Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Undersøgelse af muskeltranskriptionsdynamik ved enkeltmolekyleskalaer i Drosophila

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65713
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR), UMR6290 CNRS - Université de Rennes, 2BIOSIT, UAR 3480 US 018, Université de Rennes

Summary

Drosophila er en veletableret model til undersøgelse af nøglemolekyler, der regulerer myogenese. Imidlertid er de nuværende metoder utilstrækkelige til at bestemme mRNA-transkriptionsdynamik og rumlig fordeling inden for syncyti. For at løse denne begrænsning optimerede vi en RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetode, der muliggør påvisning og kvantificering af mRNA'er på en enkeltmolekyleskala.

Abstract

Skeletmuskler er store syncytia bestående af mange bundtede myofibre, der producerer kræfter og muliggør kropsbevægelse. Drosophila er en klassisk model til at studere muskelbiologi. Kombinationen af både Drosophila-genetik og avancerede omics-tilgange førte til identifikation af vigtige konserverede molekyler, der regulerer muskelmorfogenese og regenerering. Imidlertid kan transkriptionsdynamikken af disse molekyler og den rumlige fordeling af deres messenger-RNA inden for syncytia ikke vurderes ved konventionelle metoder. Her optimerede vi en eksisterende enkeltmolekyle RNA-fluorescens in situ hybridiseringsmetode (smFISH) for at muliggøre påvisning og kvantificering af individuelle mRNA-molekyler i voksne flyvemuskler og deres muskelstamceller. Som et bevis på konceptet har vi analyseret mRNA-ekspressionen og fordelingen af to evolutionære konserverede transkriptionsfaktorer, Mef2 og Zfh1 / Zeb. Vi viser, at denne metode effektivt kan detektere og kvantificere enkelte mRNA-molekyler for både transkripter i muskelforløberceller, voksne muskler og muskelstamceller.

Introduction

Voksne skeletmuskler er lavet af differentierede multinucleated myofibre, hvis kontraktile egenskaber genererer bevægelser. Muskelvækst, vedligeholdelse og regenerering er afhængig af muskelstamceller og muskelstamceller (MuSC'er), der er specificeret under embryonal udvikling1. Det myogene program styres fint af et sæt kernemyogene transkriptionsfaktorer (TF'er) (f.eks. Pax3/7, MYOD, Mef2 og ZEB)2,3,4. Dekryptering af de molekylære mekanismer, der regulerer muskelbiologi, er vigtig for at belyse grundlæggende myologirelaterede spørgsmål og for mulig terapeutisk anvendelse til behandling af muskeldegenerative sygdomme.

Drosophila har en lang historie som en genetisk model til at studere myogenese5. Det er for nylig opstået som en ny model til at undersøge muskelregenerering 6,7,8. Muskelstrukturen og kernemyogene programmer er stærkt bevaret mellem fluer og pattedyr. For eksempel har TF'erne Mef2 og Zfh1 / ZEB en bevaret funktion til regulering af muskeludvikling og regenerering 3,9,10,11. Voksne Drosophila-muskler, såsom indirekte flyvemuskler (IFM'er), dannes af en bestemt population af MuSC'er, kendt som voksne muskelstamfædre (AMP'er)12. Disse AMP'er specificeres under embryogenese og associeres med epitelstrukturer såsom vinge- og benskiver. Gennem embryonale og larvestadier forbliver AMP'er udifferentierede indtil metamorfose, når de engagerer sig i differentiering og fusion for at danne IFM'erne13,14. TF Spalt major (spalt, salm) udtrykkes under flyvemuskeludvikling og er nødvendig for at bestemme deres strukturelle identitet15. Mef2 er en anden vigtig myogen TF, der er afgørende for voksen muskeldannelse 16,17. Det udtrykkes i AMP'erne og vedligeholdes i IFM'erne10,18 for voksne. Mens størstedelen af AMP'er differentierer sig til funktionelle muskler, undgår en delmængde differentiering og danner de voksne MuSC'er11. I lighed med hvirveldyr er TF Zfh1/ZEB nødvendig for at forhindre for tidlig differentiering af de voksne MuSC'er og for at bevare deres stilk 9,10.

