Summary
Drosophila ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung von Schlüsselmolekülen, die die Myogenese regulieren. Derzeitige Methoden reichen jedoch nicht aus, um die Dynamik der mRNA-Transkription und die räumliche Verteilung innerhalb der Synzytien zu bestimmen. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode optimiert, die den Nachweis und die Quantifizierung von mRNAs auf Einzelmolekülebene ermöglicht.
Abstract
Skelettmuskeln sind große Synzytien, die aus vielen gebündelten Myofasern bestehen, die Kräfte erzeugen und Körperbewegungen ermöglichen. Drosophila ist ein klassisches Modell zur Untersuchung der Muskelbiologie. Die Kombination von Drosophila-Genetik und fortschrittlichen Omics-Ansätzen führte zur Identifizierung von konservierten Schlüsselmolekülen, die die Muskelmorphogenese und -regeneration regulieren. Die Transkriptionsdynamik dieser Moleküle und die räumliche Verteilung ihrer Boten-RNA innerhalb der Synzytien können jedoch mit herkömmlichen Methoden nicht beurteilt werden. Hier haben wir eine bestehende Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (smFISH) optimiert, um die Detektion und Quantifizierung einzelner mRNA-Moleküle in adulten Flugmuskeln und ihren Muskelstammzellen zu ermöglichen. Als Proof of Concept haben wir die mRNA-Expression und -Verteilung von zwei evolutionär konservierten Transkriptionsfaktoren, Mef2 und Zfh1/Zeb, analysiert. Wir zeigen, dass diese Methode einzelne mRNA-Moleküle sowohl für Transkripte in den Muskelvorläuferzellen, adulten Muskeln als auch in Muskelstammzellen effizient nachweisen und quantifizieren kann.
Introduction
Die Skelettmuskulatur von Erwachsenen besteht aus differenzierten, mehrkernigen Myofasern, deren kontraktile Eigenschaften Bewegungen erzeugen. Muskelwachstum, -erhalt und -regeneration hängen von Muskelvorläuferzellen und Muskelstammzellen (MuSCs) ab, die während der Embryonalentwicklung spezifiziert werden1. Das myogene Programm wird durch eine Reihe von myogenen Transkriptionsfaktoren (TFs) fein gesteuert (z. B. Pax3/7, MYOD, Mef2 und ZEB)2,3,4. Die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die die Muskelbiologie regulieren, ist wichtig für die Aufklärung grundlegender myologischer Fragestellungen und für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei der Behandlung muskeldegenerativer Erkrankungen.
Drosophila hat eine lange Geschichte als genetisches Modell zur Untersuchung der Myogenese5. Es ist kürzlich als neues Modell zur Untersuchung der Muskelregeneration aufgetaucht 6,7,8. Die Muskelstruktur und die myogenen Kernprogramme sind zwischen Fliegen und Säugetieren hoch konserviert. Zum Beispiel haben die TFs Mef2 und Zfh1/ZEB eine konservierte Funktion bei der Regulierung des Muskelaufbaus und der Regeneration 3,9,10,11. Adulte Drosophila-Muskeln, wie z. B. die Indirect Flight Muscle (IFMs), werden aus einer bestimmten Population von MuSCs gebildet, die als Adult Muscle Progenitors (AMPs) bezeichnet werden12. Diese AMPs werden während der Embryogenese spezifiziert und assoziieren mit Epithelstrukturen wie Flügel- und Beinscheiben. Während des gesamten Embryonal- und Larvenstadiums bleiben AMPs bis zur Metamorphose undifferenziert, wenn sie sich differenzieren und fusionieren, um die IFMs zu bilden13,14. Die TF Spalt major (spalt, salm) wird während der Entwicklung der Flugmuskulatur exprimiert und ist notwendig, um ihre strukturelle Identität zu bestimmen15. Mef2 ist ein weiterer wichtiger myogener TF, der für die Muskelbildung im Erwachsenenalter unerlässlich ist16,17. Sie wird in den AMPs ausgedrückt und in den adulten IFMsbeibehalten 10,18. Während sich die Mehrzahl der AMPs in funktionelle Muskeln differenziert, entzieht sich eine Untergruppe der Differenzierung und bildet die adulten MuSCs11. Ähnlich wie bei Wirbeltieren wird der TF Zfh1/ZEB benötigt, um eine vorzeitige Differenzierung der adulten MuSCs zu verhindern und ihre Stammfähigkeit zu erhalten 9,10.
