Summary
Drosophila is een gerenommeerd model voor het bestuderen van sleutelmoleculen die myogenese reguleren. De huidige methoden zijn echter onvoldoende om de mRNA-transcriptiedynamiek en ruimtelijke verdeling binnen syncytie te bepalen. Om deze beperking aan te pakken, optimaliseerden we een RNA-fluorescentie in situ hybridisatiemethode die de detectie en kwantificering van mRNA's op een schaal van één molecuul mogelijk maakt.
Abstract
Skeletspieren zijn grote syncytieën die bestaan uit vele gebundelde myovezels die krachten produceren en lichaamsbeweging mogelijk maken. Drosophila is een klassiek model om spierbiologie te bestuderen. De combinatie van zowel Drosophila-genetica als geavanceerde omics-benaderingen leidde tot de identificatie van belangrijke geconserveerde moleculen die spiermorfogenese en regeneratie reguleren. De transcriptionele dynamiek van deze moleculen en de ruimtelijke verdeling van hun boodschapper-RNA binnen de syncytie kunnen echter niet worden beoordeeld met conventionele methoden. Hier optimaliseerden we een bestaande single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) methode om de detectie en kwantificering van individuele mRNA-moleculen in volwassen vliegspieren en hun spierstamcellen mogelijk te maken. Als proof of concept hebben we de mRNA-expressie en -verdeling van twee evolutionair geconserveerde transcriptiefactoren, Mef2 en Zfh1/Zeb, geanalyseerd. We laten zien dat deze methode enkele mRNA-moleculen efficiënt kan detecteren en kwantificeren voor zowel transcripten in de spiervoorlopercellen, volwassen spieren als spierstamcellen.
Introduction
Volwassen skeletspieren zijn gemaakt van gedifferentieerde meerkernige myovezels waarvan de contractiele eigenschappen bewegingen genereren. Spiergroei, -onderhoud en -regeneratie zijn afhankelijk van spiervoorlopercellen en spierstamcellen (MuSC's) die tijdens de embryonale ontwikkeling worden gespecificeerd1. Het myogene programma wordt nauwkeurig gecontroleerd door een reeks myogene transcriptiefactoren (TF's) (bijv. Pax3/7, MYOD, Mef2 en ZEB)2,3,4. Het ontcijferen van de moleculaire mechanismen die de spierbiologie reguleren is belangrijk voor het ophelderen van fundamentele myologie-gerelateerde vragen en voor mogelijk therapeutisch gebruik bij de behandeling van spierdegeneratieve ziekten.
Drosophila heeft een lange geschiedenis als genetisch model om myogenese te bestuderen5. Het is onlangs naar voren gekomen als een nieuw model om spierregeneratiete onderzoeken 6,7,8. De spierstructuur en myogene kernprogramma's zijn sterk geconserveerd tussen vliegen en zoogdieren. De TF's Mef2 en Zfh1/ZEB hebben bijvoorbeeld een geconserveerde functie bij het reguleren van spierontwikkeling en -regeneratie 3,9,10,11. Volwassen Drosophila-spieren, zoals de Indirect Flight Muscles (IFM's), worden gevormd uit een specifieke populatie van MuSC's, bekend als Adult Muscle Progenitors (AMP's)12. Deze AMP's worden gespecificeerd tijdens de embryogenese en associëren zich met epitheelstructuren zoals vleugel- en beenschijven. Gedurende embryonale en larvale stadia blijven AMP's ongedifferentieerd tot metamorfose wanneer ze zich bezighouden met differentiatie en fusie om de IFM's te vormen13,14. De TF Spalt major (spalt, salm) komt tot expressie tijdens de ontwikkeling van de vliegspieren en is nodig om hun structurele identiteit te bepalen15. Mef2 is een andere belangrijke myogene TF die essentieel is voor de spiervorming bij volwassenen16,17. Het wordt uitgedrukt in de AMP's en gehandhaafd in de IFM'svoor volwassenen 10,18. Terwijl de meerderheid van de AMP's differentieert in functionele spieren, ontsnapt een subset aan differentiatie en vormt de volwassen MuSC's11. Net als bij gewervelde dieren is de TF Zfh1/ZEB nodig om voortijdige differentiatie van de volwassen MuSC's te voorkomen en hun stam te behouden 9,10.
