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Developmental Biology

ड्रोसोफिला में एकल-अणु तराजू पर मांसपेशी ट्रांसक्रिप्शनल डायनेमिक्स का अध्ययन

Published: September 8, 2023 doi: 10.3791/65713
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR), UMR6290 CNRS - Université de Rennes, 2BIOSIT, UAR 3480 US 018, Université de Rennes

Summary

ड्रोसोफिला प्रमुख अणुओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है जो मायोजेनेसिस को नियंत्रित करता है। हालांकि, वर्तमान विधियां सिंकिटिया के भीतर एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता और स्थानिक वितरण निर्धारित करने के लिए अपर्याप्त हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हम स्वस्थानी संकरण विधि में एक शाही सेना प्रतिदीप्ति अनुकूलित एक एकल अणु पैमाने पर mRNAs का पता लगाने और मात्रा का ठहराव की अनुमति.

Abstract

कंकाल की मांसपेशियां बड़ी सिंकिटिया होती हैं जो कई बंडल किए गए मायोफाइबर से बनी होती हैं जो बलों का उत्पादन करती हैं और शरीर की गति को सक्षम करती हैं। ड्रोसोफिला मांसपेशी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय मॉडल है। ड्रोसोफिला आनुवंशिकी और उन्नत ओमिक्स दृष्टिकोण दोनों के संयोजन ने प्रमुख संरक्षित अणुओं की पहचान की जो मांसपेशियों की आकृति विज्ञान और उत्थान को नियंत्रित करते हैं। हालांकि, इन अणुओं की ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता और सिंकिटिया के भीतर उनके मैसेंजर आरएनए के स्थानिक वितरण का आकलन पारंपरिक तरीकों से नहीं किया जा सकता है। यहां हमने वयस्क उड़ान मांसपेशियों और उनकी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के भीतर व्यक्तिगत एमआरएनए अणुओं का पता लगाने और मात्रा का ठहराव को सक्षम करने के लिए सीटू संकरण (एसएमफिश) विधि में एक मौजूदा एकल-अणु आरएनए प्रतिदीप्ति को अनुकूलित किया। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने दो विकासवादी संरक्षित प्रतिलेखन कारकों, Mef2 और Zfh1/Zeb के mRNA अभिव्यक्ति और वितरण का विश्लेषण किया है। हम दिखाते हैं कि यह विधि मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं, वयस्क मांसपेशियों और मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं में दोनों प्रतिलेखों के लिए एकल एमआरएनए अणुओं का कुशलतापूर्वक पता लगा सकती है और उनकी मात्रा निर्धारित कर सकती है।

Introduction

वयस्क कंकाल की मांसपेशियां विभेदित बहुउद्देशीय मायोफाइबर से बनी होती हैं जिनके सिकुड़ा हुआ गुण आंदोलनों को उत्पन्न करते हैं। मांसपेशियों की वृद्धि, रखरखाव, और उत्थान मांसपेशी पूर्वज और मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर (MuSCs) कि भ्रूण के विकास1 के दौरान निर्दिष्ट कर रहे हैं. मायोजेनिक कार्यक्रम को कोर मायोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों (टीएफ) (जैसे, पैक्स 3/7, एमवाईओडी, एमईएफ 2, और जेडईबी) 2,3,4के एक सेट द्वारा बारीक रूप से नियंत्रित किया जाता है। मांसपेशियों के जीव विज्ञान को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को समझना मौलिक मायोलॉजी से संबंधित प्रश्नों को स्पष्ट करने और मांसपेशी-अपक्षयी रोगों के इलाज में संभावित चिकित्सीय उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है।

मायोजेनेसिस5 का अध्ययन करने के लिए आनुवंशिक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला का एक लंबा इतिहास है। यह हाल ही में मांसपेशियों के उत्थान 6,7,8 की जांच करने के लिए एक नए मॉडल के रूप में उभरा है। मांसपेशियों की संरचना और कोर मायोजेनिक कार्यक्रम मक्खियों और स्तनधारियों के बीच अत्यधिक संरक्षित होते हैं। उदाहरण के लिए, TFs Mef2 और Zfh1/ZEB मांसपेशियों के विकास और पुनर्जनन 3,9,10,11 को विनियमित करने में एक संरक्षित कार्य है। वयस्क ड्रोसोफिला मांसपेशियों, जैसे अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों (आईएफएम), एमयूएससी की एक विशिष्ट आबादी से बनते हैं, जिन्हें वयस्क मांसपेशी पूर्वज (एएमपी)12के रूप में जाना जाता है। ये एएमपी भ्रूणजनन के दौरान निर्दिष्ट होते हैं और पंख और पैर डिस्क जैसे उपकला संरचनाओं के साथ संबद्ध होते हैं। भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान, एएमपी कायापलट तक उदासीन रहते हैं जब वे आईएफएम13,14 बनाने के लिए भेदभाव और संलयन में संलग्न होते हैं। TF स्पाल्ट प्रमुख (स्पाल्ट, सैल्म) उड़ान मांसपेशियों के विकास के दौरान व्यक्त किया जाता है और उनकी संरचनात्मक पहचान15 निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. Mef2 वयस्क मांसपेशियों के गठन16,17 के लिए आवश्यक है कि एक और महत्वपूर्ण myogenic TF है. यह एएमपी में व्यक्त किया जाता है और वयस्क आईएफएम10,18 में बनाए रखा जाता है। जबकि अधिकांश एएमपी कार्यात्मक मांसपेशियों में अंतर करते हैं, एक सबसेट भेदभाव से बच जाता है और वयस्क म्यूएससी11 बनाता है। कशेरुकियों के समान, TF Zfh1/ZEB वयस्क MuSCs के समय से पहले भेदभाव को रोकने और उनके तने 9,10 को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता विभिन्न मांसपेशी जैविक प्रक्रियाओं19,20 को विनियमित करने के लिए सिद्ध किया गया है. उच्च-थ्रूपुट एकल-कोशिका और एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण तकनीकों के आगमन ने इन ट्रांसक्रिप्शनल डायनेमिक्स21,22की व्यापक खोज को सक्षम किया है। इन दृष्टिकोणों की एक उल्लेखनीय सीमा बहुउद्देशीय मांसपेशी फाइबर में एमआरएनए अणुओं के स्थानिक वितरण प्रदान करने में असमर्थता है। इन विशेषताओं की जांच स्वस्थानी संकरण (smFISH) में एकल-अणु प्रतिदीप्ति द्वारा की जा सकती है जो दो प्रकार के mRNA निकायों को प्रकट करती है: 1. व्यक्तिगत mRNA अणु साइटोप्लाज्म में फैलते हैं और परिपक्व RNA का प्रतिनिधित्व करते हैं और 2. अधिकतम दो उज्ज्वल परमाणु foci नवजात प्रतिलेख के अनुरूप हैं और ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय एलील23 को प्रकट करते हैं। इसलिए, smFISH व्यक्तिगत mRNA अणु मात्रा का ठहराव के लिए पसंद की एक विधि है, उनके स्थानिक वितरण की जांच करना और जीन ट्रांसक्रिप्शनल डायनामिक्स के स्नैपशॉट प्रदान करना।

smFISH विधि विशेष रूप से लक्ष्य प्रतिलेख के पूरक होने के लिए डिज़ाइन किए गए लघु फ्लोरोसेंट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के एक सेट पर निर्भर करती है। एनीलिंग पर, यह उच्च तीव्रता बिंदु स्रोतों को उत्पन्न करता है जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी24 का उपयोग करके एकल-अणु स्तर पर एमआरएनए का पता लगाने की अनुमति देता है। इस विधि तेजी से स्तनधारी मांसपेशियों के ऊतकों19,20 सहित सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जाता है. हालांकि, ड्रोसोफिला में अन्य पशु मॉडल की तरह, वयस्क मांसपेशी जीन अभिव्यक्ति के बारे में अधिकांश ज्ञान थोक आणविक परख से लिया गया है, जिसमें एमआरएनए अणुओं के स्थानिक स्थान पर मात्रात्मक जानकारी का अभाव है। यहाँ हम मांसपेशियों अग्रदूत कोशिकाओं और वयस्क ड्रोसोफिला मांसपेशियों23,25 पर smFISH प्रदर्शन के लिए एक विधि अनुकूलित. इस प्रोटोकॉल नाभिक विभाजन और mRNA गिनती और स्थानीयकरण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन भी शामिल है.

Protocol

1. विंग डिस्क और वयस्क मांसपेशी विच्छेदन और तैयारी

नोट: विच्छेदन बेंच और RNAse अवरोधक समाधान (सामग्री की तालिका) के साथ सभी विच्छेदन उपकरणों को साफ करें। प्रयोगशाला दस्ताने पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान पहना जाना चाहिए.

  1. विंग डिस्क
    1. एल 3 मंचित लार्वा को ठंडे 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस)(चित्रा 1ए)में रखें।
    2. 1x पीबीएस के साथ लार्वा 3x कुल्ला और उन्हें 5 मिनट के लिए इस समाधान में रखें।
    3. तेज संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, पूर्वकाल भाग से लार्वा पकड़ और खींच और शरीर के ऊतकों (2/3 के आसपास) के बाकी त्यागें.
    4. लार्वा के पहले 1/3 दोनों को संदंश की एक जोड़ी और दूसरे जोड़े के साथ मुंह के हुक के साथ पकड़ें। लार्वा के अंदर मुंह के हुक को तब तक वापस लें जब तक कि यह पूरी तरह से उल्टा न हो जाए।
      नोट: विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना आकार सुनिश्चित करने के लिए, प्रति प्रयोग लगभग 30 लार्वा काटना।
    5. ध्यान दें कि विंग डिस्क श्वासनली की दो प्राथमिक शाखाओं के साथ निकटता से जुड़ी हुई हैं, जो लार्वा के प्रत्येक तरफ चलती हैं।
    6. श्वासनली(चित्रा 1बी)से जुड़ी विंग डिस्क की एक जोड़ी के साथ एक साफ उलटा लार्वा शव प्राप्त करने के लिए अन्य सभी लार्वा घटकों (पैर डिस्क और मस्तिष्क) को हटा दें।
    7. नमूनों को 1 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और उन्हें आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 1x पीबीएस में पतला 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में ठीक करें।
      नोट: नमूना आंदोलन एक दोलन उत्तेजक (सामग्री की तालिका) द्वारा प्राप्त किया जाता है।
    8. नमूनों को 70% इथेनॉल (EtOH, RNAse मुक्त पानी में पतला) के साथ 3 x 5 मिनट धोएं और उन्हें कम से कम 2 दिनों और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ही धोने के घोल में स्टोर करें।
  2. अप्रत्यक्ष उड़ान की मांसपेशियां
    1. सीओ2 फ्लाई पैड पर वयस्क मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें और सिर, पेट, पैर और पंखों को हटा दें।
    2. ठंड 1x पीबीएस में विच्छेदित thoraxes प्लेस और सभी नमूने विच्छेदित कर रहे हैं जब तक ऐसा कर जारी है(चित्रा 1D).
    3. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए, (1% ट्राइटन) में थोरैक्स उपसर्ग.
    4. नमूनों को 3x पीबीटी धोने के समाधान (1x पीबीएस में 1% ट्राइटन) के साथ 3 x 5 मिनट कुल्ला।
    5. एक ग्लास स्लाइड पर एक दो तरफा टेप (सामग्री की तालिका) पर थोरैक्स की स्थिति और दो हेमी-थोरेस(चित्रा 1ई,एफ)का उत्पादन करने के लिए एक तेज माइक्रोटोम ब्लेड के साथ उन्हें द्विभाजित करें।
    6. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 4% पीएफए (1% ट्राइटन) में नमूने फिक्स.
    7. आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 1x पीबीटी धोने के समाधान (1% ट्राइटन, 1x पीबीएस) के साथ 2 x 20 मिनट धोएं।
    8. ठंड 1x पीबीएस में हेमी-थोरेस रखें और हेमी-थोरेस (चित्रा 1 जी) से आईएफएम को धीरे से अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
      नोट: इसे प्राप्त करने के लिए, छल्ली को यथासंभव अच्छी तरह से निकालना महत्वपूर्ण है।
    9. नमूनों को पारगम्य बनाने के लिए, पृथक आईएफएम को 70% ईटीओएच समाधान में कम से कम 2 दिनों के लिए और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना आकार सुनिश्चित करने के लिए प्रति प्रयोग लगभग 10 thoraxes से IFMs को अलग करें।

2. संकरण, immunostaining, और बढ़ते

नोट: इसी तरह के संकरण प्रक्रिया दोनों विंग डिस्क और IFMs नमूने के लिए लागू किया जाता है. लार्वा शवों से विंग डिस्क को अलग करना और संकरण शुरू करने से पहले उन्हें बफर ए के 200 माइक्रोन में रखना महत्वपूर्ण है।

  1. 12.5 माइक्रोन के अंतिम स्टॉक समाधान के लिए टीई बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, पीएच 8.0) के 400 माइक्रोन में जांच को फिर से निलंबित करें।
  2. नमूनों को 0.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें बफर ए (सामग्री की तालिका) होती है।
    नोट: कंटेनर की मात्रा कम करके, नमूनों की कल्पना करना और धोने की प्रक्रिया के दौरान उन्हें खोने से बचना आसान हो जाता है।
  3. नमूने 2 x 20 मिनट बफर ए के साथ धो लें।
  4. एस्पिरेट बफर ए, इसे संकरण बफर (सामग्री की तालिका) के 400 माइक्रोन के साथ बदलें, और थर्मल मिक्सर (सामग्री की तालिका) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूनों को प्रीहाइब्रिडाइज करें।
  5. संकरण बफर में विंग डिस्क के लिए 125 एनएम और वयस्क मांसपेशियों के लिए 200 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए जांच को पतला करें और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने विशिष्ट एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) का उपयोग किया जा रहा है के आधार पर भिन्न होता है। एंटीबॉडी जोड़ना वैकल्पिक है। उपयोगकर्ता प्रोटीन धुंधला होने का विकल्प चुन सकते हैं और इसके बजाय एक समान smFISH प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं जिसमें एंटीबॉडी के अलावा शामिल नहीं है।
  6. संकरण बफर महाप्राण और जांच और एंटीबॉडी युक्त संकरण बफर के 100 माइक्रोन के साथ बदलें.
  7. एक थर्मल मिक्सर में 300 आरपीएम आंदोलन के तहत कम से कम 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में नमूने सेते हैं.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर ए का एक विभाज्य गर्म करें।
  9. 300 आरपीएम आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल मिक्सर में 3 x 10 मिनट के लिए नमूने धो लें।
  10. अंतिम धोने के दौरान, बफर ए में माध्यमिक एंटीबॉडी (1/200) और डीएपीआई (1/10,000) को पतला करें और कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  11. बफर बी (सामग्री की तालिका) के साथ 3 x 20 मिनट के लिए नमूने धो लें।
  12. ध्यान से एक खुर्दबीन स्लाइड पर नमूने हस्तांतरण, अवशिष्ट बफर बी मिटा दें, और बढ़ते माध्यम के 30 माइक्रोन जोड़ें, और एक 18 x 18 मिमी coverslip के साथ कवर. तैयारी को सील करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक नमूने स्टोर करें।
    नोट: हालांकि, जांच संकेत गिरावट से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके इमेजिंग करने की सिफारिश की जाती है।

3. इमेजिंग

  1. 40x और 63x तेल विसर्जन उद्देश्यों (सामग्री की तालिका) से लैस एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके xyz अधिग्रहण मोड के साथ चित्र प्राप्त करें। smFISH सिग्नल का पता HyD डिटेक्टर द्वारा फोटॉन काउंटिंग मोड के माध्यम से लगाया जाता है।
  2. DAPI सिग्नल और UV लैंप का उपयोग करके नमूनों का पता लगाएँ।
  3. विंग डिस्क से जुड़े मांसपेशी पूर्वज और IFMs छवि के लिए (चित्रा 2 और चित्रा 3), लेजर लाइनों और उत्सर्जन फिल्टर के लिए निम्नलिखित सेटअप लागू करें: DAPI (उत्तेजना (उदा.) 405 एनएम, उत्सर्जन (em.) का चयन करें 450 एनएम), एलेक्सा फ्लोर 488 ( उदा। 519 एनएम), और एसएमफिश जांच के लिए क्वासर 670 ( उदा। 670 एनएम)।
  4. वयस्क MuSCs छवि के लिए (चित्रा 2D), लेजर लाइनों और उत्सर्जन फिल्टर के लिए निम्न सेटअप लागू करें: DAPI (उदा. 405 एनएम, em. 450 एनएम), एलेक्सा फ्लोर 488 ( उदा। 519 एनएम), एलेक्सा फ्लोर 555 ( उदा। 565 एनएम), और एसएमफिश जांच के लिए क्वासर 670 ( उदा। 670 एनएम)।
    नोट: इमेजिंग के लिए, तरंग दैर्ध्य माध्यमिक एंटीबॉडी और जांच के साथ जुड़े रंगों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है.
  5. कॉन्फोकल छवियों को . TIFF फ़ाइलें।

4. पोस्ट इमेजिंग विश्लेषण

  1. आरंभ करने के लिए, ImageJ लॉन्च करें और प्लगइन्स मेनू पर नेविगेट करें। वहां से, मैक्रोज़ | मैक्रोज़ स्रोत कोड खोलने के लिए संपादित करें।
    नोट:: यह आवश्यकतानुसार पैरामीटर के समायोजन को सक्षम करेगा, और यदि आवश्यक हो, तो मैक्रो के स्रोत कोड के भीतर प्रत्येक चैनल के लिए फ़ोल्डर निर्देशिका को संशोधित करें।
  2. इस प्रोटोकॉल का पालन करने और लार्वा में Mef2 smFISH स्पॉट की मात्रा निर्धारित करने के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: Log_radius = 3.0 और Log_quality = 20.0। कलंक के साथ पृथक्करण Mef2-धनात्मक नाभिक = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8.0; nucleus_size = 300।
  3. मांसपेशियों के तंतुओं में, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: Log_radius = 2.5; Log_quality = 60.0; धुंधला = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0.0; nucleus_size = 300
  4. मैक्रो आरंभ करने के लिए, बस रन कमांड निष्पादित करें और मैक्रो को स्वचालित रूप से निर्दिष्ट फ़ोल्डर से सभी छवियों को लोड करने और उन्हें अनुक्रमिक तरीके से निर्धारित करने की प्रतीक्षा करें।
    नोट: कृपया ध्यान दें कि इस प्रक्रिया की अवधि विश्लेषण किए जा रहे डेटा की मात्रा के आधार पर कुछ सेकंड से लेकर कई घंटों तक भिन्न हो सकती है।
  5. दो नई .csv फ़ाइलों में प्रदर्शित परिणामों की तलाश करें: file_FISH_results और file_nuclei_results। पहला ट्रांसक्रिप्शनल स्पॉट की संख्या और उनकी औसत और अधिकतम तीव्रता को दर्शाता है। दूसरा नाभिक की कुल संख्या और प्रत्येक नाभिक के अंदर धब्बों की संख्या दोनों देता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हमने Mef2 और zfh1 mRNA को लक्षित करने वाले व्यावसायिक रूप से उत्पादित जांच का उपयोग किया। हमने निर्माता के फिश जांच डिजाइनर (सामग्री की तालिका) के साथ जांच तैयार की है। Mef2 सेट सभी Mef2 RNA आइसोफॉर्म (एक्सॉन 3 से एक्सॉन 10 तक) के लिए सामान्य एक्सॉन को लक्षित करता है। zfh1 सेट zfh1-RB और zfh1-RE आइसोफॉर्म10 दोनों के लिए तीसरे एक्सॉन सामान्य को लक्षित करता है। दोनों जांच क्वासर 670 फ्लोरोसेंट डाई के लिए संयुग्मित हैं।

हमने एक मैक्रो इन-हाउस उत्पन्न किया जो कच्चे .tif डेटा का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ संगत था। मैक्रो फिजी प्लगइन BIOP के साथ सेलपोज़26 द्वारा नाभिक के 3D विभाजन और ट्रैकमेट प्लगइन27 में लागू गाऊसी के लैप्लेसियन द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल स्पॉट परिमाणीकरण की अनुमति देता है। MorpholibJ प्लगइन28 postprocessing (पूरक फ़ाइल 1) के लिए प्रयोग किया जाता है.

पहले चरण के रूप में, हमने विंग काल्पनिक डिस्क पर smFISH का प्रदर्शन किया, जहां Mef2 और zfh1 को AMPs में व्यक्त करने के लिए जाना जाता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि दोनों टेप समान रूप से एएमपी आबादी में एमईएफ 2 या जेडएफएच 1 एंटीबॉडी (चित्रा 2ए, बी) के साथ सह-दाग का पता लगाया जाता है। सक्रिय प्रतिलेखन साइटों (टीएस) को एसएमफिश द्वारा परिपक्व एमआरएनए से प्रकट और अलग किया जा सकता है क्योंकि वे बड़े होते हैं और व्यक्तिगत साइटोप्लाज्मिक टेप या परिपक्व परमाणु टेप की तुलना में अधिक तीव्र संकेत होते हैं। लगातार, एएमपी के उच्च आवर्धन टीएस foci और परिपक्व mRNA साइटोप्लाज्म (चित्रा 2A', बी') में बिखरे हुए के बीच भेद, इस smFISH प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता को मान्य करते हैं। हालांकि, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि हमने जेडएफएच1 और एमईएफ2 (चित्रा 2ए',बी') दोनों के लिए प्रति नाभिक एक सक्रिय टीएस देखा। ये डेटा आगे जांच डिजाइन की सटीकता को मान्य करते हैं क्योंकि एएमपी में एमईएफ 2 और जेडएफएच 1 ट्रांसक्रिप्शनल पैटर्न उनके संबंधित प्रोटीन(चित्रा 2)का पता लगाने के साथ सहस्थानीयकरण करते हैं।