Es wurde nachgewiesen, dass die Genexpressionsdynamik verschiedene muskelbiologische Prozesse reguliert19,20. Das Aufkommen von Hochdurchsatz-Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierungstechniken hat eine umfassende Erforschung dieser Transkriptionsdynamik ermöglicht21,22. Eine bemerkenswerte Einschränkung dieser Ansätze ist ihre Unfähigkeit, die räumliche Verteilung von mRNA-Molekülen in den mehrkernigen Muskelfasern zu gewährleisten. Diese Eigenschaften können durch Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) untersucht werden, die zwei Arten von mRNA-Körpern aufzeigt: 1. Einzelne mRNA-Moleküle, die sich im Zytoplasma verteilen und die reife RNA repräsentieren, und 2. Maximal zwei helle Kernherde entsprechen dem entstehenden Transkript und zeigen die transkriptionell aktiven Allele23. Daher ist smFISH eine Methode der Wahl für die Quantifizierung einzelner mRNA-Moleküle, um deren räumliche Verteilung zu untersuchen und Momentaufnahmen der Gentranskriptionsdynamik zu liefern.
Die smFISH-Methode beruht auf einer Reihe von kurzen fluoreszierenden Oligonukleotidsonden, die speziell als Komplementär zum Zieltranskript entwickelt wurden. Beim Annealing erzeugt es hochintensive Punktquellen, die den Nachweis von mRNA auf Einzelmolekülebene unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie24 ermöglichen. Diese Methode wird zunehmend für eine Vielzahl von Zelltypen angewendet, darunter auch für Muskelgewebe von Säugetieren19,20. In Drosophila, wie auch in anderen Tiermodellen, stammt das meiste Wissen über die Genexpression adulter Muskeln jedoch aus molekularen Assays, denen quantitative Informationen über die räumliche Lage von mRNA-Molekülen fehlen. In dieser Arbeit haben wir eine Methode zur Durchführung von smFISH an Muskelvorläuferzellen und adulten Drosophila-Muskeln optimiert23,25. Dieses Protokoll umfasst eine vollautomatische Analysepipeline für die Zellkernsegmentierung sowie die mRNA-Zählung und -Lokalisierung.
Protocol
1. Dissektion und Präparation von Flügelscheiben und adulten Muskeln
HINWEIS: Reinigen Sie die Dissektionsbank und alle Dissektionsinstrumente mit RNASE-Inhibitor-Lösung (Materialtabelle). Während des gesamten Versuchsablaufs sollten Laborhandschuhe getragen werden.
- Flügel-Scheibe
- Legen Sie die L3-Larven in kalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Abbildung 1A).
- Spülen Sie die Larven 3x mit 1x PBS ab und lassen Sie sie 5 Minuten in dieser Lösung.
- Halten Sie die Larve mit zwei scharfen Pinzettenpaaren vom vorderen Teil aus und ziehen Sie das restliche Körpergewebe (ca. 2/3) heraus und entsorgen Sie es.
- Halten Sie sowohl das erste 1/3 der Larve mit einer Pinzette als auch die Maulhaken mit dem anderen Paar fest. Ziehen Sie die Maulhaken im Inneren der Larve zurück, bis sie vollständig umgedreht ist.
HINWEIS: Sezieren Sie ca. 30 Larven pro Experiment, um eine ausreichende Probengröße für die Analyse zu gewährleisten. - Beachten Sie, dass die Flügelscheiben eng mit den beiden primären Ästen der Luftröhre verbunden sind, die auf beiden Seiten der Larve verlaufen.
- Entfernen Sie alle anderen Larvenbestandteile (Beinscheiben und Gehirn), um einen sauberen umgekehrten Larvenkadaver mit einem Paar Flügelscheiben an der Luftröhre zu erhalten (Abbildung 1B).
- Geben Sie die Proben in ein 1-ml-Zentrifugenröhrchen und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 1x PBS, für 45 min bei Raumtemperatur unter Rühren.