Het is bewezen dat de dynamiek van genexpressie verschillende spierbiologische processen reguleert19,20. De komst van high-throughput single-cell en single-nuclei RNA-sequencingtechnieken heeft een uitgebreide verkenning van deze transcriptionele dynamiek mogelijk gemaakt21,22. Een opmerkelijke beperking van deze benaderingen is hun onvermogen om de ruimtelijke verdeling van mRNA-moleculen in de meerkernige spiervezels te bieden. Deze kenmerken kunnen worden onderzocht door middel van fluorescentie in situ hybridisatie met één molecuul (smFISH) die twee soorten mRNA-lichamen onthult: 1. Individuele mRNA-moleculen verspreid in het cytoplasma en vertegenwoordigen het volwassen RNA en 2. Maximaal twee heldere nucleaire brandpunten komen overeen met het ontluikende transcript en onthullen de transcriptioneel actieve allelen23. Daarom is smFISH een voorkeursmethode voor de kwantificering van individuele mRNA-moleculen, waarbij hun ruimtelijke verdeling wordt onderzocht en momentopnamen worden gemaakt van de gentranscriptiedynamiek.
De smFISH-methode is gebaseerd op een reeks korte fluorescerende oligonucleotidesondes die speciaal zijn ontworpen om complementair te zijn aan het doeltranscript. Bij het gloeien genereert het puntbronnen met hoge intensiteit die de detectie van mRNA op het niveau van één molecuul mogelijk maken met behulp van confocale microscopie24. Deze methode wordt in toenemende mate toegepast voor een breed scala aan celtypen, waaronder spierweefsel van zoogdieren19,20. In Drosophila, net als bij andere diermodellen, is de meeste kennis over genexpressie van volwassen spieren echter afgeleid van bulk moleculaire assays, die kwantitatieve informatie missen over de ruimtelijke locatie van mRNA-moleculen. Hier hebben we een methode geoptimaliseerd voor het uitvoeren van smFISH op spiervoorlopercellen en volwassen Drosophila-spieren 23,25. Dit protocol omvat een volledig geautomatiseerde analysepijplijn voor segmentatie van kernen en het tellen en lokaliseren van mRNA.
Protocol
1. Dissectie en voorbereiding van de vleugelschijf en de volwassen spier
NOTITIE: Reinig de dissectiebank en alle dissectie-instrumenten met RNAse-remmeroplossing (Materiaaltabel). Tijdens de hele experimentele procedure moeten laboratoriumhandschoenen worden gedragen.
- Vleugel schijf
- Plaats de L3 geënsceneerde larven in koude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (Figuur 1A).
- Spoel de larven 3x af met 1x PBS en bewaar ze 5 min in deze oplossing.
- Gebruik twee scherpe pincetten om de larve van het voorste deel vast te houden en de rest van de lichaamsweefsels (ongeveer 2/3) te trekken en weg te gooien.
- Houd zowel het eerste 1/3 van de larve vast met een pincet als de mondhaken met het andere paar. Trek de mondhaken in de larve terug totdat deze volledig omgekeerd is.
OPMERKING: Ontleed ongeveer 30 larven per experiment om ervoor te zorgen dat de steekproefomvang voldoende is voor analyse. - Merk op dat de vleugelschijven nauw verbonden zijn met de twee primaire takken van de luchtpijpen, die langs weerszijden van de larve lopen.
- Verwijder alle andere larvale componenten (beenschijven en hersenen) om een schoon omgekeerd larvale karkas te verkrijgen met een paar vleugelschijven die aan de luchtpijp zijn bevestigd (Figuur 1B).
- Plaats de monsters in een centrifugebuis van 1 ml en fixeer ze in 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in 1x PBS gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder roeren.
