Summary
Vi presenterar en automatiserad metod för att karakterisera den effektiva elasticitetsmodulen hos en okulär lins med hjälp av ett kompressionstest.
Abstract
De biomekaniska egenskaperna hos okulärlinsen är avgörande för dess funktion som ett optiskt element med variabel effekt. Dessa egenskaper förändras dramatiskt med åldern i den mänskliga linsen, vilket resulterar i en förlust av närseende som kallas presbyopi. Mekanismerna bakom dessa förändringar är dock fortfarande okända. Linskompression erbjuder en relativt enkel metod för att bedöma linsens biomekaniska styvhet i kvalitativ mening och kan, i kombination med lämpliga analystekniker, hjälpa till att kvantifiera biomekaniska egenskaper. En mängd olika linskompressionstester har utförts hittills, inklusive både manuella och automatiserade, men dessa metoder tillämpar inkonsekvent viktiga aspekter av biomekanisk testning såsom förkonditionering, laddningshastigheter och tid mellan mätningar. Detta dokument beskriver ett helautomatiskt linskompressionstest där ett motoriserat steg synkroniseras med en kamera för att fånga linsens kraft, förskjutning och form genom ett förprogrammerat laddningsprotokoll. En karakteristisk elasticitetsmodul kan sedan beräknas från dessa data. Även om metoden här demonstreras med hjälp av svinlinser, är den lämplig för komprimering av linser av alla arter.
Introduction
Linsen är det genomskinliga och flexibla organ som finns i ögat och som gör att det kan fokusera på olika avstånd genom att ändra dess brytningskraft. Denna förmåga kallas ackommodation. Brytningskraften förändras på grund av sammandragning och avslappning av ciliarmuskeln. När ciliarmuskeln drar ihop sig förtjockas linsen och rör sig framåt, vilket ökar dess brytningskraft 1,2. Ökningen av brytningseffekten gör att linsen kan fokusera på närliggande föremål. När människor åldras blir linsen styvare och denna förmåga att anpassa sig går gradvis förlorad; Detta tillstånd är känt som presbyopi. Mekanismen för förstyvning är fortfarande okänd, åtminstone delvis på grund av svårigheterna i samband med den biomekaniska karakteriseringen av linsen.
En mängd olika metoder har använts för att uppskatta linsstyvhet och biomekaniska egenskaper. Dessa inkluderar linsspinning 3,4,5, akustiska metoder 6,7,8, optiska metoder som Brillouinmikroskopi9, intryckning10,11 och kompression12,13. Kompression är den mest tillgängliga experimentella tekniken eftersom den kan utföras med enkel instrumentering (t.ex. glastäcken14,15) eller ett enda motoriserat steg. Vi har tidigare visat hur linsens biomekaniska egenskaper kan uppskattas noggrant från ett kompressionstest16. Denna process är tekniskt utmanande och kräver specialiserad programvara som inte är lättillgänglig för linsforskare som är intresserade av mätningar av relativ styvhet. Därför fokuserar vi i denna studie på tillgängliga metoder för att uppskatta linsens elasticitetsmodul samtidigt som vi tar hänsyn till linsstorleken. Elasticitetsmodulen är en inneboende materialegenskap relaterad till dess deformerbarhet: en hög elasticitetsmodul motsvarar ett styvare material.
Själva testet är ett parallellt plattkompressionstest och kan därför utföras på lämpliga kommersiella mekaniska testsystem. Här konstruerades ett skräddarsytt instrument bestående av en motor, linjärt steg, rörelsekontroller, lastcell och förstärkare. Dessa styrdes med hjälp av anpassad programvara som också registrerade tid, position och belastning med jämna mellanrum. Grislinser passar inte men är lättillgängliga och billiga17. Följande metod utvecklades för att stegvis komprimera ögonlinsen och kvantifiera dess elasticitetsmodul. Denna metod kan enkelt replikeras och kommer att vara användbar vid studier av linsstyvhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Grisögon hämtades från ett lokalt slakteri. Inga godkännanden från etiska kommittéer krävdes.