Genekspressionsdynamik har vist sig at regulere forskellige muskelbiologiske processer19,20. Fremkomsten af højkapacitets enkeltcelle- og enkeltkerner RNA-sekventeringsteknikker har muliggjort en omfattende udforskning af disse transkriptionelle dynamikker21,22. En bemærkelsesværdig begrænsning af disse tilgange er deres manglende evne til at tilvejebringe den rumlige fordeling af mRNA-molekyler i de multinucleerede muskelfibre. Disse egenskaber kan undersøges ved enkeltmolekylefluorescens in situ-hybridisering (smFISH), der afslører to typer mRNA-legemer: 1. Individuelle mRNA-molekyler spredt ud i cytoplasmaet og repræsenterer det modne RNA og 2. Højst to lyse nukleare foci svarer til det spirende transkript og afslører de transkriptionelt aktive alleler23. Derfor er smFISH en metode til valg til individuel mRNA-molekylekvantificering, der undersøger deres rumlige fordeling og giver snapshots af gentranskriptionsdynamikken.

smFISH-metoden er afhængig af et sæt korte fluorescerende oligonukleotidprober, der er specielt designet til at være komplementære til måltranskriptet. Efter udglødning genererer den punktkilder med høj intensitet, der tillader påvisning af mRNA på et enkeltmolekyleniveau ved hjælp af konfokal mikroskopi24. Denne metode anvendes i stigende grad til en lang række celletyper, herunder pattedyrs muskelvæv19,20. Men i Drosophila ligesom andre dyremodeller stammer det meste af viden om voksen muskelgenekspression fra bulkmolekylære assays, som mangler kvantitativ information om den rumlige placering af mRNA-molekyler. Her optimerede vi en metode til at udføre smFISH på muskelforløberceller og voksne Drosophila-muskler 23,25. Denne protokol inkluderer en fuldautomatisk analysepipeline til kernesegmentering og mRNA-tælling og lokalisering.

Protocol

1. Vingeskive og voksen muskeldissektion og forberedelse

BEMÆRK: Rens dissektionsbænken og alle dissektionsinstrumenterne med RNAse-hæmmeropløsning (materialetabel). Laboratoriehandsker bør bæres under hele forsøgsproceduren.

  1. Vinge skive
    1. Placer L3-fasede larver i koldt 1x fosfatbufret saltvand (PBS) (figur 1A).
    2. Skyl larverne 3x med 1x PBS og opbevar dem i denne opløsning i 5 min.
    3. Brug to par skarpe tang til at holde larven fra den forreste del og trække og kassere resten af kropsvævet (ca. 2/3).
    4. Hold både den første 1/3 af larven med et par tang og mundkrogene med det andet par. Træk mundkrogene inde i larven, indtil den er helt omvendt.
      BEMÆRK: Dissekere ca. 30 larver pr. forsøg for at sikre tilstrækkelig prøvestørrelse til analyse.
    5. Bemærk, at vingeskiverne er tæt forbundet med de to primære grene af luftrøret, som løber langs hver side af larven.
    6. Alle de andre larvekomponenter (benskiver og hjerne) fjernes for at opnå en ren omvendt larvekrop med et par vingeskiver fastgjort til luftrøret (figur 1B).
    7. Anbring prøverne i et 1 ml centrifugerør og fastgør dem i 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i 1x PBS i 45 minutter ved stuetemperatur under omrøring.
      BEMÆRK: Prøveomrøringen opnås ved hjælp af en oscillerende omrører (materialetabel).
    8. Prøverne vaskes 3 x 5 min med 70% ethanol (EtOH, fortyndet i RNAsefrit vand) og opbevares i samme vaskeopløsning ved 4 °C i mindst 2 dage og op til 1 uge.
  2. Indirekte flyvemuskler
    1. Bedøv de voksne fluer på en CO2 fluepude og fjern hoveder, mave, ben og vinger.
    2. Placer de dissekerede thoraxer i kold 1x PBS, og fortsæt med at gøre det, indtil alle prøver er dissekeret (figur 1D).
    3. Præfiks brystkassen i 4% PFA, (1% Triton) i 20 minutter ved stuetemperatur under omrøring.
    4. Skyl prøverne 3 x 5 min med 1x PBT vaskeopløsning (1% Triton i 1x PBS).
    5. Placer brystkassen på et dobbeltklæbende bånd (materialetabel) på et glasglas og skær dem med et skarpt mikrotomblad for at producere to hemi-thoraces (figur 1E, F).
    6. Prøverne fastgøres i 4% PFA (1% Triton) i 45 minutter ved stuetemperatur under omrøring.
    7. Vask 2 x 20 min med 1x PBT vaskeopløsning (1% Triton, 1x PBS) ved stuetemperatur under omrøring.
    8. Placer hemi-thoraces i kold 1x PBS og brug tangen til forsigtigt at isolere IFM'erne fra hemi-thorace (figur 1G).
      BEMÆRK: For at opnå dette er det vigtigt at fjerne neglebåndet så grundigt som muligt.
    9. For at permeabilisere prøverne opbevares de isolerede IFM'er i 70 % EtOH-opløsning i mindst 2 dage og op til 1 uge ved 4 °C.
      BEMÆRK: Isoler IFM'erne fra ca. 10 thoraxer pr. forsøg for at sikre tilstrækkelig prøvestørrelse til analyse.