OPMERKING: Het schudden van het monster wordt bereikt door een oscillerende roerder (Tabel met materialen). - Was de monsters 3 x 5 min met 70% ethanol (EtOH, verdund in RNAse-vrij water) en bewaar ze in dezelfde wasoplossing bij 4 °C gedurende minimaal 2 dagen en maximaal 1 week.
- Indirecte vluchtspieren
- Verdoof de volwassen vliegen op een CO2 -vliegenkussen en verwijder de koppen, buik, poten en vleugels.
- Plaats de ontlede thoraxen in koude 1x PBS en blijf dit doen totdat alle monsters zijn ontleed (Figuur 1D).
- Voorvoegsel van de thoraxen in 4% PFA, (1% Triton) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder roeren.
- Spoel de monsters 3 x 5 min met 1x PBT-wasoplossing (1% Triton in 1x PBS).
- Plaats de thoraxen op een dubbelzijdige tape (Table of Materials) op een glasplaatje en snijd ze in tweeën met een scherp microtoommes om twee hemi-thoraces te produceren (Figuur 1E,F).
- Fixeer de monsters in 4% PFA (1% Triton) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur onder roeren.
- Was 2 x 20 min met 1x PBT-wasoplossing (1% Triton, 1x PBS) op kamertemperatuur onder roeren.
- Plaats de hemi-thoraces in koude 1x PBS en gebruik de pincet om de IFM's voorzichtig te isoleren van de hemi-thorace (Figuur 1G).
LET OP: Om dit te bereiken is het belangrijk om de nagelriem zo grondig mogelijk te verwijderen. - Om de monsters te permeabiliseren, moeten de geïsoleerde IFM's gedurende ten minste 2 dagen en maximaal 1 week bij 4 °C in 70% EtOH-oplossing worden bewaard.
OPMERKING: Isoleer de IFM's van ongeveer 10 thoraxen per experiment om te zorgen voor voldoende steekproefomvang voor analyse.
2. Hybridisatie, immunokleuring en montage
OPMERKING: Een vergelijkbare hybridisatieprocedure wordt toegepast voor zowel vleugelschijven als IFM-monsters. Het is van cruciaal belang om de vleugelschijven te isoleren van de larvale karkassen en ze in 200 μL buffer A te plaatsen voordat met de hybridisatie wordt begonnen.
- Resuspendeer de sondes in 400 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) voor een uiteindelijke voorraadoplossing van 12,5 μM.
- Breng de monsters over in een centrifugebuis van 0,5 ml met buffer A (materiaaltabel).
OPMERKING: Door het volume van de container te verkleinen, wordt het gemakkelijker om de monsters te visualiseren en te voorkomen dat ze verloren gaan tijdens het wasproces. - Was de monsters 2 x 20 min met Buffer A.
- Aspireer buffer A, vervang deze door 400 μL van de hybridisatiebuffer (materiaaltabel) en prehybridiseer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C in een thermische mixer (materiaaltabel).
- Verdun de sondes tot een eindconcentratie van 125 nM voor vleugelschijven en 200 nM voor volwassen spieren, in de hybridisatiebuffer en voeg het primaire antilichaam toe.
OPMERKING: De verdunning van het antilichaam varieert afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt (Materiaaltabel). Het toevoegen van antilichamen is optioneel. Gebruikers kunnen ervoor kiezen om af te zien van eiwitkleuring en in plaats daarvan een vergelijkbaar smFISH-protocol te gebruiken dat geen toevoeging van antilichamen omvat. - Zuig de hybridisatiebuffer op en vervang deze door 100 μL hybridisatiebuffer die de sonde en het antilichaam bevat.
- Incubeer de monsters in het donker bij 37 °C gedurende ten minste 16 uur onder 300 rpm roeren in een thermische mixer.
- Verwarm een hoeveelheid buffer A bij 37 °C.
- Was de monsters gedurende 3 x 10 minuten in de thermische mixer op 37 °C onder 300 rpm roeren.
