA-flekker (figur 3E,F). Ved hjelp av vårt program telte vi både det totale antallet Mef2 mRNA-flekker og antall Mef2 mRNA-flekker overlappende med kjernefarging (Mef2). Subtrahering av kjerneassosiert mRNA fra det totale mRNA-tallet gir antall cytoplasmatiske mRNA-flekker. Våre funn viser at omtrent 92% av Mef2 mRNA er tilstede i cytoplasma, mens de resterende 8% er assosiert med muskelkjerner, som vist i figur 3E, F.
Figur 1: Prosedyre for dissekering og klargjøring av vingeskiver og IFM-prøver for smFISH. (A) L3 iscenesatte larver. (B) Dissekert og omvendt fremre ende av larven. Pilene angir vingeskivene. (C) Isolert vingeskive. (D) Dissekerte voksne thoraxer. (E) Voksen thorax orientert på dobbeltsidig tape før biseksjon (stiplet linje). (F) Voksen hemithorax. (g) Isolerte IFM-er. (H) Arbeidsflyt av smFISH-protokollen. Forkortelser: IFM = indirekte flygemuskler; smFISH = enkeltmolekyl RNA-fluorescens in situ hybridisering; EtOH = etanol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av Mef2 og zfh1 smFISH i vingeskiver og voksne IFM. (A,B) Mef2 og zfh1 mRNA (lilla) detekteres jevnt i AMPs og samlokaliseres med (A,A') Mef2 og (B,B') Zfh1 proteiner (grønn), henholdsvis. (A'',B'') Høyere forstørrelse av forsterkerne. (C) Mef2 mRNA og Mef2 protein påvises i voksne IFM. (C') Høyere forstørrelse av det boksede området i C. (D) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP-uttrykk (grønn) merker MuSC-er for voksne. ZFH1 RNA påvises i MuSC hos voksne. (D') Høyere forstørrelse av boksområdet i D. Zfh1-transkripsjonsstartsteder og enkle mRNA er indikert med henholdsvis piler og pilspisser. DAPI-farging (blå). Skalastenger = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Forkortelser: IFM = indirekte flygemuskler; smFISH = enkeltmolekyl RNA-fluorescens in situ hybridisering; AMPs = voksne muskelprogenitorer; MuSCs = muskelstamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av Mef2-transkripsjon og cytoplasmatisk mRNA-akkumulering av smFISH. (A) Distribusjon av Mef2-transkripsjoner (lilla) og Mef2-protein (grønn) i villtype voksne IFM. (A') Høyere forstørrelse av boksområdet i A. Transkripsjonsstartsteder og enkle mRNA er indikert med henholdsvis piler og pilspisser. (B,C) Automatisk Mef2 flekker funn og kjernefysisk segmentering. Cytoplasmatiske og nukleære Mef2 mRNA er indikert i henholdsvis grønt og magenta. (B',C') Høyere forstørrelser av bokseområder i B og C. Stjerner angir flekker som ikke telles av makroen. (D) Eksempel på Mef2-spotkvantifisering i AMP-er og voksne IFM-er, i forhold til det totale antallet kjerner. (p = 0,0785, Student t-test, vingeskiver (n = 4), IFM (n = 11)). (E) Eksempel på kvantifisering av Mef2 spotfordeling i voksne IFM. (*** s< 0,0007, Student t-test, n = 5). (F) Prosentandel av Mef2 mRNA-flekker oppdaget i og utenfor kjernene (n = 5). Skalastenger = 10 μm (A,A'). Forkortelser: IFM = indirekte flygemuskler; smFISH = enkeltmolekyl RNA-fluorescens in situ hybridisering; AMPs = voksne muskelprogenitorer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Makro brukt til etterbehandling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Anvendelsen av smFISH-metoden har blitt populær i nyere tid, og bruken omfatter ulike celletyper og modellorganismer. Imidlertid, når det gjelder Drosophila, er flertallet av kunnskap om voksen muskelgenuttrykk avledet fra bulkmolekylære analyser, som ikke gir kvantitativ informasjon om den nøyaktige romlige plasseringen av mRNA-molekyler. For å løse dette gapet har vi optimalisert en metode for å utføre smFISH på muskelforløperceller og voksne Drosophila-muskler . Denne tilnærmingen er tilpasset fra en tidligere publisert protokoll23 og optimalisert for Drosophila muskelvev.
Det største hinderet for å oppnå smFISH-bilder av høy kvalitet er tykkelsen på voksne muskler, noe som hindrer optimal penetrasjon av sonder. Derfor er det avgjørende å skille de voksne musklene fra de andre vevene i dyret og utføre hybridiseringsprosessen med mild omrøring. Dette bestemte trinnet sikrer effektiv permeabilisering av vevet.
Et annet kritisk aspekt er at signal-støy-forholdet kan føre til at beregningsrørledningen mislykkes i å oppdage visse mRNA-flekker. Vi fant at å øke signal-støy-forholdet kan oppnås ved å finne den optimale konsentrasjonen av sonder. Den optimale fortynningen kan variere avhengig av sammensetningen av hvert sondesett, inkludert det konjugerte fargestoffet og oligonukleotidsammensetningen. Vi anbefaler å prøve forskjellige fortynninger; en endelig fortynning på 200 nM ga det beste signal-støy-forholdet for voksent vev i disse forsøkene.
Med smFISH-metoden er det mulig å kvantifisere antall nylig syntetiserte RNA ved TS-foci. Når et gen transkriberes aktivt, produseres flere begynnende RNA samtidig ved TS. Som et resultat vil TSs intensitet overgå den for modent cytoplasmatisk RNA, og denne funksjonen, kombinert med dens nukleære lokalisering, kan skille TS fra individuelle cytoplasmatiske RNAer. I sammenheng med muskelbiologi er TS-deteksjon og kvantifisering spesielt viktig for å bestemme synkroniseringen av transkripsjon av et spesifikt gen mellom muskelkjerner i samme syncytium. Imidlertid er denne beregningsrørledningen ikke designet for å skille mellom cytoplasmatiske mRNA- og TS-signaler. Som et alternativ foreslår vi å kombinere denne smFISH-metoden med andre veletablerte smFISH-analyseverktøy, som BayFISH eller FISH-quant29,30. Disse verktøyene har vist seg å lette automatiserte segmenterings- og fluorescensintensitetsberegninger av RNA-aggregater med bemerkelsesverdig presisjon.
Til slutt, mens smFISH oppdager mRNA-molekyler med høy romlig oppløsning, er det begrenset til å analysere et lite antall mRNA samtidig. Multiskalametoder som merFISH (multiplexed error-robust fluorescens in situ hybridisering) muliggjør samtidig analyse av et stort antall forskjellige mRNA31. Ved å kombinere oligonukleotidprober og feilkorrigerende koder, letter denne metoden påvisning av hundrevis av RNA-arter i enkeltceller.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker Alain Vincent for hans kritiske lesning av manuskriptet. Vi takker Ruth Lehmann for å gi Zfh1 antistoff. Vi anerkjenner hjelpen fra Stephanie Dutertre og Xavier Pinson for konfokalmikroskopi ved MRic Imaging Platform. EL støttes av PhD-stipend fra ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA er støttet av AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP er finansiert av et Chan Zuckerberg Initiative DAF-tilskudd til TP (2019-198009). HB støttes av CNRS, Atip Avenir-programmet og AFM-Telethon trampolinetilskudd 23108.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
References
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
- Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
- Bothe, I., Baylies, M. K.
- Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
- Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
- Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
- Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
- Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
- Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
- Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
- Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
- Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
- Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
- Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
- Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
- Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
