Summary
果蝇 是研究调节肌生成的关键分子的成熟模型。然而，目前的方法不足以确定合胞体内的mRNA转录动力学和空间分布。为了解决这一局限性，我们优化了RNA荧光 原位 杂交方法，允许在单分子尺度上检测和定量mRNA。
Abstract
骨骼肌是由许多束状肌纤维组成的大合胞体，可产生力并实现身体运动。 果蝇 是研究肌肉生物学的经典模型。 果蝇 遗传学和先进的组学方法相结合，鉴定了调节肌肉形态发生和再生的关键保守分子。然而，这些分子的转录动力学及其信使RNA在合胞体内的空间分布无法通过常规方法进行评估。在这里，我们优化了现有的单分子RNA荧光 原位 杂交（smFISH）方法，以检测和定量成人飞行肌肉及其肌肉干细胞中的单个mRNA分子。作为概念验证，我们分析了两种进化保守转录因子 Mef2 和 Zfh1/Zeb 的 mRNA 表达和分布。我们表明，这种方法可以有效地检测和定量肌肉前体细胞、成人肌肉和肌肉干细胞中转录本的单个 mRNA 分子。
Introduction
成人骨骼肌由分化的多核肌纤维组成，其收缩特性产生运动。肌肉生长、维持和再生依赖于胚胎发育过程中指定的肌肉祖细胞和肌肉干细胞 （MuSC）1。肌源性程序由一组核心肌源性转录因子 （TF）（例如 Pax3/7、MYOD、Mef2 和 ZEB）2,3,4 精细控制。破译调节肌肉生物学的分子机制对于阐明与肌肉学相关的基本问题以及治疗肌肉退行性疾病的可能治疗用途非常重要。
果蝇作为研究肌发生的遗传模型有着悠久的历史5.它最近成为研究肌肉再生的新模型 6,7,8。苍蝇和哺乳动物之间的肌肉结构和核心肌源性程序高度保守。例如，TFs Mef2 和 Zfh1/ZEB 在调节肌肉发育和再生方面具有保守的功能 3,9,10,11。成年果蝇肌肉，如间接飞行肌 （IFM），是由特定的 MuSC 群体形成的，称为成体肌肉祖细胞 （AMP）12。这些AMP在胚胎发生过程中被指定，并与上皮结构（如翅膀和腿椎间盘）相关联。在整个胚胎和幼虫阶段，AMP保持未分化状态，直到，当它们参与分化和融合以形成IFMs时13,14。TF Spalt major（spalt，salm）在飞行肌肉发育过程中表达，是确定其结构特性所必需的15.Mef2 是另一种重要的肌源性 TF，对成人肌肉形成至关重要16,17。它在 AMP 中表达并在成人 IFM中维持 10,18。虽然大多数 AMP 分化为功能性肌肉，但一个子集逃脱分化并形成成年 MuSCs11。与脊椎动物类似，TF Zfh1/ZEB 是防止成年 MuSC 过早分化并维持其干性所必需的 9,10。
基因表达动力学已被证明可以调节各种肌肉生物学过程19,20。高通量单细胞和单核 RNA 测序技术的出现使对这些转录动力学的全面探索成为可能21,22。这些方法的一个显着局限性是它们无法提供多核肌纤维中mRNA分子的空间分布。这些特征可以通过单分子荧光原位杂交 （smFISH） 来研究，该杂交揭示了两种类型的 mRNA 体：1. 单个 mRNA 分子散布在细胞质中并代表成熟的 RNA 和 2.最多两个明亮的核病灶对应于新生转录本，并揭示转录活性等位基因23。因此，smFISH是单个mRNA分子定量的首选方法，研究其空间分布并提供基因转录动力学的快照。
smFISH方法依赖于一组短荧光寡核苷酸探针，这些探针专门设计用于与靶转录本互补。退火后，它产生高强度点源，允许使用共聚焦显微镜检测单分子水平的mRNA24。这种方法越来越多地应用于多种细胞类型，包括哺乳动物肌肉组织19,20。然而，在果蝇中，与其他动物模型一样，关于成体肌肉基因表达的大部分知识都来自批量分子测定，这些测定缺乏关于mRNA分子空间位置的定量信息。在这里，我们优化了一种对肌肉前体细胞和成年果蝇肌肉进行smFISH的方法23,25。该协议包括用于细胞核分割和 mRNA 计数和定位的全自动分析管道。
Protocol
1.翼盘和成人肌肉解剖和准备
注意：用RNAse抑制剂溶液（材料表）清理解剖台和所有解剖仪器。在整个实验过程中应佩戴实验室手套。
- 翼盘