- Verdun tijdens de laatste wasbeurt het secundaire antilichaam (1/200) en DAPI (1/10.000) in buffer A en incubeer de monsters in deze oplossing bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.
- Was de monsters gedurende 3 x 20 min met Buffer B (Tabel met materialen).
- Breng de monsters voorzichtig over op een microscoopglaasje, veeg de resterende buffer B weg, voeg 30 μL montagemedium toe en dek af met een dekglaasje van 18 x 18 mm. Gebruik een nagellak om het preparaat te verzegelen.
- Bewaar de monsters maximaal 1 week bij 4 °C.
NOTITIE: Het wordt echter aanbevolen om de beeldvorming zo snel mogelijk uit te voeren om verslechtering van het sondesignaal te voorkomen.
3. Beeldvorming
- Verkrijg beelden met een xyz-acquisitiemodus met behulp van een confocale microscoop die is uitgerust met 40x en 63x olie-immersieobjectieven (Tabel met materialen). Het smFISH-signaal wordt gedetecteerd door de HyD-detector via een fotonentelmodus.
- Lokaliseer de monsters met behulp van het DAPI-signaal en de UV-lamp.
- Om de met de vleugelschijf geassocieerde spiervoorlopercellen en IFM's in beeld te brengen (Figuur 2 en Figuur 3), past u de volgende opstelling toe voor laserlijnen en emissiefilters: selecteer DAPI (excitatie (bijv.) 405 nm, emissie (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm) en Quasar 670 voor de smFISH-sondes (bijv. 647 nm, em. 670 nm).
- Om de volwassen MuSC's in beeld te brengen (Afbeelding 2D), past u de volgende instelling toe voor laserlijnen en emissiefilters: selecteer DAPI (bijv. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm), en Quasar 670 voor de smFISH-sondes (ex. 647 nm, em. 670 nm).
OPMERKING: Voor de beeldvorming kunnen de golflengten worden aangepast aan de kleurstoffen die zijn geassocieerd met secundaire antilichamen en sondes. - Sla de confocale beelden op als . TIFF-bestanden.
4. Analyse na beeldvorming
- Start om te beginnen ImageJ en navigeer naar het menu Plug-ins . Selecteer daar Macro's | Bewerken om de broncode van de macro's te openen.
OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de parameters indien nodig aan te passen en, indien nodig, de mapmap voor elk kanaal binnen de broncode van de macro te wijzigen. - Om dit protocol te volgen en Mef2 smFISH-vlekken in larven te kwantificeren, gebruikt u de volgende instellingen: Log_radius = 3,0 en Log_quality = 20,0. Segement Mef2-positieve kernen met onscherpte = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
- Gebruik in spiervezels de volgende parameters: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; vervagen = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
- Om de macro te starten, voert u eenvoudig de opdracht uitvoeren uit en wacht u tot de macro automatisch alle afbeeldingen uit de aangewezen map laadt en ze op een sequentiële manier kwantificeert.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de duur van dit proces kan variëren van enkele seconden tot enkele uren, afhankelijk van de hoeveelheid gegevens die wordt geanalyseerd. - Zoek naar de resultaten die worden weergegeven in twee nieuwe .csv-bestanden: file_FISH_results en file_nuclei_results. De eerste toont het aantal transcriptieplekken en hun gemiddelde en maximale intensiteit. De tweede geeft zowel het totale aantal kernen als het aantal vlekken in elke kern.
Representative Results
In dit protocol gebruikten we commercieel geproduceerde sondes die gericht waren op Mef2 - en zfh1-mRNA . We hebben de sondes ontworpen in samenwerking met de ontwerper van de FISH-sondes van de fabrikant (Tabel met materialen). De Mef2-set richt zich op de exonen die alle Mef2-RNA-isovormen gemeen hebben (van exon 3 tot exon 10). De zfh1-set richt zich op het derde exon dat gemeenschappelijk is voor zowel zfh1-RB als zfh1-RE-isovormen 10. Beide sondes zijn geconjugeerd aan de fluorescerende kleurstof Quasar 670.
