Summary
Vi præsenterer en automatiseret metode til karakterisering af det effektive elastiske modul af en okulær linse ved hjælp af en kompressionstest.
Abstract
Den okulære linses biomekaniske egenskaber er afgørende for dens funktion som et optisk element med variabel effekt. Disse egenskaber ændrer sig dramatisk med alderen i den menneskelige linse, hvilket resulterer i et tab af nærsyn kaldet presbyopi. Mekanismerne bag disse ændringer forbliver imidlertid ukendte. Linsekomprimering tilbyder en relativt enkel metode til vurdering af linsens biomekaniske stivhed i kvalitativ forstand og kan, når den kombineres med passende analytiske teknikker, hjælpe med at kvantificere biomekaniske egenskaber. En række objektivkomprimeringstest er blevet udført til dato, herunder både manuelle og automatiserede, men disse metoder anvender inkonsekvent nøgleaspekter af biomekanisk test såsom forkonditionering, belastningshastigheder og tid mellem målinger. Dette papir beskriver en fuldautomatisk linsekomprimeringstest, hvor et motoriseret trin synkroniseres med et kamera for at fange objektivets kraft, forskydning og form gennem en forprogrammeret belastningsprotokol. Et karakteristisk elastisk modul kan derefter beregnes ud fra disse data. Mens demonstreret her ved hjælp af svinelinser, er fremgangsmåden passende til komprimering af linser af enhver art.
Introduction
Linsen er det gennemsigtige og fleksible organ, der findes i øjet, der gør det muligt at fokusere på forskellige afstande ved at ændre dets brydningskraft. Denne evne er kendt som indkvartering. Brydningskraften ændres på grund af sammentrækning og afslapning af ciliarymusklen. Når ciliarmusklen trækker sig sammen, bliver linsen tykkere og bevæger sig fremad, hvilket øger dens brydningskraft 1,2. Stigningen i brydningskraft gør det muligt for linsen at fokusere på nærliggende genstande. Når mennesker bliver ældre, bliver linsen stivere, og denne evne til at rumme går gradvist tabt; Denne tilstand er kendt som presbyopi. Afstivningsmekanismen forbliver ukendt, i det mindste delvis på grund af vanskelighederne forbundet med den biomekaniske karakterisering af linsen.
En række forskellige metoder er blevet anvendt til at estimere linsestivhed og biomekaniske egenskaber. Disse omfatter linsespinding 3,4,5, akustiske metoder 6,7,8, optiske metoder såsom Brillouin-mikroskopi9, indrykning 10,11 og kompression12,13. Kompression er den mest tilgængelige eksperimentelle teknik, da den kan udføres med simpel instrumentering (f.eks. Glasdæksler14,15) eller et enkelt motoriseret trin. Vi har tidligere vist, hvordan linsens biomekaniske egenskaber kan vurderes nøje ud fra en kompressionstest16. Denne proces er teknisk udfordrende og kræver specialiseret software, der ikke er let tilgængelig for linseforskere, der er interesseret i målinger af relativ stivhed. Derfor fokuserer vi i denne undersøgelse på tilgængelige metoder til estimering af objektivets elastiske modul, mens vi tager højde for linsestørrelse. Det elastiske modul er en iboende materialeegenskab relateret til dets deformerbarhed: et højt elastisk modul svarer til et stivere materiale.
Selve testen er en parallel pladekompressionstest og kan derfor udføres på egnede kommercielle mekaniske testsystemer. Her blev et brugerdefineret instrument konstrueret bestående af en motor, lineært trin, bevægelsescontroller, vejecelle og forstærker. Disse blev styret ved hjælp af brugerdefineret software, som også registrerede tid, position og belastning med jævne mellemrum. Piglinser rummer ikke, men er let tilgængelige og billige17. Følgende metode blev udviklet til trinvis komprimering af øjenlinsen og kvantificering af dens elastiske modul. Denne metode kan let replikeres og vil være nyttig i undersøgelsen af linsestivhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Svineøjne blev hentet fra et lokalt slagteri. Der krævedes ingen godkendelser fra etiske komitéer.