1. Dissektion av linsen (figur 1)
- Ta bort all omgivande vävnad från grisögonen och överflödigt kött från sklera, tills endast synnerven återstår. Använd böjd pincett och en liten dissektionssax för att slutföra denna process. Använd nerven som ett ankare för att hålla ögat under dissektionen.
- Använd en skalpell och gör ett kort perifert snitt vid limbus och sedan ett annat vid ekvatorn.
OBS: Detta steg utförs i denna ordning för att undvika att skada linsen och kapseln. - Sätt in en mikrosax i snittet vid limbus och ta bort hornhinnan genom att lyfta hornhinnan med en fin trubbig pincett samtidigt som du klipper runt hornhinnans omkrets.
- Ta bort iris genom att lyfta med en trubbig pincett och klipp bort med en mikrosax.
- Sätt in dissektionssaxen i ekvatorialsnittet och klipp sedan runt hela ekvatorn tills skleran är delad.
- När snittet är klart, ta bort den bakre delen av sklera. Ta bort glaskroppen försiktigt med en pincett och lämna minimala rester för att undvika att skada linsen. Om det behövs, skär glaskroppen koronalt så att den bakre kan dra sig bort från linsen och det främre segmentet.
- Gör ett meridionalt snitt genom sclera från främre till bakre med hjälp av en mikrosax.
- Börja vid den nya meridionala skärningen genom sclera, använd mikrosax för att klippa zonulerna bort från linsen. Använd linsens vikt eller kanten på dissektionskålen, sträck försiktigt zonulerna när du drar isär linsen och sclera något, så att mikrosaxen kan klippa mellan linsen och ciliarkroppen, genom zonulerna och runt linsens omkrets. Detta kommer att isolera linsen utan att skada linskapseln om det görs på rätt sätt.
- Om så önskas, ta bort kapseln med en pincett för att punktera kapseln vid ekvatorn och dra sedan bort kapseln med två pincetter.
- Placera linsen i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Inspektera linsen visuellt för eventuella skador före mekanisk testning.
2. Linskompression med/utan linskapsel (figur 2)
OBS: Alla steg här med undantag för steg 2.1 och 2.4 är datorstyrda.
- Skaffa eller konstruera en parallell plattkompressionsapparat med en lastcell med en kapacitet på 50 gram och med förmåga att mäta förskjutning i storleksordningen 1 μm.
- Programmera den motoriserade stage och ladda cellen för att utföra den belastningsregim som beskrivs nedan (t.ex. kompletterande File 1).
- Fyll nästan en fyrkantig låda på 1 5/8 tum x 1 5/8 tum med PBS och placera den på kompressionsplattformen.
- Sänk den övre plattan i kontakt med den nedre plattan för att bestämma den nedre rörelsegränsen och den absoluta spalthöjden.
- Höj den övre plattan med ~15 mm.
- Centrera linsen i lådan och se till att ekvatorialplanet är horisontellt.
- Sänk den övre plattan nära, men inte i kontakt med, linsens övre yta.
- Initiera rörelse för att flytta den övre plattan i kontakt med linsen, med hjälp av kraftåterkoppling med en kontakttröskel på 3 mN.
- Påbörja dataregistrering vid bestämning av kontakt, registreringstid, den övre plattans position i förhållande till den nedre plattan och kraft vid 500 Hz.
- Applicera en förkonditioneringsbelastning där linsen komprimeras med 2,5 % av sin ursprungliga höjd tre gånger, sedan 5 % tre gånger, sedan 7,5 % tre gånger med en hastighet av 1 %/s.
- Håll den övre plattans position konstant i 1 minut efter förkonditioneringen.
- Applicera en komprimering på 15 % med en hastighet på 1 %/s, följt av avlastning med samma hastighet.