We hebben intern een macro gegenereerd die compatibel was met ImageJ-software om de ruwe .tif gegevens automatisch te analyseren. De macro maakt de 3D-segmentatie van de kernen mogelijk door Cellpose26 met de Fiji-plug-in BIOP en de transcriptionele spotkwantificering door een Laplaciaan van Gaussiaans zoals geïmplementeerd in de Trackmate-plug-in27. MorpholibJ plugin28 wordt gebruikt voor nabewerking (Supplemental File 1).
Als eerste stap hebben we smFISH uitgevoerd op denkbeeldige vleugelschijven, waarvan bekend is dat Mef2 en zfh1 tot expressie komen in de AMP's. Deze gegevens tonen aan dat beide transcripten uniform worden gedetecteerd in de AMPs-populatie die samen is gekleurd met Mef2- of Zfh1-antilichamen (Figuur 2A,B). Actieve transcriptieplaatsen (TS) kunnen door smFISH worden onthuld en onderscheiden van volwassen mRNA, omdat ze meestal groter zijn en intensere signalen hebben dan individuele cytoplasmatische transcripten of volwassen nucleaire transcripten. Consequent maken hogere vergrotingen van AMP's onderscheid tussen TS-foci en volwassen mRNA verspreid in het cytoplasma (Figuur 2A',B'), wat de gevoeligheid van dit smFISH-protocol valideert. Er moet echter worden vermeld dat we één actieve TS per kern hebben waargenomen voor zowel zfh1 als Mef2 (Figuur 2A',B'). Deze gegevens valideren verder de nauwkeurigheid van het sondeontwerp, aangezien Mef2- en zfh1-transcriptiepatronen in de AMP's samengaan met de detectie van hun respectievelijke eiwitten (Figuur 2).
In een tweede stap onderzochten we de transcriptieplaats en distributie van Mef2 en zfh1 mRNA's in gedifferentieerde volwassen IFM's en geassocieerde stamcellen (Figuur 2C,D). Deze gegevens illustreren duidelijk Mef2 TS's in de syncytiële spierkernen en Mef2 mRNA-verdeling door het cytoplasma (Figuur 2C,C'). Zfh1 markeert specifiek de MuSCs-populatie10,11. Met behulp van dit smFISH-protocol hebben we met succes zfh1-transcriptie gedetecteerd in MuSC's gemarkeerd door Zfh1-Gal4 > GFP-expressie. Een hogere vergroting illustreert de detectie van zowel zfh1 TS als cytoplasmatische enkelvoudige mRNA's (Figuur 2D').
Ten slotte gebruikten we onze in-house gebouwde ImageJ-macro om de Mef2-transcriptiedynamiek en ruimtelijke verdeling kwantitatief te analyseren. De computationele pijplijn kan Mef2-vlekken en spierkernen efficiënt detecteren en segmenteren (Figuur 3A-C). Als gevolg van problemen met de signaal-ruisverhouding is het echter mogelijk dat sommige plekken in bepaalde gevallen niet worden gedetecteerd (Figuur 3A',B'). We gebruikten deze geautomatiseerde methode om te onderzoeken of de hoeveelheid Mef2-mRNA varieert tussen spiervoorlopercellen (AMP's) en gedifferentieerde volwassen IFM's. Onze analyse laat zien dat het aantal Mef2-mRNA per kern in volwassen IFM's en de AMP's niet significant verschillen (Figuur 3D).
Om inzicht te krijgen in de ruimtelijke verdeling van Mef2-transcripten in volwassen IFM-spieren, kwantificeerden we de fractie van cytoplasmatische versus nucleaire Mef2-mRNA-vlekken (Figuur 3E,F). Met behulp van ons programma telden we zowel het totale aantal Mef2-mRNA-vlekken als het aantal Mef2-mRNA-vlekken dat overlapt met kernkleuring (Mef2). Door het nuclei-geassocieerde mRNA af te trekken van het totale aantal mRNA's, krijgt u het aantal cytoplasmatische mRNA-vlekken. Onze bevindingen laten zien dat ongeveer 92% van het Mef2-mRNA aanwezig is in het cytoplasma, terwijl de resterende 8% geassocieerd is met spierkernen, zoals weergegeven in figuur 3E,F.