2. Hybridisering, immunfarvning og montering

BEMÆRK: Lignende hybridiseringsprocedure anvendes til både vingeskiver og IFM-prøver. Det er afgørende at isolere vingeskiverne fra larvekroppene og lægge dem i 200 μL buffer A, inden hybridiseringen påbegyndes.

  1. Sonderne i 400 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspenderes for en stamopløsning på 12,5 μM.
  2. Overfør prøverne til et 0,5 ml centrifugerør indeholdende buffer A (materialetabel).
    BEMÆRK: Ved at reducere beholderens volumen bliver det lettere at visualisere prøverne og undgå at miste dem under vaskeprocessen.
  3. Prøverne vaskes 2 x 20 min med buffer A.
  4. Aspirat buffer A, udskift den med 400 μL hybridiseringsbuffer (materialetabel), og præhybridiser prøverne i 30 minutter ved 37 °C i en termisk mixer (materialetabel).
  5. Fortynd sonderne til en slutkoncentration på 125 nM for vingeskiver og 200 nM for voksne muskler i hybridiseringsbufferen og tilsæt det primære antistof.
    BEMÆRK: Antistoffortyndingen varierer afhængigt af det specifikke antistof, der anvendes (materialetabel). Tilføjelse af antistoffer er valgfri. Brugere kan vælge at give afkald på proteinfarvning og i stedet bruge en lignende smFISH-protokol, der ikke inkluderer tilsætning af antistoffer.
  6. Opsug hybridiseringsbufferen og erstat den med 100 μL hybridiseringsbuffer indeholdende sonden og antistoffet.
  7. Prøverne inkuberes mørkt ved 37 °C i mindst 16 timer under 300 omrøring i en termisk mixer.
  8. En delprøve af buffer A opvarmes ved 37 °C.
  9. Prøverne vaskes i 3 x 10 minutter i termoblanderen ved 37 °C under 300 omrøring.
  10. Under den sidste vask fortyndes det sekundære antistof (1:200) og DAPI (1:10.000) i buffer A, og prøverne i denne opløsning inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time.
  11. Vask prøverne i 3 x 20 min med buffer B (materialetabel).
  12. Overfør forsigtigt prøverne på et mikroskopglas, tør den resterende buffer B af, tilsæt 30 μL monteringsmedium, og dæk med en 18 x 18 mm dæksel. Brug en neglelak til at forsegle præparatet.
  13. Prøverne opbevares i op til 1 uge ved 4 °C.
    BEMÆRK: Det anbefales dog at udføre billeddannelsen så hurtigt som muligt for at undgå nedbrydning af sondesignalet.