- 将L3分期幼虫置于冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中（图1A）。
- 用1x PBS冲洗幼虫3次，并将它们保持在该溶液中5分钟。
- 使用两对锋利的镊子，从前部握住幼虫，拉动并丢弃其余的身体组织（约2/3）。
- 用一对镊子握住幼虫的前 1/3，用另一对镊子握住嘴钩。缩回幼虫内部的嘴钩，直到它完全倒置。
注意：每次实验解剖大约 30 只幼虫，以确保有足够的样本量进行分析。 - 观察翅盘与气管的两个主要分支密切相关，它们沿着幼虫的每一侧延伸。
- 去除所有其他幼虫成分（腿盘和大脑），以获得干净的倒置幼虫尸体，并将一对翼盘连接到气管（图1B）。
- 将样品置于 1 mL 离心管中，并将它们固定在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中，在室温下搅拌以 1x PBS 稀释 45 分钟。
注：样品搅拌是通过振荡搅拌器实现的（材料表）。 - 用70%乙醇（EtOH，在无RNAse的水中稀释）洗涤样品3 x 5分钟，并将它们储存在4°C的同一洗涤溶液中至少2天至1周。
- 间接飞行肌肉
- 在 CO2 苍蝇垫上麻醉成年苍蝇并去除头部、腹部、腿部和翅膀。
- 将解剖的胸部置于冷的1x PBS中，并继续这样做，直到解剖所有样品（图1D）。
- 在室温下搅拌20分钟，在4%PFA（1%Triton）中前缀胸部。
- 用 1x PBT 洗涤液（1% Triton 溶于 1x PBS 溶液）冲洗样品 3 x 5 分钟。
- 将胸部放置在载玻片上的双面胶带（材料表）上，并用锋利的切片片将它们一分为二，以产生两个半胸腔（图1E，F）。
- 在室温下搅拌，将样品固定在4%PFA（1%Triton）中45分钟。
- 在室温下搅拌用1x PBT洗涤溶液（1%Triton，1x PBS）洗涤2 x 20分钟。
- 将半胸廓置于冷的1x PBS中，并使用镊子轻轻地将IFM与半胸廓隔离（图1G）。
注意： 为此，重要的是要尽可能彻底地去除角质层。 - 为了透化样品，将分离的IFM储存在70%EtOH溶液中至少2天，在4°C下最多1周。
注意：每次实验将IFM从大约10个胸部中分离出来，以确保有足够的样本量进行分析。
2. 杂交、免疫染色和封片
注意：类似的杂交程序适用于机翼盘和 IFM 样品。在开始杂交之前，将翅盘与幼虫尸体分离并将它们放入 200 μL 缓冲液 A 中至关重要。
- 将探针重悬于 400 μL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）中，以获得 12.5 μM 的最终储备溶液。
- 将样品转移到含有缓冲液A（材料表）的0.5mL离心管中。
注意：通过减小容器的体积，可以更容易地可视化样品并避免在洗涤过程中丢失样品。 - 用缓冲液 A 洗涤样品 2 x 20 分钟。
- 吸出缓冲液A，用400μL杂交缓冲液（材料表）代替，并在热混合器（材料表）中在37°C下预杂交样品30分钟。
- 在杂交缓冲液中将探针稀释至翅盘的终浓度为125nM，成人肌肉的终浓度为200nM，并加入一抗。
注：抗体稀释度因所使用的特异性抗体而异（材料表）。添加抗体是可选的。用户可以选择放弃蛋白质染色，而是使用类似的smFISH方案，该方案不包括添加抗体。 - 吸出杂交缓冲液，并用含有探针和抗体的 100 μL 杂交缓冲液代替。
- 将样品在37°C的黑暗中在300rpm搅拌下在热混合器中孵育至少16小时。
- 在37°C下预热缓冲液A的等分试样。
- 在37°C的热混合器中，在300rpm的搅拌下洗涤样品3×10分钟。
- 在最后一次洗涤期间，在缓冲液A中稀释二抗（1/200）和DAPI（1/10,000），并将样品在37°C下在该溶液中孵育至少1小时。
- 用缓冲液B（材料表）洗涤样品3 x 20分钟。
- 小心地将样品转移到显微镜载玻片上，擦去残留的缓冲液B，加入30μL封固剂，并用18×18mm盖玻片盖住。使用指甲油密封制剂。
- 将样品在4°C下储存长达1周。
注意： 但是，建议尽快进行成像，以避免探头信号衰减。