1. Linsedissektion (figur 1)
- Fjern alt omgivende væv fra grisens øjne og overskydende kød fra scleraen, indtil kun synsnerven forbliver. Brug buede tang og lille dissektionssaks til at fuldføre denne proces. Brug nerven som et anker til at holde øjet under dissektion.
- Brug en skalpel til at lave et kort omkredssnit ved limbussen og derefter en anden ved ækvator.
BEMÆRK: Dette trin udføres i denne rækkefølge for at undgå at beskadige objektivet og kapslen. - Indsæt en mikrosaks i snittet ved limbussen, og fjern hornhinden ved at løfte hornhinden med fin stump tang, mens du skærer rundt om hornhindens omkreds.
- Fjern iris ved at løfte med stump spids tang og skær væk med mikrosaks.
- Indsæt dissektionssaks i ækvatorialsnittet, og skær derefter omkredsen rundt om hele ækvator, indtil sclera er gennemskåret.
- Når snittet er afsluttet, skal du fjerne den bageste del af scleraen. Fjern glaslegemet forsigtigt med pincet, og efterlad minimale rester for at undgå at beskadige linsen. Skær om nødvendigt glaslegemet humor koronalt for at lade den bageste trække sig væk fra linsen og det forreste segment.
- Lav et meridional snit gennem sclera fra forreste til bageste ved hjælp af mikrosaks.
- Begynd ved den nye meridional klipning gennem sclera, brug mikrosaks til at skære zonulerne væk fra linsen. Brug vægten af linsen eller kanten af dissektionsskålen til forsigtigt at strække zonulerne, når du trækker linsen og sclera lidt fra hinanden, så mikrosaksen kan skære mellem linsen og ciliarylegemet, gennem zonulerne og omkring linsens omkreds. Dette isolerer linsen uden at beskadige objektivkapslen, hvis det gøres korrekt.
- Hvis det ønskes, fjern kapslen ved hjælp af tang for at punktere kapslen ved ækvator, og skræl derefter kapslen væk med to pincet.
- Placer linsen i fosfatbufret saltvand (PBS). Undersøg visuelt linsen for eventuelle skader inden mekanisk test.
2. Linsekompression med/uden linsekapsel (figur 2)
BEMÆRK: Alle trin her med undtagelse af trin 2.1 og 2.4 er computerstyrede.
- Der anskaffes eller fremstilles et parallelt pladekompressionsapparat med en vejecelle med en kapacitet på 50 g med mulighed for at måle forskydning i størrelsesordenen 1 μm.
- Programmér det motoriserede trin, og indlæs cellen for at udføre det belastningsregime, der er beskrevet nedenfor (f.eks. Supplerende fil 1).
- Næsten fyld en firkantet kasse på 1 5/8 tommer x 1 5/8 tommer med PBS og placer den på kompressionsplatformen.
- Sænk den øverste plade i kontakt med den nederste plade for at bestemme den nedre bevægelsesgrænse og absolutte mellemrumshøjde.
- Hæv den øverste plade med ~15 mm.
- Centrer linsen i kassen, og pas på, at ækvatorialplanet er vandret.
- Sænk den øverste plade tæt på, men ikke i kontakt med, objektivets overside.
- Start bevægelse for at flytte den øverste plade i kontakt med linsen ved hjælp af kraftfeedback med en kontakttærskel på 3 mN.
- Dataregistreringen påbegyndes ved bestemmelse af kontakt, registreringstid, placering af den øverste plade i forhold til den nederste plade og kraft ved 500 Hz.
- Anvend en forkonditioneringsbelastning, hvor objektivet komprimeres med 2,5% af dets oprindelige højde tre gange, derefter 5% tre gange, derefter 7,5% tre gange med en hastighed på 1% / s.
- Hold den øverste plades position konstant i 1 min efter forkonditionering.
- Anvend en 15% komprimering med en hastighed på 1% / s, efterfulgt af aflæsning med samme hastighed.