3. Billedbehandling

  1. Få billeder med en xyz-optagelsestilstand ved hjælp af et konfokalmikroskop udstyret med 40x og 63x olienedsænkningsmål (materialetabel). smFISH-signalet detekteres af HyD-detektoren via en fotontællingstilstand.
  2. Find prøverne ved hjælp af DAPI-signalet og UV-lampen.
  3. For at afbilde de vingeskiveassocierede muskelforfædre og IFM'er (figur 2 og figur 3) skal du anvende følgende opsætning for laserlinjer og emissionsfiltre: vælg DAPI (excitation (ex.) 405 nm, emission (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm) og Quasar 670 til smFISH-sonderne (f.eks. 647 nm, em. 670 nm).
  4. For at afbilde de voksne MuSC'er (figur 2D) skal du anvende følgende opsætning for laserlinjer og emissionsfiltre: vælg DAPI (f.eks. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm) og Quasar 670 til smFISH-sonderne (ex. 647 nm, em. 670 nm).
    BEMÆRK: Til billeddannelsen kan bølgelængderne tilpasses i henhold til farvestofferne forbundet med sekundære antistoffer og sonder.
  5. Gem de konfokale billeder som . TIFF-filer.

4. Analyse efter billeddannelse

  1. For at komme i gang skal du starte ImageJ og navigere til menuen Plugins . Derfra skal du vælge Makroer | Rediger for at åbne makroernes kildekode.
    BEMÆRK: Dette vil muliggøre justering af parametrene efter behov og om nødvendigt ændre mappemappen for hver kanal i makroens kildekode.
  2. For at følge denne protokol og kvantificere Mef2 smFISH-pletter i larver skal du bruge følgende indstillinger: Log_radius = 3,0 og Log_quality = 20,0. Segement Mef2-positive kerner med sløring = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
  3. I muskelfibre skal du bruge følgende parametre: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60, 0; sløring = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
  4. For at starte makroen skal du blot udføre kørselskommandoen og vente på, at makroen automatisk indlæser alle billeder fra den angivne mappe og kvantificerer dem sekventielt.
    BEMÆRK: Bemærk, at varigheden af denne proces kan variere fra et par sekunder til flere timer afhængigt af mængden af data, der analyseres.
  5. Se efter de resultater, der vises i to nye .csv filer: file_FISH_results og file_nuclei_results. Den første viser antallet af transkriptionspletter og deres gennemsnitlige og maksimale intensiteter. Den anden giver både det samlede antal kerner og antallet af pletter inde i hver kerne.

Representative Results

I denne protokol brugte vi kommercielt producerede sonder rettet mod Mef2 og zfh1 mRNA. Vi designede sonderne med producentens FISH-sondedesigner (materialetabel). Mef2-sættet er rettet mod de exoner, der er fælles for alle Mef2 RNA-isoformer (fra exon 3 til exon 10). Zfh1-sættet er rettet mod den tredje exon, der er fælles for både zfh1-RB og zfh1-RE-isoformer 10. Begge sonder er konjugeret til Quasar 670 fluorescerende farvestof.

Vi genererede en makro internt, der var kompatibel med ImageJ-software til automatisk at analysere de rå .tif data. Makroen tillader 3D-segmentering af kernerne af Cellpose26 med Fiji-pluginet BIOP og transkriptionel spotkvantificering af en laplacian af Gaussian som implementeret i Trackmate-plugin27. MorpholibJ plugin28 bruges til efterbehandling (supplerende fil 1).