3. 影像学检查
- 使用配备 40x 和 63x 油浸物镜的共聚焦显微镜（材料表）使用 xyz 采集模式采集图像。smFISH信号由HyD探测器通过光子计数模式检测。
- 使用DAPI信号和UV灯定位样品。
- 要对翼盘相关肌肉祖细胞和IFM（图2 和 图3）进行成像，请对激光线和发射滤光片应用以下设置：选择 DAPI （激发（例如） 405nm，发射（em.） 450 nm）、 Alexa Fluor 488 （例如 496 nm、em. 519 nm）和用于smFISH探针的 Quasar 670 （例如 647 nm，em. 670 nm）。
- 要对成年MuSC进行成像（图2D），请对激光线和发射滤光片应用以下设置：选择 DAPI （例如 405nm，em。 450 nm）、 Alexa Fluor 488 （例如 496 nm、em. 519 nm）、 Alexa Fluor 555 （例如 555 nm、em. 565 nm）和用于smFISH探针的 Quasar 670 （例如 647 nm，em. 670 nm）。
注：对于成像，波长可以根据与二抗和探针相关的染料进行调整。 - 将共聚焦图像另存为 。TIFF 文件。
4. 成像后分析
- 首先，启动 ImageJ 并导航到 “插件” 菜单。从那里，选择 “宏”|”编辑 以打开宏源代码。
注意：这将允许根据需要调整参数，如果需要，可以修改宏源代码中每个通道的文件夹目录。 - 要遵循此方案并定量幼虫中的 Mef2 smFISH斑点，请使用以下设置： Log_radius = 3.0和Log_quality = 20.0。Segement Mef2 阳性核， 模糊 = 2;nucleus_scale_parameter = 30;nucleus_threshold = -8.0;nucleus_size = 300。
- 在肌肉纤维中，使用以下参数： Log_radius = 2.5;Log_quality = 60.0;模糊 = 2;nucleus_scale_parameter = 100;nucleus_threshold = 0.0;nucleus_size = 300。
- 要启动宏，只需执行 run 命令并等待宏自动从指定文件夹加载所有图像并按顺序量化它们。
注意：请注意，此过程的持续时间可能从几秒钟到几个小时不等，具体取决于所分析的数据量。 - 查找两个新.csv文件中显示的结果：file_FISH_results 和 file_nuclei_results。第一个显示转录点的数量及其平均和最大强度。第二个给出了原子核的总数和每个原子核内的斑点数量。
Representative Results
在该协议中，我们使用了靶向 Mef2 和 zfh1 mRNA 的商业生产的探针。我们使用制造商的 FISH 探针设计器（材料表）设计了探针。 Mef2 集靶向所有 Mef2 RNA 亚型（从外显子 3 到外显子 10）共有的外显子。 zfh1 集靶向 zfh1-RB 和 zfh1-RE 亚型10 共有的第三外显子。两种探针均与类星体 670 荧光染料偶联。
我们在内部生成了一个与 ImageJ 软件兼容的宏，以自动分析原始.tif数据。该宏允许使用 Fiji 插件 BIOP 通过 Cellpose26 对细胞核进行 3D 分割，并通过 Trackmate 插件27 中实现的高斯拉普拉斯量进行转录点定量。MorpholibJ 插件28 用于后处理（补充文件 1）。
作为第一步，我们在翅膀假想盘上进行了 smFISH，其中已知 Mef2 和 zfh1 在 AMP 中表达。这些数据表明，在与 Mef2 或 Zfh1 抗体共染色的 AMP 群体中，两种转录本均被一致检测到（图 2A，B）。活性转录位点 （TS） 可以通过 smFISH 揭示并与成熟 mRNA 区分开来，因为它们往往比单个细胞质转录本或成熟核转录本更大且具有更强的信号。始终如一地，AMP的更高放大倍率区分TS病灶和分散在细胞质中的成熟mRNA（图2A'，B'），验证了该smFISH方案的灵敏度。然而，应该提到的是，我们观察到zfh1和Mef2的每个细胞核都有一个活性TS（图2A'，B'）。这些数据进一步验证了探针设计的准确性，因为 AMP 中的 Mef2 和 zfh1 转录模式与其各自蛋白质的检测共定位（图 2）。