- Fortsätt avlastningsrörelsen tills den övre plattan har färdats ytterligare 2 % av den obelastade linsens tjocklek bort från bottenplattan för att säkerställa att linsen inte fästs vid den övre plattan.
3. Uppskattning av linsmodul
- Uppskatta linsens tjocklek baserat på instrumentets mellanrum vid kontaktpunkten. Alternativt kan du använda bildanalys för att mäta tjockleken från ett fotografi som tagits före testningen.
- Beräkna elasticitetsmodulen E med hjälp av Hertzmodellen för kompression av en sfär mellan parallella plattor (ekvation [1]; Kompletterande fil 2).
Nej (1)
där R är krökningsradien vid kontaktpunkten (antas vara lika med halva linsens tjocklek), F är den kompressionskraft som rapporteras av lastcellen,
är Poissons förhållande (antas vara lika med 0,5 som motsvarar ett inkompressibelt material); och u är det övre stegets nedåtgående närmande från kontaktpunkten. Observera att elasticitetsmodulen och Poissons förhållande är materialegenskaper som indikerar linsens inneboende styvhet respektive linsens relativa kompressibilitet.
OBS: Denna metod försummar linskapselns roll men tar ungefär hänsyn till linsens storlek, vilket möjliggör jämförelse mellan arter.
Nej (1)
är Poissons förhållande (antas vara lika med 0,5 som motsvarar ett inkompressibelt material); och u är det övre stegets nedåtgående närmande från kontaktpunkten. Observera att elasticitetsmodulen och Poissons förhållande är materialegenskaper som indikerar linsens inneboende styvhet respektive linsens relativa kompressibilitet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sex svinlinser komprimerades, först med kapseln intakt, sedan efter att kapseln försiktigt tagits bort. Tjockleksvärdena var 7,65 ± 0,43 mm för inkapslade linser och 6,69 ± 0,29 mm för inkapslade linser (medelvärde ± standardavvikelse). En typisk laddningshistorik visas i figur 3. De resulterande kraft-förskjutningskurorna var väl anpassade av Hertz-modellen (dvs. de hade en kraft som var proportionell mot förskjutningen upphöjd till 1,5; Figur 4). Detta gällde både de inkapslade och inkapslade linserna.
Linserna komprimerades först med 15 % av sin obelastade tjocklek med en intakt kapsel, sedan efter att kapseln tagits bort. Axiell kompression med 15 % av den ursprungliga tjockleken har tidigare visat sig inte orsaka skador på linssuturerna18. Avkapsling resulterade i en signifikant minskning av den effektiva elasticitetsmodulen (n = 6; p = 0,0138; Figur 5).
Figur 1: Dissektionsteknik. (A) De extraokulära vävnaderna avlägsnas. (B) Ett perifert snitt görs vid limbus. (C) Ett snitt runt ekvatorn görs. (D) Hornhinnan avlägsnas. (E) Regnbågshinnan avlägsnas. (F) Ögat delas i två delar vid ekvatorn, sedan (G) glaskroppen avlägsnas, vilket lämnar (H) en ringformig ring som innehåller linsen, ciliarkroppen och zonuler som fortfarande är fästa vid sklera. (I) En meridional skärning görs genom sclera för att (J) ge tillgång till zonulerna, (K) som skärs bort och lämnar (L) den inkapslade linsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utrustning för kompressionsprovning. A) Schematisk bild och B) fotografi av linskompressionsapparaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Tillämpad laddningshistorik för en inkapslad svinlins. Överst: Förskjutningshistorik. Nederst: Krafthistorik. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Typiska kraftförskjutningsdata anpassade till Hertz-modellen. Till vänster: Data för en inkapslad svinlins. Höger: Komprimeringsdata för samma objektiv efter avkapsling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Låd- och morrhårsdiagram över inkapslade och avkapslade svinlinsers effektiva elastiska moduler. Den effektiva modulen för de inkapslade linserna var signifikant högre än för de inkapslade linserna (p = 0,013), vilket indikerar att närvaron av kapseln väsentligt kan förändra linsens effektiva styvhet. Data är för sex linser. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande File 1: MATLAB-applikation för att styra linskompressionsapparaten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: MATLAB-funktion för att uppskatta elasticitetsmodulen från kraftkomprimeringsdata. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Linskomprimering är en mångsidig metod för att uppskatta linsstyvhet. De procedurer som beskrivs ovan gör det möjligt att jämföra glas av olika arter och olika storlekar. Alla deformationer normaliseras mot linsstorleken, och beräkningen av elasticitetsmodulen tar ungefär hänsyn till linsstorleken. Den effektiva modulen är betydligt högre än den modul som tidigare rapporterats för svinlinsen 4,7,11,19, åtminstone delvis på grund av användningen av tjocklek snarare än krökningsradie: svinlinsens polära krökningsradier är betydligt större än halva tjockleken 20.