HINWEIS: Das Rühren der Probe wird durch einen oszillierenden Rührer (Materialtabelle) erreicht. - Waschen Sie die Proben 3 x 5 min mit 70%igem Ethanol (EtOH, verdünnt in RNAse-freiem Wasser) und lagern Sie sie in derselben Waschlösung bei 4 °C für mindestens 2 Tage und bis zu 1 Woche.
- Indirekte Flugmuskulatur
- Betäuben Sie die erwachsenen Fliegen auf einem CO2 - Fliegenpad und entfernen Sie die Köpfe, Bauch, Beine und Flügel.
- Legen Sie die präparierten Thorax in kalte 1x PBS und fahren Sie damit fort, bis alle Proben präpariert sind (Abbildung 1D).
- Präfixieren Sie die Thoraxe in 4 % PFA (1 % Triton) für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren.
- Spülen Sie die Proben 3 x 5 min mit 1x PBT-Waschlösung (1% Triton in 1x PBS).
- Positionieren Sie die Thoraxe auf einem doppelseitigen Klebeband (Materialtabelle) auf einem Objektträger und halbieren Sie sie mit einer scharfen Mikrotomklinge, um zwei Halbhiraxen zu erzeugen (Abbildung 1E,F).
- Fixieren Sie die Proben in 4 % PFA (1 % Triton) für 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren.
- 2 x 20 min mit 1x PBT-Waschlösung (1% Triton, 1x PBS) bei Raumtemperatur unter Rühren waschen.
- Legen Sie die Hemi-Thorax in kalte 1x PBS und verwenden Sie die Pinzette, um die IFMs vorsichtig von der Hemi-Thorax zu isolieren (Abbildung 1G).
HINWEIS: Um dies zu erreichen, ist es wichtig, die Nagelhaut so gründlich wie möglich zu entfernen. - Um die Proben zu permeabilisieren, lagern Sie die isolierten IFMs in 70%iger EtOH-Lösung für mindestens 2 Tage und bis zu 1 Woche bei 4 °C.
HINWEIS: Isolieren Sie die IFMs aus ca. 10 Thoraxen pro Experiment, um eine ausreichende Probengröße für die Analyse zu gewährleisten.
2. Hybridisierung, Immunfärbung und Einbettung
ANMERKUNG: Ein ähnliches Hybridisierungsverfahren wird sowohl für Flügelscheiben als auch für IFM-Proben angewendet. Es ist wichtig, die Flügelscheiben von den Larvenkadavern zu isolieren und sie vor Beginn der Hybridisierung in 200 μl Puffer A zu legen.
- Resuspendieren Sie die Sonden in 400 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), um eine endgültige Stammlösung von 12,5 μM zu erhalten.
- Die Proben werden in ein 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit Puffer A (Materialtabelle) überführt.
HINWEIS: Durch die Verringerung des Volumens des Behälters wird es einfacher, die Proben zu visualisieren und zu vermeiden, dass sie während des Waschvorgangs verloren gehen. - Waschen Sie die Proben 2 x 20 min mit Puffer A.
- Aspirieren Sie Puffer A, ersetzen Sie ihn durch 400 μl des Hybridisierungspuffers (Materialtabelle) und prähybridisieren Sie die Proben für 30 Minuten bei 37 °C in einem thermischen Mischer (Materialtabelle).
- Verdünnen Sie die Sonden im Hybridisierungspuffer auf eine Endkonzentration von 125 nM für Flügelscheiben und 200 nM für erwachsene Muskeln und fügen Sie den Primärantikörper hinzu.
HINWEIS: Die Verdünnung des Antikörpers variiert je nach verwendetem Antikörper (Materialtabelle). Die Zugabe von Antikörpern ist optional. Benutzer können sich dafür entscheiden, auf die Proteinfärbung zu verzichten und stattdessen ein ähnliches smFISH-Protokoll zu verwenden, das keine Zugabe von Antikörpern beinhaltet. - Saugen Sie den Hybridisierungspuffer an und ersetzen Sie ihn durch 100 μl Hybridisierungspuffer, der die Sonde und den Antikörper enthält.
- Die Proben werden im Dunkeln bei 37 °C für mindestens 16 h unter 300 U/min in einem thermischen Mischer inkubiert.
- Ein Aliquot von Puffer A wird auf 37 °C erwärmt.