- Fortsæt aflæsningsbevægelsen, indtil den øverste plade har bevæget yderligere 2% af den ubelastede linsetykkelse væk fra bundpladen for at sikre, at linsen er fjernet fra den øverste plade.
3. Estimering af objektivmodul
- Anslå objektivets tykkelse baseret på instrumentets mellemrum ved kontaktpunktet. Alternativt kan du bruge billedanalyse til at måle tykkelsen fra et fotografi taget før test.
- Beregn det elastiske modul E ved hjælp af Hertz-modellen til komprimering af en kugle mellem parallelle plader (ligning [1]; Supplerende fil 2).
(1)
hvor R er krumningsradius ved kontaktpunktet (antages at svare til halvdelen af objektivtykkelsen) F er den kompressionskraft, der rapporteres af vejecellen;
er Poissons forhold (antages lig med 0,5 svarende til et ukomprimerbart materiale); og u er den nedadgående tilgang af det øverste trin fra kontaktpunktet. Bemærk, at det elastiske modul og Poissons forhold er materialeegenskaber, der angiver henholdsvis objektivets indre stivhed og objektivets relative kompressibilitet.
BEMÆRK: Denne metode ignorerer enhver rolle i linsekapslen, men tager omtrent højde for linsens størrelse, hvilket muliggør sammenligning mellem arter.
(1)
er Poissons forhold (antages lig med 0,5 svarende til et ukomprimerbart materiale); og u er den nedadgående tilgang af det øverste trin fra kontaktpunktet. Bemærk, at det elastiske modul og Poissons forhold er materialeegenskaber, der angiver henholdsvis objektivets indre stivhed og objektivets relative kompressibilitet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks svinelinser blev komprimeret, først med kapslen intakt, derefter efter omhyggelig fjernelse af kapslen. Tykkelsesværdierne var 7,65 ± 0,43 mm for indkapslede linser og 6,69 ± 0,29 mm for indkapslede linser (gennemsnit ± standardafvigelse). En typisk indlæsningshistorik er vist i figur 3. De resulterende kraftforskydningskurver var godt monteret af Hertz-modellen (dvs. de havde en kraft, der var proportional med forskydningen hævet til effekten på 1,5; Figur 4). Dette gjaldt både de indkapslede og afkapslede linser.
Linser blev først komprimeret med 15% af deres ubelastede tykkelse med en intakt kapsel, derefter efter fjernelse af kapslen. Aksial kompression med 15% af den oprindelige tykkelse har tidligere vist sig ikke at forårsage skade på linsesuturerne18. Afkapsling resulterede i et signifikant fald i effektivt elastisk modul (n = 6; p = 0,0138; Figur 5).
Figur 1: Dissektionsteknik. (A) Det ekstraokulære væv fjernes. (B) Der foretages et omkredssnit ved limbussen. (C) Der foretages et omkredssnit ved ækvator. D) Hornhinden fjernes. (E) Iris fjernes. (F) Øjet gennemskæres ved ækvator, derefter (G) glaslegemet fjernes, hvilket efterlader (H) en ringformet ring, der indeholder linsen, ciliarlegemet og zonulerne, der stadig er fastgjort til sclera. (I) Der foretages et meridionalsnit gennem sclera for at (J) give adgang til zonulerne, (K) som skæres væk og efterlader (L) den indkapslede linse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kompressionsprøvningsapparatur. (A) Skematisk og (B) fotografi af objektivets kompressionsapparat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Anvendt belastningshistorik for en indkapslet svinelinse. Øverst: Forskydningshistorik. Nederst: Krafthistorie. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Typiske kraftforskydningsdata monteret med Hertz-modellen. Til venstre: Data for en indkapslet svinelinse. Til højre: Komprimeringsdata for det samme objektiv efter afkapsling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Boks og whisker plot af indkapslet og afkapslet svinelinse effektiv elastisk moduli. Det effektive modul for de indkapslede linser var signifikant højere end for de afkapslede linser (p = 0,013), hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af kapslen kan ændre linsens effektive stivhed væsentligt. Data er for seks linser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: MATLAB-applikation til styring af objektivkomprimeringsapparatet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: MATLAB-funktion til at estimere det elastiske modul ud fra kraftkomprimeringsdata. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Linsekomprimering er en alsidig metode til estimering af objektivstivhed. De ovenfor beskrevne procedurer tillader sammenligning mellem linser af forskellige arter og forskellige størrelser. Alle deformationer normaliseres mod linsestørrelse, og beregningen af det elastiske modul tegner sig omtrent for linsestørrelsen. Det effektive modul er betydeligt højere end det modul, der tidligere er rapporteret for svinelinsen 4,7,11,19, i det mindste delvis på grund af brugen af tykkelse snarere end krumningsradius: svinelinsens polære krumningsradier er betydeligt større end halvdelen af tykkelsen20.