Den enkla analysen (dvs. användningen av Hertz-modellen) som presenteras här har flera viktiga begränsningar. För det första tar den inte hänsyn till närvaron av linskapseln. Det har visat sig att närvaron av kapseln avsevärt kan förändra linsens biomekaniska egenskaper16,21. Därför är det bäst att använda denna metod för inkapslade linser. Detta är särskilt viktigt när man jämför arter i fall där kapseln kan ha väsentligt olika tjocklekar eller biomekaniska egenskaper. Denna metod förutsätter också att linsen är mekaniskt homogen; Vi och andra har tidigare visat att detta generellt inte är fallet för svin- eller människolinser 4,5,6,10,11,22. Därför är det bäst att betrakta elasticitetsmodulvärdet beräknat som en effektiv modul, vilket förmodligen är relaterat till det volymetriska genomsnittet av den rumsligt varierande modulen i linsen. Hertz-modellen antar att linsen är linjärt elastisk, medan den är känd för att vara viskoelastisk; Den enkla analys som föreslås här kan därför inte ge information om glasets viskoelasticitet. Tidigare forskning har också visat att metoden och varaktigheten för linsförvaring före testning kan förändra linsens egenskaper4; Alla svinlinser testades därför omedelbart efter dissektion vid ankomst till labbet.
Skillnaden i kraftförskjutningsmätningarna beror på brus från lastcellsförstärkaren: avlägsnande av kapseln gör kraftmätningarna betydligt lägre, och därför är signal-brusförhållandet lägre. De antaganden som används för att härleda Hertz-modellen inkluderar att sfären är ett homogent material; Därför är den effektiva elasticitetsmodulen på något sätt medelvärdesbelastad deformerbarheten hos linsen och dess kapsel när kapseln är närvarande. Detta gör jämförelser mellan arter och mellan åldrar särskilt svåra eftersom en svinlins har en kapsel ~60 μm tjock, medan en mus eller människas lins har en kapsel i intervallet 5-15 μm tjock. Kapselns elasticitetsmodul kan också variera med art och ålder, även om dessa beroenden är okända. Således, även om det är möjligt att få en mindre bullrig passform med kapseln, är jämförelsen i sig förvirrad av närvaron av kapseln - detta är anledningen till att vi rekommenderar att du utför testet utan kapseln.
Slutligen beräknades den effektiva modulen med antagandet att krökningsradien var hälften av linsens tjocklek. Detta gäller endast för en sfärisk lins; Svinlinsen är påtagligt asfärisk och därför är de effektiva modulvärdena betydligt högre än de skulle vara om krökningsradien användes istället. Detta sista antagande kan övervinnas genom att mäta krökningsradierna, även om detta kan vara komplicerat för den nedre ytan som alltid är plan på grund av kontakt med den nedre plattan. Det är också mindre viktigt för mer sfäriska linser som murina linser. Ännu bättre är användningen av invers finita elementanalys för att fastställa linsens mekaniska egenskaper16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Med stöd av National Institutes of Health anslag R01 EY035278 (MR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