Figuur 1: Procedure voor het ontleden en prepareren van vleugelschijven en IFM-monsters voor smFISH. (A) L3 geënsceneerde larven. (B) Ontleed en omgekeerd voorste uiteinde van de larve. Pijlen geven de vleugelschijven aan. (C) Geïsoleerde vleugelschijf. (D) Ontlede volwassen thoraxen. (E) Volwassen thorax georiënteerd op een dubbelzijdige tape voorafgaand aan de bisectie (stippellijn). (F) Volwassen hemithorax. g) Geïsoleerde IFM's. (H) Workflow van het smFISH-protocol. Afkortingen: IFM's = indirecte vluchtspieren; smFISH = single-molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie; EtOH = ethanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van Mef2 en zfh1 smFISH in vleugelschijven en volwassen IFM's. (A,B) Mef2 - en zfh1-mRNA's (paars) worden uniform gedetecteerd in AMP's en co-lokaliseren met respectievelijk (A,A') Mef2- en (B,B') Zfh1-eiwitten (groen). (A'',B'') Hogere vergroting van de AMP's. (C) Mef2-mRNA's en Mef2-eiwit worden gedetecteerd in volwassen IFM's. (C') Hogere vergroting van het omkaderde gebied in C. (D) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP-expressie (groen) labelt volwassen MuSC's. ZFH1 RNA wordt gedetecteerd in volwassen MuSC's. (D') Hogere vergroting van het omkaderde gebied in D. Zfh1-transcriptiestartplaatsen en afzonderlijke mRNA's worden respectievelijk aangegeven met pijlen en pijlpunten. DAPI-kleuring (blauw). Schaalbalken = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Afkortingen: IFM's = indirecte vluchtspieren; smFISH = single-molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie; AMP's = volwassen spiervoorlopercellen; MuSC's = spierstamcellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van Mef2-transcriptie en cytoplasmatische mRNA-accumulatie door smFISH. (A) Verdeling van Mef2-transcripten (paars) en Mef2-eiwit (groen) in wildtype volwassen IFM's. (A') Hogere vergroting van het omkaderde gebied in A. Transcriptiestartplaatsen en afzonderlijke mRNA's worden respectievelijk aangegeven met pijlen en pijlpunten. (B,C) Automatische Mef2-spotbepaling en nucleaire segmentatie. Cytoplasmatische en nucleaire Mef2-mRNA's worden respectievelijk groen en magenta aangegeven. (B',C') Hogere vergrotingen van omkaderde gebieden in B en C. Sterretjes geven plekken aan die niet door de macro worden geteld. (D) Voorbeeld van Mef2-spotkwantificering in AMP's en volwassen IFM's, in verhouding tot het totale aantal kernen. (p = 0,0785, Student's t-toets, vleugelschijven (n = 4), IFM's (n = 11)). (E) Voorbeeld van kwantificering van Mef2-spotverdeling in IFM's voor volwassenen. (*** p< 0,0007, Student's t-toets, n = 5). (F) Percentage Mef2-mRNA-vlekken gedetecteerd binnen en buiten de kernen (n = 5). Schaalbalken = 10 μm (A,A'). Afkortingen: IFM's = indirecte vluchtspieren; smFISH = single-molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie; AMP's = volwassen spiervoorlopers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Macro gebruikt voor nabewerking. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De toepassing van de smFISH-methode heeft de laatste tijd aan populariteit gewonnen, waarbij het gebruik ervan zich uitstrekt tot verschillende celtypen en modelorganismen. In het geval van Drosophila is de meeste kennis over genexpressie van volwassen spieren echter afgeleid van bulkmoleculaire assays, die geen kwantitatieve informatie opleveren over de precieze ruimtelijke locatie van mRNA-moleculen. Om deze kloof te dichten, hebben we een methode geoptimaliseerd voor het uitvoeren van smFISH op spiervoorlopercellen en volwassen Drosophila-spieren . Deze aanpak is aangepast van een eerder gepubliceerd protocol23 en geoptimaliseerd voor Drosophila-spierweefsels .