Den enkle analyse (dvs. brug af Hertz-modellen), der præsenteres her, har flere vigtige begrænsninger. For det første tager det ikke højde for tilstedeværelsen af linsekapslen. Det har vist sig, at tilstedeværelsen af kapslen kan ændre linsens biomekaniske egenskaber betydeligt16,21. Derfor anvendes denne metode bedst på afkapslede linser. Dette er især vigtigt, når man sammenligner arter i tilfælde, hvor kapslen kan have signifikant forskellige tykkelser eller biomekaniske egenskaber. Denne metode forudsætter også, at linsen er mekanisk homogen; Vi og andre har tidligere vist, at dette generelt ikke er tilfældet for svine- eller menneskelinser 4,5,6,10,11,22. Det er således bedst at betragte den elastiske modulværdi beregnet som et effektivt modul, som formodentlig er relateret til det volumetriske gennemsnit af det rumligt varierende modul inden for linsen. Hertz-modellen antager, at linsen er lineært elastisk, mens den vides at være viskoelastisk; Den enkle analyse, der foreslås her, er således ikke i stand til at give oplysninger om linseviskoelasticitet. Tidligere arbejde har også vist, at metoden og varigheden af linselagring før test kan ændre linseegenskaber4; Alle svinelinser blev derfor testet umiddelbart efter dissektion ved ankomsten til laboratoriet.
Forskellen i kraftforskydningsmålingerne skyldes støj fra vejecelleforstærkeren: fjernelse af kapslen gør kraftmålingerne betydeligt lavere, og derfor er signal-støjforholdet lavere. De antagelser, der anvendes til at udlede Hertz-modellen, inkluderer vigtigere, at kuglen er et homogent materiale; Derfor er det effektive elastiske modul på en eller anden måde gennemsnittet af deformerbarheden af linsen og dens kapsel, når kapslen er til stede. Dette gør sammenligninger mellem arter og aldre særligt vanskelige, fordi en svinelinse har en kapsel ~ 60 μm tyk, mens en mus eller menneskelig linse har en kapsel i det 5-15 μm tykke område. Kapslens elastiske modul kan også variere med art og alder, selvom disse afhængigheder er ukendte. Selvom det er muligt at få en mindre støjende pasform med kapslen, er sammenligningen i sagens natur forvirret af tilstedeværelsen af kapslen - dette er grunden til, at vi anbefaler at udføre testen uden kapslen.
Endelig blev det effektive modul beregnet under forudsætning af, at krumningsradius var halvdelen af objektivets tykkelse. Dette gælder kun for en sfærisk linse; Porcinlinsen er signifikant asfærisk, og derfor er de effektive modulværdier betydeligt højere, end de ville være, hvis krumningsradius blev brugt i stedet. Denne sidste antagelse kan overvindes ved at måle krumningsradierne, selvom dette kan være kompliceret for den nedre overflade, som altid er flad på grund af kontakt med den nederste plade. Det er også mindre vigtigt for mere sfæriske linser såsom murinlinser. Endnu bedre er brugen af invers finite element analyse til at fastslå linsens mekaniske egenskaber16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Støttet af National Institutes of Health grant R01 EY035278 (MR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