- Waschen Sie die Proben für 3 x 10 min im Thermomischer bei 37 °C unter 300 U/min Rühren.
- Während des letzten Waschgangs werden der Sekundärantikörper (1/200) und DAPI (1/10.000) in Puffer A verdünnt und die Proben in dieser Lösung bei 37 °C für mindestens 1 h inkubiert.
- Waschen Sie die Proben 3 x 20 min lang mit Puffer B (Materialtabelle).
- Übertragen Sie die Proben vorsichtig auf einen Objektträger, wischen Sie den verbleibenden Puffer B ab, fügen Sie 30 μl Eindeckmedium hinzu und decken Sie sie mit einem Deckglas von 18 x 18 mm ab. Verwenden Sie einen Nagellack, um das Präparat zu versiegeln.
- Lagern Sie die Proben bis zu 1 Woche bei 4 °C.
HINWEIS: Es wird jedoch empfohlen, die Bildgebung so schnell wie möglich durchzuführen, um eine Verschlechterung des Sondensignals zu vermeiden.
3. Bildgebung
- Erfassen Sie Bilder mit einem xyz-Aufnahmemodus mit einem konfokalen Mikroskop, das mit 40x- und 63x-Ölimmersionsobjektiven ausgestattet ist (Materialtabelle). Das smFISH-Signal wird vom HyD-Detektor über einen Photonenzählmodus detektiert.
- Lokalisieren Sie die Proben mit dem DAPI-Signal und der UV-Lampe.
- Um die mit der Flügelscheibe assoziierten Muskelvorläuferzellen und IFMs abzubilden (Abbildung 2 und Abbildung 3), wenden Sie den folgenden Aufbau für Laserlinien und Emissionsfilter an: Wählen Sie DAPI (Anregung (z. B. 405 nm), Emission (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm) und Quasar 670 für die smFISH-Sonden (z.B. 647 nm, em. 670 nm).
- Um die erwachsenen MuSCs abzubilden (Abbildung 2D), wenden Sie das folgende Setup für Laserlinien und Emissionsfilter an: Wählen Sie DAPI (z. B. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (ex. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm) und Quasar 670 für die smFISH-Sonden (z.B. 647 nm, em. 670 nm).
HINWEIS: Für die Bildgebung können die Wellenlängen entsprechend den Farbstoffen angepasst werden, die mit sekundären Antikörpern und Sonden verbunden sind. - Speichern Sie die konfokalen Bilder unter . TIFF-Dateien.
4. Analyse nach der Bildgebung
- Starten Sie zunächst ImageJ und navigieren Sie zum Menü Plugins . Wählen Sie dort Makros | Bearbeiten , um den Quellcode des Makros zu öffnen.
HINWEIS: Dadurch können Sie die Parameter nach Bedarf anpassen und bei Bedarf das Ordnerverzeichnis für jeden Kanal im Quellcode des Makros ändern. - Um dieses Protokoll zu befolgen und Mef2 smFISH-Flecken in Larven zu quantifizieren, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Log_radius = 3,0 und Log_quality = 20,0. Segement Mef2-positive Kerne mit Unschärfe = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
- Verwenden Sie in den Muskelfasern die folgenden Parameter: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; Unschärfe = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
- Um das Makro zu initiieren, führen Sie einfach den Befehl run aus und warten Sie, bis das Makro automatisch alle Bilder aus dem angegebenen Ordner lädt und sequenziell quantifiziert.
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Dauer dieses Vorgangs je nach Datenvolumen von wenigen Sekunden bis zu mehreren Stunden variieren kann. - Suchen Sie nach den Ergebnissen, die in zwei neuen .csv Dateien angezeigt werden: file_FISH_results und file_nuclei_results. Die erste zeigt die Anzahl der Transkriptionsspots und ihre durchschnittliche und maximale Intensität. Die zweite gibt sowohl die Gesamtzahl der Kerne als auch die Anzahl der Punkte in jedem Kern an.
Representative Results
In diesem Protokoll haben wir kommerziell hergestellte Sonden verwendet, die auf Mef2- und zfh1-mRNA abzielen. Wir haben die Sonden mit dem FISH-Sonden-Designer des Herstellers (Materialtabelle) entworfen. Das Mef2-Set zielt auf die Exons ab, die allen Mef2-RNA-Isoformen gemeinsam sind (von Exon 3 bis Exon 10). Das zfh1-Set zielt auf das dritte Exon ab, das sowohl den Isoformen zfh1-RB als auch zfh1-RE gemeinsam ist 10. Beide Sonden sind an den Fluoreszenzfarbstoff Quasar 670 konjugiert.