Som et første skridt udførte vi smFISH på imaginære vingeskiver, hvor Mef2 og zfh1 vides at blive udtrykt i AMP'erne. Disse data viser, at begge transkripter detekteres ensartet i AMPs-populationen co-farvet med enten Mef2- eller Zfh1-antistoffer (figur 2A, B). Aktive transkriptionssteder (TS) kan afsløres og skelnes fra modent mRNA ved smFISH, da de har tendens til at være større og har mere intense signaler end individuelle cytoplasmatiske transkripter eller modne nukleare transkripter. Konsekvent skelner højere forstørrelser af AMP'er mellem TS-foci og modent mRNA spredt i cytoplasmaet (figur 2A',B'), hvilket validerer følsomheden af denne smFISH-protokol. Det skal dog nævnes, at vi observerede en aktiv TS pr. kerne for både zfh1 og Mef2 (figur 2A',B'). Disse data validerer yderligere nøjagtigheden af sondedesignet, da Mef2 og zfh1 transkriptionsmønstre i AMP'erne colokaliserer med påvisning af deres respektive proteiner (figur 2).

I et andet trin undersøgte vi transkriptionsstedet og fordelingen af Mef2 og zfh1 mRNA'er i differentierede voksne IFM'er og associerede stamceller (figur 2C, D). Disse data illustrerer tydeligt Mef2 TS'er i syncytiale muskelkerner og Mef2 mRNA-fordeling gennem cytoplasmaet (figur 2C, C '). Zfh1 markerer specifikt MuSCs befolkning10,11. Ved hjælp af denne smFISH-protokol registrerede vi zfh1-transkription i MuSC'er markeret med Zfh1-Gal4 > GFP-udtryk. Højere forstørrelse illustrerer påvisning af både zfh1 TS og cytoplasmatiske enkelt mRNA'er (figur 2D').

Endelig brugte vi vores internt byggede ImageJ-makro til kvantitativt at analysere Mef2-transkriptionsdynamik og rumlig fordeling. Den beregningsmæssige pipeline kan effektivt detektere og segmentere Mef2-pletter og muskelkerner (figur 3A-C). På grund af problemer med signal-støj-forholdet registreres nogle pletter muligvis ikke i visse tilfælde (figur 3A',B'). Vi brugte denne automatiserede metode til at undersøge, om Mef2 mRNA-overflod varierer mellem muskelforløberceller (AMP'er) og differentierede voksne IFM'er. Vores analyse viser, at antallet af Mef2 mRNA pr. kerner i voksne IFM'er og AMP'erne ikke er signifikant forskellige (figur 3D).

For at få indsigt i den rumlige fordeling af Mef2-transkripter i voksne IFM-muskler kvantificerede vi fraktionen af cytoplasmatiske versus nukleare Mef2 mRNA-pletter (figur 3E, F). Ved hjælp af vores program tællede vi både det samlede antal Mef2 mRNA-pletter og antallet af Mef2 mRNA-pletter, der overlapper med kernefarvning (Mef2). At trække det kerneassocierede mRNA fra det totale mRNA-nummer giver antallet af cytoplasmatiske mRNA-pletter. Vores resultater afslører, at ca. 92% af Mef2 mRNA er til stede i cytoplasmaet, mens de resterende 8% er forbundet med muskelkerner, som vist i figur 3E,F.