Het grootste obstakel bij het verkrijgen van smFISH-beelden van hoge kwaliteit is de dikte van volwassen spieren, wat de optimale penetratie van sondes belemmert. Daarom is het van cruciaal belang om de volwassen spieren te scheiden van de andere weefsels van het dier en het hybridisatieproces met milde agitatie uit te voeren. Deze specifieke stap zorgt voor een effectieve permeabilisatie van de weefsels.
Een ander cruciaal aspect is dat de signaal-ruisverhouding ervoor kan zorgen dat de computationele pijplijn faalt bij het detecteren van bepaalde mRNA-spots. We ontdekten dat het verhogen van de signaal-ruisverhouding kan worden bereikt door de optimale concentratie van sondes te vinden. De optimale verdunning kan verschillen afhankelijk van de samenstelling van elke sondeset, inclusief de samenstelling van de geconjugeerde kleurstof en oligonucleotide. We raden aan om verschillende verdunningen te proberen; een uiteindelijke verdunning van 200 nM leverde in deze experimenten de beste signaal-ruisverhouding op voor volwassen weefsels.
Met de smFISH-methode is het mogelijk om het aantal nieuw gesynthetiseerde RNA's op de TS-foci te kwantificeren. Wanneer een gen actief wordt getranscribeerd, worden meerdere ontluikende RNA's tegelijkertijd geproduceerd bij de TS. Als gevolg hiervan zal de intensiteit van de TS die van volwassen cytoplasmatisch RNA overtreffen, en deze eigenschap, gecombineerd met de nucleaire lokalisatie, kan de TS onderscheiden van individuele cytoplasmatische RNA's. In de context van de spierbiologie zijn TS-detectie en -kwantificering bijzonder belangrijk voor het bepalen van de synchronisatie van transcriptie van een specifiek gen tussen spierkernen binnen hetzelfde syncytium. Deze computationele pijplijn is echter niet ontworpen om onderscheid te maken tussen cytoplasmatisch mRNA- en TS-signalen. Als alternatief raden we aan om deze smFISH-methode te combineren met andere beproefde smFISH-analysetools, zoals BayFISH of FISH-quant29,30. Het is bewezen dat deze tools geautomatiseerde segmentatie- en fluorescentie-intensiteitsberekeningen van RNA-aggregaten met opmerkelijke precisie mogelijk maken.
Ten slotte, hoewel smFISH mRNA-moleculen met een hoge ruimtelijke resolutie detecteert, is het beperkt tot het tegelijkertijd analyseren van een klein aantal mRNA. Multischaalmethoden zoals merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) maken de gelijktijdige analyse van een groot aantal verschillende mRNA'smogelijk 31. Door oligonucleotide-sondes en foutcorrigerende codes te combineren, vergemakkelijkt deze methode de detectie van honderden RNA-soorten in afzonderlijke cellen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Alain Vincent voor zijn kritische lezing van het manuscript. We danken Ruth Lehmann voor het verstrekken van het Zfh1-antilichaam. We zijn dankbaar voor de hulp van Stephanie Dutertre en Xavier Pinson voor confocale microscopie op het MRic Imaging Platform. EL wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA wordt ondersteund door de AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP wordt gefinancierd door een Chan Zuckerberg Initiative DAF-subsidie aan TP (2019-198009). HB wordt ondersteund door CNRS, het Atip Avenir-programma en de AFM-Telethon trampoline subsidie 23108.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
References
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
- Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
- Bothe, I., Baylies, M. K.
- Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
- Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
- Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
- Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
- Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
- Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
- Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
- Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
- Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
- Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
- Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
- Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
- Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