Wir haben intern ein Makro erstellt, das mit der ImageJ-Software kompatibel war, um die .tif Rohdaten automatisch zu analysieren. Das Makro ermöglicht die 3D-Segmentierung der Kerne durch Cellpose26 mit dem Fidschi-Plugin BIOP und die transkriptionelle Spot-Quantifizierung durch einen Laplace-Gauß-Generator, wie sie im Trackmate-Plugin27 implementiert ist. Für die Nachbearbeitung wird das MorpholibJ-Plugin28 verwendet (Supplemental File 1).
In einem ersten Schritt führten wir smFISH auf Flügel-Imaginalscheiben durch, von denen bekannt ist, dass Mef2 und zfh1 in den AMPs exprimiert werden. Diese Daten zeigen, dass beide Transkripte in der AMPs-Population, die entweder mit Mef2- oder Zfh1-Antikörpern kogefärbt ist, einheitlich nachgewiesen werden (Abbildung 2A,B). Aktive Transkriptionsstellen (TS) können durch smFISH aufgedeckt und von reifer mRNA unterschieden werden, da sie tendenziell größer sind und intensivere Signale aufweisen als einzelne zytoplasmatische Transkripte oder reife nukleäre Transkripte. Konsistent unterscheiden höhere Vergrößerungen von AMPs zwischen TS-Foci und reifer mRNA, die im Zytoplasma verstreut ist (Abbildung 2A',B'), was die Sensitivität dieses smFISH-Protokolls bestätigt. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass wir sowohl für zfh1 als auch für Mef2 einen aktiven TS pro Zellkern beobachtet haben (Abbildung 2A',B'). Diese Daten bestätigen die Genauigkeit des Sondendesigns, da die Transkriptionsmuster von Mef2 und zfh1 in den AMPs mit der Detektion ihrer jeweiligen Proteine kolokalisieren (Abbildung 2).
In einem zweiten Schritt untersuchten wir die Transkriptionsstelle und Verteilung von Mef2- und zfh1-mRNAs in differenzierten adulten IFMs und assoziierten Stammzellen (Abbildung 2C,D). Diese Daten veranschaulichen deutlich die Mef2-TSs in den synzytialen Muskelkernen und die Mef2-mRNA-Verteilung im gesamten Zytoplasma (Abbildung 2C,C'). Zfh1 markiert speziell die MuSCs-Population 10,11. Mit Hilfe dieses smFISH-Protokolls konnten wir erfolgreich die zfh1-Transkription in MuSCs nachweisen, die durch Zfh1-Gal4 > GFP-Expression gekennzeichnet sind. Eine höhere Vergrößerung veranschaulicht den Nachweis sowohl von zfh1 TS als auch von zytoplasmatischen Einzel-mRNAs (Abbildung 2D').
Schließlich haben wir unser intern entwickeltes ImageJ-Makro verwendet, um die Transkriptionsdynamik und räumliche Verteilung von Mef2 quantitativ zu analysieren. Die Rechenpipeline kann Mef2-Punkte und Muskelkerne effizient erkennen und segmentieren (Abbildung 3A-C). Aufgrund von Problemen mit dem Signal-Rausch-Verhältnis können jedoch einige Stellen in bestimmten Fällen nicht erkannt werden (Abbildung 3A',B'). Wir haben diese automatisierte Methode verwendet, um zu untersuchen, ob die Mef2-mRNA-Häufigkeit zwischen Muskelvorläuferzellen (AMPs) und differenzierten adulten IFMs variiert. Unsere Analyse zeigt, dass sich die Anzahl der Mef2-mRNA pro Zellkern in adulten IFMs und den AMPs nicht signifikant unterscheidet (Abbildung 3D).