Figure 1
Figur 1: Procedure til dissekering og klargøring af vingeskiver og IFM-prøver til smFISH. A) L3-faseinddelte larver. (B) Dissekeret og omvendt forreste ende af larven. Pile angiver vingeskiverne. (C) Isoleret vingeskive. (D) Dissekerede voksne thoraxer. E) Voksen thorax orienteret på dobbeltklæbende tape før bisektion (stiplet linje). (F) Voksen hemithorax. g) Isolerede IFM'er. (H) Arbejdsprocessen for smFISH-protokollen. Forkortelser: IFM'er = indirekte flyvemuskler; smFISH = enkeltmolekyle RNA-fluorescens in situ-hybridisering ; EtOH = ethanol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af Mef2 og zfh1 smFISH i vingeskiver og voksne IFM'er. (A,B) Mef2 og zfh1 mRNA'er (lilla) detekteres ensartet i AMP'er og co-lokaliserer med (A,A') Mef2 og (B,B') Zfh1 proteiner (grøn). (A'',B'') Højere forstørrelse af AMP'erne. (C) Mef2 mRNA'er og Mef2-protein påvises i voksne IFM'er. (C') Højere forstørrelse af det indrammede område i C. (D) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP-udtryk (grøn) mærker voksne MuSC'er. ZFH1 RNA påvises i voksne MuSC'er. (D') Højere forstørrelse af det indrammede område i D. Zfh1 transkriptionsstartsteder og enkelte mRNA'er er angivet med henholdsvis pile og pilespidser. DAPI-farvning (blå). Skalastænger = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Forkortelser: IFM'er = indirekte flyvemuskler; smFISH = enkeltmolekyle RNA-fluorescens in situ-hybridisering ; AMP'er = voksne muskelforfædre; MuSC'er = muskelstamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af Mef2-transkription og cytoplasmatisk mRNA-akkumulering ved smFISH. (A) Fordeling af Mef2-transkripter (lilla) og Mef2-protein (grøn) i vildtype voksne IFM'er. (A') Højere forstørrelse af boxed region i A. Transskriptionsstartsteder og enkelte mRNA'er er angivet med henholdsvis pile og pilespidser. (B,C) Automatisk Mef2 pletter søgning og nuklear segmentering. Cytoplasmatiske og nukleare Mef2 mRNA'er er angivet i henholdsvis grønt og magenta. (B',C') Højere forstørrelser af boksområder i B og C. Stjerner angiver pletter, der ikke tælles af makroen. D) Eksempel på spotkvantificering af Mef2 i AMP'er og voksne IFM'er i forhold til det samlede antal kerner. (p = 0,0785, elevens t-test, vingeskiver (n = 4), IFM'er (n = 11)). E) Eksempel på kvantificering af Mef2-spotfordeling i voksne IFM'er. (*** p< 0,0007, Elevens t-test, n = 5). (F) Procentdel af Mef2 mRNA-pletter detekteret i og uden for kernerne (n = 5). Skalastænger = 10 μm (A,A'). Forkortelser: IFM'er = indirekte flyvemuskler; smFISH = enkeltmolekyle RNA-fluorescens in situ-hybridisering ; AMPs = voksne muskelforfædre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Makro, der bruges til efterbehandling. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Anvendelsen af smFISH-metoden har vundet popularitet i nyere tid, hvor dens anvendelse strækker sig til forskellige celletyper og modelorganismer. I tilfælde af Drosophila stammer størstedelen af viden om voksen muskelgenekspression imidlertid fra bulkmolekylære assays, som ikke giver kvantitativ information om den præcise rumlige placering af mRNA-molekyler. For at afhjælpe dette hul har vi optimeret en metode til at udføre smFISH på muskelforløberceller og voksne Drosophila-muskler . Denne tilgang er blevet tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol23 og optimeret til Drosophila muskelvæv.

Den største hindring for at opnå smFISH-billeder af høj kvalitet er tykkelsen af voksne muskler, hvilket forhindrer optimal indtrængning af sonder. Derfor er det afgørende at adskille de voksne muskler fra dyrets andre væv og udføre hybridiseringsprocessen med mild omrøring. Dette særlige trin sikrer effektiv permeabilisering af vævene.

Et andet kritisk aspekt er, at signal-støj-forholdet kan få beregningsrørledningen til at mislykkes med at detektere visse mRNA-pletter. Vi fandt ud af, at øget signal-støj-forholdet kan opnås ved at finde den optimale koncentration af sonder. Den optimale fortynding kan variere afhængigt af sammensætningen af hvert sondesæt, herunder det konjugerede farvestof og oligonukleotidsammensætningen. Vi anbefaler at prøve forskellige fortyndinger; en endelig fortynding på 200 nM gav det bedste signal-støj-forhold for voksent væv i disse forsøg.