在第二步中，我们检查了分化的成人IFM和相关干细胞中Mef2和zfh1 mRNA的转录位点和分布（图2C，D）。这些数据清楚地说明了合胞肌核中的Mef2 TS和整个细胞质中的Mef2 mRNA分布（图2C，C'）。Zfh1 特异性标记 MuSCs 种群 10,11。使用这种smFISH方案，我们成功地在由Zfh1-Gal4标记>GFP表达的MuSC中检测到zfh1转录。更高的放大倍率说明了zfh1 TS和细胞质单个mRNA的检测（图2D'）。
最后，我们使用内部构建的 ImageJ 宏来定量分析 Mef2 转录动力学和空间分布。计算管道可以有效地检测和分割 Mef2 斑点和肌肉核（图 3A-C）。然而，由于信噪比问题，在某些情况下可能无法检测到某些斑点（图3A'，B'）。我们使用这种自动化方法来研究肌肉前体细胞 （AMP） 和分化的成年 IFM 之间的 Mef2 mRNA 丰度是否不同。我们的分析表明，成体IFM和AMP中每个细胞核的Mef2 mRNA数量没有显着差异（图3D）。
为了深入了解成人IFM肌肉中Mef2转录本的空间分布，我们量化了细胞质与核Mef2 mRNA斑点的比例（图3E，F）。使用我们的程序，我们计算了 Mef2 mRNA 斑点的总数和与细胞核染色 （Mef2） 重叠的 Mef2 mRNA 斑点的数量。从总 mRNA 数量中减去与细胞核相关的 mRNA 可得到细胞质 mRNA 斑点的数量。我们的研究结果显示，大约 92% 的 Mef2 mRNA 存在于细胞质中，而其余 8% 与肌肉核相关，如图 3E，F 所示。
图1：解剖和制备smFISH翼盘和IFM样品的程序。 （A） L3分期幼虫。（B） 幼虫前端解剖和倒置。箭头表示翼盘。（C）孤立的翅盘。 （D）解剖的成虫胸部。（E） 成人胸部在平分前定向在双面胶带上（虚线）。（F） 成人偏胸。（g） 孤立的IFM。（H） smFISH协议的工作流程。 缩写：IFMs = 间接飞行肌肉;smFISH=单分子RNA荧光 原位 杂交;EtOH = 乙醇。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：翼盘和成年 IFM 中 Mef2 和 zfh1 smFISH 的代表性图像。 （A，B） Mef2 和 zfh1 mRNA（紫色）在 AMP 中均匀检测，并分别与 （A，A'） Mef2 和 （B，B'） Zfh1 蛋白（绿色）共定位。（A''，B''）AMP 的放大倍率更高。（C） 在成年 IFM 中检测到 Mef2 mRNA 和 Mef2 蛋白。（C'） C中盒装区域的放大倍率更高。（D） Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP 表达（绿色）标记成年 MuSC。 ZFH1 型在成体 MuSC 中检测到 RNA。（D'） D中盒装区域的放大倍率更高。 Zfh1 转录起始位点和单个 mRNA 分别用箭头和箭头表示。DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 50 μm （A，B，A'，B'）、10 μm （A“，B”，C，D）、5 μm （C'，D'）。缩写：IFMs = 间接飞行肌肉;smFISH=单分子RNA荧光 原位 杂交;AMPs = 成人肌肉祖细胞;MuSCs = 肌肉干细胞;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：通过 smFISH 定量 Mef2 转录和细胞质 mRNA 积累。 （A） 野生型成年 IFM 中 Mef2 转录本（紫色）和 Mef2 蛋白（绿色）的分布。（一'） A中盒装区域的放大倍率更高。转录起始位点和单个 mRNA 分别用箭头和箭头表示。