Um einen Einblick in die räumliche Verteilung von Mef2-Transkripten in adulten IFM-Muskeln zu erhalten, quantifizierten wir den Anteil von zytoplasmatischen und nukleären Mef2-mRNA-Spots (Abbildung 3E,F). Mit unserem Programm haben wir sowohl die Gesamtzahl der Mef2-mRNA-Spots als auch die Anzahl der Mef2-mRNA-Spots, die sich mit der Zellkernfärbung (Mef2) überlappen, gezählt. Subtrahiert man die Zellkern-assoziierte mRNA von der Gesamtzahl der mRNAs, erhält man die Anzahl der zytoplasmatischen mRNA-Spots. Unsere Ergebnisse zeigen, dass etwa 92 % der Mef2-mRNA im Zytoplasma vorhanden sind, während die restlichen 8 % mit Muskelkernen assoziiert sind, wie in Abbildung 3E,F gezeigt.
Abbildung 1: Verfahren zur Präparation von Flügelscheiben und IFM-Proben für smFISH. (A) L3-Larven. (B) Präpariertes und invertiertes vorderes Ende der Larve. Pfeile zeigen die Flügelscheiben an. (C) Isolierte Flügelscheibe. (D) Präparierte adulte Thoraxe. (E) Adulter Thorax, der vor der Halbierung auf einem doppelseitigen Tape ausgerichtet ist (gestrichelte Linie). (F) Adulter Hemithorax. g) Isolierte IFM. (H) Arbeitsablauf des smFISH-Protokolls. Abkürzungen: IFMs = indirekte Flugmuskeln; smFISH = Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; EtOH = Ethanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von Mef2 und zfh1 smFISH in Flügelscheiben und adulten IFMs. (A,B) Mef2- und zfh1-mRNAs (violett) werden einheitlich in AMPs detektiert und kolokalisieren mit (A,A') Mef2- bzw. (B,B') Zfh1-Proteinen (grün). (A'',B'') Höhere Vergrößerung der AMPs. (C) Mef2-mRNAs und Mef2-Proteine werden in adulten IFMs nachgewiesen. (C') Höhere Vergrößerung des Boxed-Bereichs in C. (D) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP-Expression (grün) markiert adulte MuSCs. ZFH1 RNA wird in adulten MuSCs nachgewiesen. (D') Höhere Vergrößerung des Boxed-Bereichs in D. Die Startstellen der Zfh1-Transkription und die einzelnen mRNAs sind durch Pfeile bzw. Pfeilspitzen gekennzeichnet. DAPI-Färbung (blau). Maßstabsbalken = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Abkürzungen: IFMs = indirekte Flugmuskeln; smFISH = Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; AMPs = adulte Muskelvorläufer; MuSCs = Muskelstammzellen; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Mef2-Transkription und der zytoplasmatischen mRNA-Akkumulation mittels smFISH. (A) Verteilung von Mef2-Transkripten (violett) und Mef2-Protein (grün) in adulten Wildtyp-IFMs. (A') Höhere Vergrößerung des Boxed-Bereichs in A. Transkriptionsstartstellen und einzelne mRNAs sind durch Pfeile bzw. Pfeilspitzen gekennzeichnet. (B,C) Automatisches Auffinden von Mef2-Spots und Kernsegmentierung. Zytoplasmatische und nukleäre Mef2-mRNAs sind grün bzw. magenta dargestellt. (B',C') Höhere Vergrößerungen von geschachtelten Bereichen in B und C. Sternchen kennzeichnen Stellen, die vom Makro nicht gezählt werden. (D) Beispiel für die Mef2-Spot-Quantifizierung in AMPs und adulten IFMs, bezogen auf die Gesamtzahl der Kerne. (p = 0,0785, Student's t-Test, Flügelscheiben (n = 4), IFMs (n = 11)). (E) Beispiel für die Quantifizierung der Mef2-Spot-Verteilung in adulten IFMs. (*** p< 0,0007, t-Test des Schülers, n = 5). (F) Prozentsatz der Mef2-mRNA-Spots, die innerhalb und außerhalb der Zellkerne nachgewiesen wurden (n = 5). Maßstabsbalken = 10 μm (A,A'). Abkürzungen: IFMs = indirekte Flugmuskeln; smFISH = Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; AMPs = erwachsene Muskelvorläufer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Datei 1: Makro für die Nachbearbeitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Die Anwendung der smFISH-Methode hat in jüngster Zeit an Popularität gewonnen, wobei sie sich auf verschiedene Zelltypen und Modellorganismen erstreckt. Im Fall von Drosophila stammt der Großteil des Wissens über die Genexpression adulter Muskeln jedoch aus molekularen Assays, die keine quantitativen Informationen über die genaue räumliche Lage von mRNA-Molekülen liefern. Um diese Lücke zu schließen, haben wir eine Methode zur Durchführung von smFISH an Muskelvorläuferzellen und adulten Drosophila-Muskeln optimiert. Dieser Ansatz wurde von einem zuvor veröffentlichten Protokoll23 adaptiert und für Drosophila-Muskelgewebe optimiert.