Med smFISH-metoden er det muligt at kvantificere antallet af nyligt syntetiserede RNA'er ved TS-foci. Når et gen transkriberes aktivt, produceres flere spirende RNA'er samtidigt ved TS. Som et resultat vil TS's intensitet overgå den for modent cytoplasmatisk RNA, og denne funktion kombineret med dens nukleare lokalisering kan differentiere TS fra individuelle cytoplasmatiske RNA'er. I forbindelse med muskelbiologi er TS-detektion og kvantificering særlig vigtig for at bestemme synkroniseringen af transkription af et specifikt gen blandt muskelkerner inden for samme syncytium. Denne beregningsrørledning er imidlertid ikke designet til at skelne mellem cytoplasmatiske mRNA- og TS-signaler. Som et alternativ foreslår vi at kombinere denne smFISH-metode med andre veletablerede smFISH-analyseværktøjer, såsom BayFISH eller FISH-quant29,30. Disse værktøjer har vist sig at lette automatiseret segmentering og fluorescensintensitetsberegninger af RNA-aggregater med bemærkelsesværdig præcision.

Endelig, mens smFISH registrerer mRNA-molekyler med høj rumlig opløsning, er det begrænset til at analysere et lille antal mRNA på samme tid. Multiskalametoder som merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridisering) muliggør samtidig analyse af et stort antal forskellige mRNA31. Ved at kombinere oligonukleotidprober og fejlkorrigerende koder letter denne metode påvisning af hundredvis af RNA-arter i enkeltceller.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Alain Vincent for hans kritiske læsning af manuskriptet. Vi takker Ruth Lehmann for at levere Zfh1-antistoffet. Vi anerkender hjælpen fra Stephanie Dutertre og Xavier Pinson til konfokal mikroskopi på MRic Imaging Platform. EL er støttet af ph.d.-stipendium fra ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA støttes af AFM-Telethon Ph.D. stipendium 23846. TP finansieres af et Chan Zuckerberg Initiative DAF-tilskud til T.P. (2019-198009). HB støttes af CNRS, Atip Avenir-programmet og AFM-Telethon trampolintilskud 23108.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope SP8 Leica SP8 DMI 6000
DAPI ThermoFisher 62248
Double-sided tape  Tesa  57910-00000
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Formaldehyde 16% Euromedex EM-15710
Mef2 antibody DHSB NA
PBS 10x Euromedex ET330
RNaseZAP Sigma-Aldrich R2020
Stellaris probes LGC NA
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer LGC SMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A LGC SMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B LGC SMF-WB1-20
Swann-Morton Blades Fisher scientific 0210
ThermoMixer Eppendorf 5382000015
Triton X-100 Euromedex 2000
UAS-mCD8::GFP line Bloomington RRID:BDSC_5137
Ultrapure water Sigma-Aldrich 95284
Watch Glass, Square, 1 5/8 in  Carolina 742300
Zfh1 antibody Gifted by Ruth Leahman
Zfh1-Gal4 Bloomington BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  2. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  3. Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
  4. Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
  5. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  6. Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
  7. Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
  8. Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
  9. Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
  10. Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
  11. Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
  12. Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
  13. Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
  14. Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
  15. Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  16. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
  17. Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
  18. Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
  19. Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
  20. Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
  21. Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
  23. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  24. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  25. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
  26. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  27. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  28. Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
  29. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  30. Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
  31. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 199 Drosophilla skeletmuskler myofibre kropsbevægelse muskelbiologi drosophila genetik Omics-tilgange konserverede molekyler muskelmorfogenese muskelregenerering transkriptionel dynamik messenger-RNA syncyti konventionelle metoder enkeltmolekyle-RNA-fluorescens in situ-hybridisering (smFISH) MRNA-molekyler flyvemuskler muskelstamceller transkriptionsfaktorer Mef2 Zfh1 / Zeb
Undersøgelse af muskeltranskriptionsdynamik ved enkeltmolekyleskalaer i <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leroux, E., Ammar, N., Moinet, S.,… More

Leroux, E., Ammar, N., Moinet, S., Pecot, T., Boukhatmi, H. Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila. J. Vis. Exp. (199), e65713, doi:10.3791/65713 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter