Summary
Представлен автоматизированный метод определения эффективного модуля упругости окулярной линзы с помощью компрессионного теста.
Abstract
Биомеханические свойства окулярной линзы имеют важное значение для ее функционирования в качестве оптического элемента переменной мощности. Эти свойства резко меняются с возрастом в хрусталике человека, что приводит к потере зрения вблизи, называемой пресбиопией. Однако механизмы этих изменений остаются неизвестными. Сжатие хрусталика представляет собой относительно простой метод оценки биомеханической жесткости хрусталика в качественном смысле и, в сочетании с соответствующими аналитическими методами, может помочь количественно оценить биомеханические свойства. На сегодняшний день были проведены различные испытания на сжатие хрусталика, в том числе ручные и автоматические, но эти методы непоследовательно применяют ключевые аспекты биомеханических испытаний, такие как предварительное кондиционирование, скорость загрузки и время между измерениями. В этом документе описывается полностью автоматизированное испытание объектива на сжатие, в котором моторизованный столик синхронизируется с камерой для захвата силы, смещения и формы объектива в течение заранее запрограммированного протокола нагружения. Затем на основе этих данных можно рассчитать характеристический модуль упругости. Несмотря на то, что здесь мы демонстрируем на примере свиных линз, этот подход подходит для компрессии хрусталиков любого вида.
Introduction
Хрусталик - это прозрачный и гибкий орган глаза, который позволяет ему фокусироваться на разных расстояниях, изменяя свою преломляющую силу. Эта способность известна как аккомодация. Преломляющая сила изменяется из-за сокращения и расслабления цилиарной мышцы. Когда цилиарная мышца сокращается, хрусталик утолщается и движется вперед, увеличивая свою преломляющую силу 1,2. Увеличение преломляющей силы позволяет объективу фокусироваться на близлежащих объектах. С возрастом хрусталик становится более жестким, и эта способность постепенно утрачивается; Это состояние известно как пресбиопия. Механизм жесткости остается неизвестным, по крайней мере, частично из-за трудностей, связанных с биомеханической характеристикой хрусталика.
Для оценки жесткости хрусталика и биомеханических свойств используются различные методы. К ним относятся вращение линзы 3,4,5, акустические методы 6,7,8, оптические методы, такие как микроскопия Бриллюэна9, вдавливание 10,11 и компрессия12,13. Компрессия является наиболее доступным экспериментальным методом, так как она может быть выполнена с помощью простых приборов (например, стеклянных покровных стекол14,15) или одной моторизованной ступени. Ранее мы показали, как биомеханические свойства хрусталика могут быть строго оценены с помощью испытания на сжатие16. Этот процесс технически сложен и требует специализированного программного обеспечения, недоступного исследователям объективов, заинтересованным в измерении относительной жесткости. Поэтому в настоящем исследовании мы сосредоточимся на доступных методах оценки модуля упругости хрусталика с учетом размера линзы. Модуль упругости — это внутреннее свойство материала, связанное с его деформируемостью: высокий модуль упругости соответствует более жесткому материалу.
Само испытание представляет собой испытание на сжатие параллельной пластины и поэтому может быть выполнено на подходящих коммерческих системах механических испытаний. Здесь был сконструирован специальный прибор, состоящий из двигателя, линейного столика, контроллера движения, тензодатчика и усилителя. Они управлялись с помощью специального программного обеспечения, которое также фиксировало время, положение и нагрузку через равные промежутки времени. Объективы свиньи не вмещают, но легкодоступны и недороги17. Для инкрементального сжатия хрусталика глаза и количественной оценки его модуля упругости был разработан следующий метод. Этот метод легко тиражируется и будет полезен при исследовании жесткости хрусталика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Свиные глаза были получены на местной скотобойне. Никаких согласований этического комитета не требовалось.
1. Вскрытие хрусталика (рис. 1)
- Удалите все окружающие ткани из глаз свиньи и лишнюю плоть из склеры, пока не останется только зрительный нерв. Используйте изогнутые щипцы и небольшие ножницы для рассечения, чтобы завершить этот процесс. Используйте нерв в качестве якоря, чтобы удерживать глаз во время вскрытия.
- С помощью скальпеля сделайте короткий разрез по окружности в лимбе, затем еще один на экваторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется в таком порядке, чтобы не повредить хрусталик и капсулу. - Вставьте микроножницы в разрез в лимбе и удалите роговицу, приподняв роговицу тонкими щипцами с тупым концом, разрезая по окружности роговицы.
- Удалите радужную оболочку, приподняв ее с помощью щипцов с тупым концом, и срежьте микроножницами.
- Вставьте ножницы для рассечения в экваториальный разрез, затем разрежьте по окружности вокруг всего экватора, пока склера не будет разделена пополам.
- Как только разрез будет завершен, удалите заднюю часть склеры. Аккуратно удалите стекловидное тело щипцами, оставляя минимальные остатки, чтобы не повредить хрусталик. При необходимости вырежьте стекловидное тело коронально, чтобы позволить задней части отойти от хрусталика и переднего сегмента.
- Сделайте меридиональный надрез через склеру спереди назад с помощью микроножниц.
- Начиная с нового меридионального разреза через склеру, с помощью микроножниц срезайте зонулы подальше от хрусталика. Используя вес хрусталика или края чашки для препарирования, осторожно растягивайте зонулы, слегка раздвигая хрусталик и склеру, позволяя микроножницам разрезать хрусталик и цилиарное тело, через зонулы и по окружности хрусталика. Это позволит изолировать хрусталик, не повредив капсулу хрусталика, если все сделано правильно.
- При желании извлеките капсулу с помощью щипцов, чтобы проколоть капсулу на экваторе, затем отклейте капсулу с помощью двух щипцов.
- Поместите линзу в фосфатно-солевой буфер (PBS). Перед механическим испытанием визуально осмотрите объектив на наличие повреждений.
2. Компрессия хрусталика с капсулой хрусталика или без него (рис. 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги здесь, за исключением шагов 2.1 и 2.4, управляются компьютером.
- Получить или сконструировать параллельный пластинчатый компрессионный аппарат с тензодатчиком грузоподъемностью 50 грамм с возможностью измерения смещения порядка 1 мкм.
- Запрограммируйте моторизованный столик и загрузите ячейку для выполнения режима нагружения, описанного ниже (например, Дополнительный файл 1).
- Почти заполните квадратную коробку размером 1 5/8 дюйма x 1 5/8 дюйма PBS и поместите ее на компрессионную платформу.
- Опустите верхнюю пластину так, чтобы она соприкасалась с нижней пластиной, чтобы определить нижний предел движения и абсолютную высоту зазора.
- Поднимите верхнюю пластину на ~15 мм.
- Отцентрируйте линзу в коробке, следя за тем, чтобы экваториальная плоскость была горизонтальной.
- Опустите верхнюю пластину близко к верхней поверхности объектива, но не соприкасаясь с ней.
- Инициируйте движение, чтобы переместить верхнюю пластину в контакт с линзой, используя силовую обратную связь с порогом контакта 3 мН.
- Начинайте запись данных после определения контакта, времени записи, положения верхней пластины относительно нижней пластины и усилия при частоте 500 Гц.
- Примените предварительную обусловливающую нагрузку, при которой хрусталик сжимается на 2,5% от своей первоначальной высоты три раза, затем на 5% три раза, затем на 7,5% три раза со скоростью 1%/с.
- Удерживайте положение верхней пластины постоянным в течение 1 минуты после предварительного кондиционирования.
- Примените 15%-ное сжатие со скоростью 1%/с с последующей разгрузкой с той же скоростью.
- Продолжайте разгрузку до тех пор, пока верхняя пластина не пройдет еще 2% от толщины ненагруженной линзы от нижней пластины, чтобы убедиться, что линза отклеена от верхней пластины.
3. Оценка модуля линзы
- Оцените толщину линзы на основе зазора прибора в точке контакта. В качестве альтернативы можно использовать анализ изображений для измерения толщины по фотографии, сделанной перед испытанием.
- Вычислить модуль упругости E с использованием модели Герца для сжатия сферы между параллельными пластинами (уравнение [1]; Дополнительный файл 2).
(1)
где R – радиус кривизны в точке контакта (принимается равным половине толщины линзы); F — сила сжатия, сообщаемая тензодатчиком;
– коэффициент Пуассона (принятый равным 0,5, соответствующий несжимаемому материалу), а u – нисходящее сближение разгонного блока с точкой контакта. Обратите внимание, что модуль упругости и коэффициент Пуассона являются свойствами материала, указывающими соответственно на собственную жесткость линзы и относительную сжимаемость линзы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод пренебрегает какой-либо ролью капсулы хрусталика, но приблизительно учитывает размер хрусталика, что позволяет сравнивать виды.
(1)
– коэффициент Пуассона (принятый равным 0,5, соответствующий несжимаемому материалу), а u – нисходящее сближение разгонного блока с точкой контакта. Обратите внимание, что модуль упругости и коэффициент Пуассона являются свойствами материала, указывающими соответственно на собственную жесткость линзы и относительную сжимаемость линзы.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шесть свиных линз были сжаты, сначала с неповрежденной капсулой, затем после осторожного удаления капсулы. Значения толщины составляли 7,65 ± 0,43 мм для инкапсулированных линз и 6,69 ± 0,29 мм для декапсулированных линз (среднее ± стандартное отклонение). Типичная история загрузки показана на рисунке 3. Полученные кривые сила-перемещение были хорошо подогнаны моделью Герца (т.е. они имели силу, пропорциональную смещению, возведенному в степень 1,5; Рисунок 4). Это было справедливо как для инкапсулированных, так и для декапсулированных линз.
Линзы сначала сжимали на 15% от их ненагруженной толщины с неповрежденной капсулой, затем после удаления капсулы. Ранее было показано, что осевая компрессия на 15% от первоначальной толщины не приводит к повреждению швов хрусталика18. Декапсуляция приводила к достоверному снижению эффективного модуля упругости (n = 6; p = 0,0138; Рисунок 5).
Рисунок 1: Техника вскрытия. (А) Экстраокулярные ткани удаляются. (Б) В лимбе делается разрез по окружности. (C) На экваторе делается разрез по окружности. (D) Роговица удаляется. (E) Радужная оболочка удаляется. (F) Глаз рассекается пополам на экваторе, затем (G) стекловидное тело удаляется, оставляя (H) кольцевидное кольцо, содержащее хрусталик, цилиарное тело и зонулы, все еще прикрепленные к склере. (I) Меридиональный разрез делается через склеру, чтобы (J) дать доступ к зонулам, (K) которые отрезаются, оставляя (L) инкапсулированную линзу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Аппарат для испытания на сжатие. (А) Схема и (Б) фотография аппарата для сжатия объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примененная история загрузки для инкапсулированной свиной линзы. Вверху: История перемещений. Внизу: История форсирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Типичные данные о силе-перемещении, адаптированные к модели Герца. Слева: Данные для инкапсулированной линзы свиньи. Справа: данные о сжатии для одного и того же объектива после декапсуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Бокс-график инкапсулированных и декапсулированных свиных линз эффективных модулей упругости. Эффективный модуль инкапсулированных линз был значительно выше, чем у декапсулированных линз (p = 0,013), что указывает на то, что наличие капсулы может существенно изменить эффективную жесткость хрусталика. Данные приведены для шести объективов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Приложение MATLAB для управления аппаратом для сжатия хрусталика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: Функция MATLAB для оценки модуля упругости по данным о силовом сжатии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Компрессия линзы является универсальным методом оценки жесткости линзы. Процедуры, описанные выше, позволяют сравнивать линзы разных видов и разных размеров. Все деформации нормируются по размеру линзы, а расчет модуля упругости приблизительно учитывает размер линзы. Эффективный модуль значительно выше, чем модуль, о котором сообщалось ранее для хрусталика свиньи 4,7,11,19, по крайней мере, частично из-за использования толщины, а не радиуса кривизны: полярные радиусы кривизны хрусталика свиньи значительно больше, чем половина толщины20.
Представленный здесь простой анализ (т.е. использование модели Герца) имеет несколько ключевых ограничений. Во-первых, он не учитывает наличие капсулы хрусталика. Показано, что наличие капсулы может существенно изменять биомеханические свойства хрусталика16,21. Поэтому этот метод лучше всего применять к декапсулированным линзам. Это особенно важно при сравнении видов в тех случаях, когда капсула может иметь значительно отличающуюся толщину или биомеханические свойства. Этот метод также предполагает, что хрусталик механически однороден; Мы и другие ранее показали, что это, как правило, не относится к свиным или человеческим хрусталикам 4,5,6,10,11,22. Таким образом, лучше всего рассматривать значение модуля упругости, рассчитанное как эффективный модуль, который, по-видимому, связан со средним объемным пространственным модулем в пределах линзы. Модель Герца предполагает, что хрусталик линейно упругий, тогда как известно, что он вязкоупругий; Таким образом, предложенный здесь простой анализ не способен дать информацию о вязкоупругости линзы. Предыдущая работа также показала, что способ и продолжительность хранения линзы перед тестированием могут изменять свойства линзы4; Поэтому все свиные линзы были протестированы сразу после вскрытия по прибытии в лабораторию.
Разница в измерениях силы-перемещения обусловлена шумом от усилителя тензодатчика: снятие капсюля значительно снижает измерения силы, и, следовательно, отношение сигнал/шум ниже. Допущения, использованные при выводе модели Герца, включают в себя то, что сфера является однородным материалом; Таким образом, эффективный модуль упругости каким-то образом усредняет деформируемость хрусталика и его капсулы при наличии капсулы. Это делает межвидовые и межвозрастные сравнения особенно сложными, потому что хрусталик свиньи имеет капсулу толщиной ~60 мкм, в то время как хрусталик мыши или человека имеет капсулу толщиной 5-15 мкм. Модуль упругости капсулы также может варьироваться в зависимости от вида и возраста, хотя эти зависимости неизвестны. Таким образом, несмотря на то, что с капсулой можно получить менее шумную посадку, сравнение по своей сути затруднено присутствием капсулы - это причина, по которой мы рекомендуем проводить тест без капсулы.
Наконец, эффективный модуль был рассчитан в предположении, что радиус кривизны равен половине толщины линзы. Это справедливо только для сферической линзы; Хрусталик свиньи имеет значительно асферическую форму, поэтому значения эффективного модуля значительно выше, чем они были бы, если бы вместо этого использовался радиус кривизны. Это последнее предположение может быть преодолено путем измерения радиусов кривизны, хотя это может быть сложно для нижней поверхности, которая всегда плоская из-за контакта с нижней пластиной. Это также менее важно для более сферических линз, таких как мышиные линзы. Еще лучше использовать обратный анализ методом конечных элементов для определения механических свойств линзы16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
При поддержке гранта Национальных институтов здравоохранения R01 EY035278 (MR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