Das größte Hindernis bei der Gewinnung qualitativ hochwertiger smFISH-Bilder ist die Dicke der erwachsenen Muskeln, die das optimale Eindringen der Sonden behindert. Daher ist es wichtig, die erwachsenen Muskeln von den anderen Geweben des Tieres zu trennen und den Hybridisierungsprozess mit leichter Bewegung durchzuführen. Dieser spezielle Schritt sorgt für eine effektive Permeabilisierung des Gewebes.
Ein weiterer kritischer Aspekt ist, dass das Signal-Rausch-Verhältnis dazu führen kann, dass die Rechenpipeline bei der Erkennung bestimmter mRNA-Spots versagt. Wir haben herausgefunden, dass eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses erreicht werden kann, indem die optimale Konzentration der Sonden gefunden wird. Die optimale Verdünnung kann je nach Zusammensetzung jedes Sondensatzes, einschließlich des konjugierten Farbstoffs und der Oligonukleotidzusammensetzung, variieren. Wir empfehlen, verschiedene Verdünnungen auszuprobieren; Eine endgültige Verdünnung von 200 nM ergab in diesen Experimenten das beste Signal-Rausch-Verhältnis für adultes Gewebe.
Mit der smFISH-Methode ist es möglich, die Anzahl der neu synthetisierten RNAs an den TS-Herden zu quantifizieren. Wenn ein Gen aktiv transkribiert wird, werden am TS gleichzeitig mehrere nascente RNAs produziert. Infolgedessen wird die Intensität des TS die der reifen zytoplasmatischen RNA übertreffen, und dieses Merkmal in Kombination mit seiner Kernlokalisierung kann das TS von einzelnen zytoplasmatischen RNAs unterscheiden. Im Kontext der Muskelbiologie sind TS-Detektion und -Quantifizierung besonders wichtig, um die Synchronisation der Transkription eines bestimmten Gens zwischen Muskelkernen innerhalb desselben Synzytiums zu bestimmen. Diese Rechenpipeline ist jedoch nicht darauf ausgelegt, zwischen zytoplasmatischen mRNA- und TS-Signalen zu unterscheiden. Als Alternative empfehlen wir, diese smFISH-Methode mit anderen etablierten smFISH-Analysewerkzeugen wie BayFISH oder FISH-quant29,30 zu kombinieren. Es hat sich gezeigt, dass diese Werkzeuge die automatisierte Segmentierung und Fluoreszenzintensitätsberechnung von RNA-Aggregaten mit bemerkenswerter Präzision ermöglichen.
Während smFISH mRNA-Moleküle mit hoher räumlicher Auflösung detektiert, ist es auf die gleichzeitige Analyse einer kleinen Anzahl von mRNA beschränkt. Multiskalenmethoden wie merFISH (Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization) ermöglichen die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl unterschiedlicher mRNA31. Durch die Kombination von Oligonukleotidsonden und fehlerkorrigierenden Codes erleichtert diese Methode den Nachweis von Hunderten von RNA-Spezies in einzelnen Zellen.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Alain Vincent für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Ruth Lehmann für die Bereitstellung des Zfh1-Antikörpers. Wir danken Stephanie Dutertre und Xavier Pinson für die konfokale Mikroskopie an der MRic Imaging Platform. EL wird durch ein Promotionsstipendium des Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique unterstützt. NA wird durch das AFM-Telethon Ph.D. Fellowship 23846 unterstützt. TP wird durch ein DAF-Stipendium der Chan Zuckerberg Initiative an T.P. (2019-198009) finanziert. HB wird vom CNRS, dem Atip Avenir-Programm und dem AFM-Telethon Trampolin-Stipendium 23108 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
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