（乙，三）自动 Mef2 斑点发现和细胞核分割。细胞质和细胞核 Mef2 mRNA 分别以绿色和洋红色表示。（B'，C'） B 和 C 中盒装区域的放大倍率更高。星号表示宏未计数的点。（D） AMP和成人IFM中 Mef2 斑点定量相对于细胞核总数的示例。（p = 0,0785，学生 t 检验，翼盘 （n = 4），IFM （n = 11））。（E） 成年 IFM 中 Mef2 斑点分布的定量示例。（*** p< 0.0007，学生 t 检验，n = 5）。（F） 在细胞核内外检测到的 Mef2 mRNA 斑点的百分比 （n = 5）。比例尺 = 10 μm （A，A'）。缩写：IFMs = 间接飞行肌肉;smFISH=单分子RNA荧光 原位 杂交;AMPs = 成人肌肉祖细胞。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件 1：用于后处理的宏。请点击这里下载此文件。
Discussion
smFISH方法的应用近年来越来越受欢迎，其用途已扩展到各种细胞类型和模式生物。然而，就 果蝇而言，关于成体肌肉基因表达的大部分知识都来自批量分子测定，这些测定无法提供有关 mRNA 分子精确空间位置的定量信息。为了解决这一差距，我们优化了一种对肌肉前体细胞和成年 果蝇 肌肉进行smFISH的方法。该方法已改编自先前发表的方案23 ，并针对 果蝇 肌肉组织进行了优化。
获得高质量smFISH图像的主要障碍是成人肌肉的厚度，这阻碍了探针的最佳穿透。因此，将成年肌肉与动物的其他组织分开并以轻度搅拌进行杂交过程至关重要。这一特殊步骤确保了组织的有效透化。
另一个关键方面是信噪比可能导致计算管道无法检测某些mRNA点。我们发现，通过找到最佳的探针浓度，可以提高信噪比。最佳稀释度可能因每个探针组的组成而异，包括偶联染料和寡核苷酸组成。我们建议尝试不同的稀释度;在这些实验中，200 nM的最终稀释度产生了成人组织的最佳信噪比。
使用smFISH方法，可以量化TS病灶处新合成的RNA的数量。当一个基因被主动转录时，多个新生的RNA在TS上同时产生。因此，TS 的强度将超过成熟细胞质 RNA，这一特征与其核定位相结合，可以将 TS 与单个细胞质 RNA 区分开来。在肌肉生物学的背景下，TS 检测和定量对于确定同一合胞体内肌肉核中特定基因转录的同步性尤为重要。然而，这种计算管道并非旨在区分细胞质 mRNA 和 TS 信号。作为替代方案，我们建议将这种smFISH方法与其他成熟的smFISH分析工具相结合，例如BayFISH或FISH-quant29,30。这些工具已被证明可以非常精确地促进RNA聚集体的自动分割和荧光强度计算。
最后，虽然smFISH可以检测具有高空间分辨率的mRNA分子，但它仅限于同时分析少量的mRNA。merFISH（多重错误鲁棒荧光 原位 杂交）等多尺度方法可以同时分析大量不同的 mRNA31。通过结合寡核苷酸探针和纠错码，该方法有助于检测单细胞中的数百种RNA。
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢阿兰·文森特（Alain Vincent）对手稿的批判性阅读。感谢 Ruth Lehmann 提供 Zfh1 抗体。我们感谢 Stephanie Dutertre 和 Xavier Pinson 在 MRic 成像平台上对共聚焦显微镜的帮助。EL得到了高等科学和科学研究部的博士奖学金的支持。NA 由 AFM-Telethon 博士奖学金 23846 支持。TP 由 Chan Zuckerberg Initiative DAF 对 TP 的资助 （2019-198009）。HB 得到了 CNRS、Atip Avenir 计划和 AFM-Telethon 蹦床赠款 23108 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
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