दूसरे चरण में, हमने प्रतिलेखन साइट और विभेदित वयस्क आईएफएम और संबंधित स्टेम कोशिकाओं(चित्रा 2सी,डी)में एमईएफ 2 और जेडएफएच1 एमआरएनए के वितरण की जांच की। ये डेटा स्पष्ट रूप से सिंकिटियल मांसपेशी नाभिक में मेफ2 टीएस और साइटोप्लाज्म (चित्रा 2सी, सी') में एमईएफ 2 एमआरएनए वितरण का वर्णन करते हैं। Zfh1 विशेष रूप से MuSCs जनसंख्या10,11 को चिह्नित करता है। इस smFISH प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने GFP अभिव्यक्ति के > Zfh1-Gal4 द्वारा चिह्नित MuSCs में zfh1 प्रतिलेखन का सफलतापूर्वक पता लगाया। उच्च आवर्धन दोनों zfh1 टीएस और साइटोप्लाज्मिक एकल mRNAs(चित्रा 2D') का पता लगाने को दर्शाता है।

अंत में, हमने अपने इन-हाउस-निर्मित इमेजजे मैक्रो का उपयोग मात्रात्मक रूप से Mef2 ट्रांसक्रिप्शनल डायनेमिक्स और स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया। कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन कुशलतापूर्वक एमईएफ 2 स्पॉट और मांसपेशी नाभिक (चित्रा 3 ए-सी) का पता लगा सकती है और खंड कर सकती है। हालांकि, सिग्नल-टू-शोर अनुपात के मुद्दों के कारण, कुछ मामलों में कुछ स्पॉट का पता नहीं लगाया जा सकता है (चित्र 3 ए ', बी')। हमने इस स्वचालित पद्धति का उपयोग यह जांचने के लिए किया कि क्या Mef2 mRNA बहुतायत मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं (AMPs) और विभेदित वयस्क IFMs के बीच भिन्न होती है। हमारे विश्लेषण से पता चलता है कि वयस्क आईएफएम और एएमपी में प्रति नाभिक एमईएफ 2 एमआरएनए की संख्या काफी अलग नहीं है(चित्रा 3डी)।

वयस्क आईएफएम मांसपेशियों में एमईएफ 2 टेप के स्थानिक वितरण में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, हमने साइटोप्लाज्मिक बनाम परमाणु एमईएफ 2 एमआरएनए स्पॉट(चित्रा 3ई, एफ)के अंश की मात्रा निर्धारित की। हमारे कार्यक्रम का उपयोग करते हुए, हमने Mef2 mRNA स्पॉट की कुल संख्या और नाभिक धुंधला (Mef2) के साथ अतिव्यापी Mef2 mRNA स्पॉट की संख्या दोनों की गणना की। कुल एमआरएनए संख्या से नाभिक से जुड़े एमआरएनए को घटाने से साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए स्पॉट की संख्या मिलती है। हमारे निष्कर्षों से पता चलता है कि लगभग 92% Mef2 mRNA साइटोप्लाज्म में मौजूद है, जबकि शेष 8% मांसपेशियों के नाभिक से जुड़ा हुआ है, जैसा कि चित्र 3E, F में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: एसएमफिश के लिए विंग डिस्क और आईएफएम नमूने विच्छेदन और तैयार करने की प्रक्रिया। (ए) एल 3 मंचित लार्वा। (बी) लार्वा के विच्छेदित और उलटा पूर्वकाल अंत। तीर विंग डिस्क को इंगित करते हैं। (सी) पृथक विंग डिस्क। (डी) विच्छेदित वयस्क थोरैक्स। (ई) वयस्क वक्ष द्विभाजन (बिंदीदार रेखा) से पहले एक दो तरफा टेप पर उन्मुख। (एफ) वयस्क हेमिथोरैक्स। (छ) पृथक आईएफएम। (एच) smFISH प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो। संक्षिप्ताक्षर: IFMs = अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियां; smFISH = स्वस्थानी संकरण में एकल-अणु आरएनए प्रतिदीप्ति; EtOH = इथेनॉल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विंग डिस्क और वयस्क आईएफएम में एमईएफ 2 और जेडएफएच 1 एसएमफिश की प्रतिनिधि छवियां (ए, बी) एमईएफ 2 और जेडएफएच 1 एमआरएनए (बैंगनी) एएमपी में समान रूप से पाए जाते हैं और क्रमशः (ए, ए') एमईएफ 2 और (बी, बी') जेडएफएच 1 प्रोटीन (हरा) के साथ सह-स्थानीयकरण करते हैं। (ए, बी'') एएमपी का उच्च आवर्धन। (सी) वयस्क आईएफएम में एमईएफ 2 एमआरएनए और एमईएफ 2 प्रोटीन का पता लगाया जाता है। (सी') सी में बॉक्सिंग क्षेत्र का उच्च आवर्धन। (डी) Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP अभिव्यक्ति (हरा) वयस्क MuSCs लेबल। जेडएफएच1 वयस्क MuSCs में RNA का पता चला है। (डी') डी में बॉक्सिंग क्षेत्र का उच्च आवर्धन। Zfh1 ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट्स और सिंगल mRNAs क्रमशः तीर और एरोहेड द्वारा इंगित किए जाते हैं। DAPI धुंधला हो जाना (नीला)। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए, बी, ए', बी'), 10 माइक्रोन (ए", बी", सी, डी), 5 माइक्रोन (सी', डी')। संक्षिप्ताक्षर: IFMs = अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियां; smFISH = स्वस्थानी संकरण में एकल-अणु आरएनए प्रतिदीप्ति; AMPs = वयस्क मांसपेशी पूर्वज; MuSCs = मांसपेशी स्टेम कोशिकाएं; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एसएमफिश द्वारा एमईएफ 2 प्रतिलेखन और साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए संचय की मात्रा का ठहराव। (ए) वाइल्डटाइप वयस्क आईएफएम में मेफ 2 टेप (बैंगनी) और मेफ 2 प्रोटीन (हरा) का वितरण। (ए') ए में बॉक्सिंग क्षेत्र का उच्च आवर्धन। ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट्स और सिंगल एमआरएनए क्रमशः तीर और एरोहेड द्वारा इंगित किए जाते हैं। (बी, सी) स्वचालित Mef2 स्पॉट खोज और परमाणु विभाजन। साइटोप्लाज्मिक और परमाणु Mef2 mRNAs क्रमशः हरे और मैजेंटा में इंगित किए जाते हैं। (बी', सी') बी और सी में बॉक्सिंग क्षेत्रों के उच्च आवर्धन। तारांकन उन स्थानों को इंगित करते हैं जिन्हें मैक्रो द्वारा नहीं गिना जाता है। (डी) नाभिक की कुल संख्या के सापेक्ष एएमपी और वयस्क आईएफएम में एमईएफ 2 स्पॉट मात्रा का ठहराव का उदाहरण। (पी = 0,0785, छात्र का टी-टेस्ट, विंग डिस्क (एन = 4), आईएफएम (एन = 11))। (ई) वयस्क आईएफएम में एमईएफ 2 स्पॉट वितरण की मात्रा का उदाहरण। (*** पी< 0.0007, छात्र का टी-परीक्षण, एन = 5)। (एफ) नाभिक के अंदर और बाहर पाए गए एमईएफ 2 एमआरएनए स्पॉट का प्रतिशत (एन = 5)। स्केल बार = 10 माइक्रोन (ए, ए')। संक्षिप्ताक्षर: IFMs = अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियां; smFISH = स्वस्थानी संकरण में एकल-अणु आरएनए प्रतिदीप्ति; एएमपी = वयस्क मांसपेशी पूर्वज। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: पोस्टप्रोसेसिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला मैक्रो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

smFISH विधि के अनुप्रयोग ने हाल के दिनों में लोकप्रियता हासिल की है, इसका उपयोग विभिन्न सेल प्रकारों और मॉडल जीवों तक फैला हुआ है। हालांकि, ड्रोसोफिला के मामले में, वयस्क मांसपेशी जीन अभिव्यक्ति के बारे में अधिकांश ज्ञान थोक आणविक परख से लिया गया है, जो एमआरएनए अणुओं के सटीक स्थानिक स्थान पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने में विफल रहता है। इस अंतर को संबोधित करने के लिए, हमने मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं और वयस्क ड्रोसोफिला मांसपेशियों पर smFISH प्रदर्शन करने के लिए एक विधि को अनुकूलित किया है। इस दृष्टिकोण को पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल23 से अनुकूलित किया गया है और ड्रोसोफिला मांसपेशियों के ऊतकों के लिए अनुकूलित किया गया है।

उच्च गुणवत्ता वाली smFISH छवियों को प्राप्त करने में प्रमुख बाधा वयस्क मांसपेशियों की मोटाई है, जो जांच के इष्टतम प्रवेश में बाधा डालती है। इसलिए, वयस्क मांसपेशियों को जानवर के अन्य ऊतकों से अलग करना और हल्के आंदोलन के साथ संकरण प्रक्रिया को पूरा करना महत्वपूर्ण है। यह विशेष कदम ऊतकों के प्रभावी पारगम्यता सुनिश्चित करता है।

एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू यह है कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन को कुछ एमआरएनए स्पॉट का पता लगाने में विफल कर सकता है। हमने पाया कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाकर जांच की इष्टतम एकाग्रता का पता लगाकर प्राप्त किया जा सकता है। इष्टतम कमजोर पड़ने प्रत्येक जांच सेट की संरचना के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, संयुग्मित डाई और oligonucleotide संरचना सहित. हम विभिन्न dilutions की कोशिश करने की सलाह देते हैं; 200 एनएम के एक अंतिम कमजोर पड़ने इन प्रयोगों में वयस्क ऊतकों के लिए सबसे अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात उपज.

smFISH विधि के साथ, TS foci पर नव संश्लेषित RNAs की संख्या निर्धारित करना संभव है। जब एक जीन को सक्रिय रूप से स्थानांतरित किया जाता है, तो टीएस पर समवर्ती रूप से कई नवजात आरएनए उत्पन्न होते हैं। नतीजतन, टीएस की तीव्रता परिपक्व साइटोप्लाज्मिक आरएनए को पार कर जाएगी, और यह विशेषता, इसके परमाणु स्थानीयकरण के साथ मिलकर, टीएस को व्यक्तिगत साइटोप्लाज्मिक आरएनए से अलग कर सकती है। मांसपेशी जीव विज्ञान के संदर्भ में, टीएस का पता लगाने और मात्रा का ठहराव एक ही सिंकिटियम के भीतर मांसपेशियों के नाभिक के बीच एक विशिष्ट जीन के प्रतिलेखन के सिंक्रनाइज़ेशन का निर्धारण करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन को साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए और टीएस संकेतों के बीच अंतर करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है। एक विकल्प के रूप में, हम इस smFISH विधि को अन्य अच्छी तरह से स्थापित smFISH विश्लेषण उपकरण, जैसे BayFISH या FISH-quant29,30 के साथ संयोजित करने का सुझाव देते हैं। इन उपकरणों को उल्लेखनीय परिशुद्धता के साथ आरएनए समुच्चय के स्वचालित विभाजन और प्रतिदीप्ति तीव्रता गणना की सुविधा प्रदान करने के लिए सिद्ध किया गया है।

अंत में, जबकि smFISH उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन वाले mRNA अणुओं का पता लगाता है, यह एक ही समय में mRNA की एक छोटी संख्या का विश्लेषण करने तक सीमित है। merFISH ( स्वस्थानी संकरण में मल्टीप्लेक्स त्रुटि-मजबूत प्रतिदीप्ति) की तरह multiscale तरीकों विभिन्न mRNA31 की एक बड़ी संख्या के एक साथ विश्लेषण सक्षम. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच और त्रुटि-सुधार कोड के संयोजन से, यह विधि एकल कोशिकाओं में सैकड़ों आरएनए प्रजातियों का पता लगाने की सुविधा प्रदान करती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलेन विंसेंट धन्यवाद. हम Zfh1 एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए रूथ लेहमैन को धन्यवाद देते हैं। हम एमआरआईसी इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए स्टेफ़नी डुटर्ट्रे और जेवियर पिंसन की मदद स्वीकार करते हैं। ईएल को पीएचडी फेलोशिप द्वारा मिनिस्टेयर डी ल'एनसिग्नेमेंट सुप्रीयर एट डे ला रीचर्चे साइंटिफिक से समर्थित है। एनए एएफएम-टेलीथॉन पीएचडी फेलोशिप 23846 द्वारा समर्थित है। टीपी को चैन जुकरबर्ग इनिशिएटिव डीएएफ अनुदान द्वारा टीपी (2019-198009) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। HB CNRS, Atip Avenir प्रोग्राम और AFM-Telethon trampoline grant 23108 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope SP8 Leica SP8 DMI 6000
DAPI ThermoFisher 62248
Double-sided tape  Tesa  57910-00000
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Formaldehyde 16% Euromedex EM-15710
Mef2 antibody DHSB NA
PBS 10x Euromedex ET330
RNaseZAP Sigma-Aldrich R2020
Stellaris probes LGC NA
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer LGC SMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A LGC SMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B LGC SMF-WB1-20
Swann-Morton Blades Fisher scientific 0210
ThermoMixer Eppendorf 5382000015
Triton X-100 Euromedex 2000
UAS-mCD8::GFP line Bloomington RRID:BDSC_5137
Ultrapure water Sigma-Aldrich 95284
Watch Glass, Square, 1 5/8 in  Carolina 742300
Zfh1 antibody Gifted by Ruth Leahman
Zfh1-Gal4 Bloomington BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625

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References

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Leroux, E., Ammar, N., Moinet, S., Pecot, T., Boukhatmi, H. Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila. J. Vis. Exp. (199), e65713, doi:10.3791/65713 (2023).

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