Summary
Vi presenterer en automatisert metode for å karakterisere den effektive elastiske modulen til en okulær linse ved hjelp av en kompresjonstest.
Abstract
De biomekaniske egenskapene til den okulære linsen er avgjørende for dens funksjon som et optisk element med variabel effekt. Disse egenskapene endres dramatisk med alderen i den menneskelige linsen, noe som resulterer i tap av nærsynthet kalt presbyopi. Mekanismene bak disse endringene forblir imidlertid ukjente. Linsekompresjon tilbyr en relativt enkel metode for å vurdere linsens biomekaniske stivhet i kvalitativ forstand, og når den kombineres med passende analytiske teknikker, kan den bidra til å kvantifisere biomekaniske egenskaper. En rekke linsekompresjonstester har blitt utført til dags dato, inkludert både manuelle og automatiserte, men disse metodene bruker inkonsekvent viktige aspekter ved biomekanisk testing som forkondisjonering, belastningshastigheter og tid mellom målinger. Dette papiret beskriver en helautomatisk linsekompresjonstest hvor et motorisert stadium synkroniseres med et kamera for å fange kraften, forskyvningen og formen til linsen gjennom en forhåndsprogrammert lasteprotokoll. En karakteristisk elastisk modul kan da beregnes ut fra disse dataene. Selv om det her demonstreres ved bruk av svinelinser, er tilnærmingen hensiktsmessig for komprimering av linser av alle arter.
Introduction
Linsen er det gjennomsiktige og fleksible organet som finnes i øyet som gjør det mulig å fokusere på forskjellige avstander ved å endre brytningskraften. Denne evnen er kjent som overnatting. Brytningskraften endres på grunn av sammentrekning og avslapning av ciliærmuskelen. Når ciliærmuskelen trekker seg sammen, tykner linsen og beveger seg fremover, og øker brytningskraften 1,2. Økningen i brytningskraft gjør at linsen kan fokusere på nærliggende gjenstander. Etter hvert som mennesker blir eldre, blir linsen stivere og denne evnen til å imøtekomme går gradvis tapt; Denne tilstanden er kjent som presbyopi. Mekanismen for stivning forblir ukjent, i det minste delvis på grunn av vanskelighetene forbundet med den biomekaniske karakteriseringen av linsen.
En rekke metoder har blitt brukt til å estimere linsestivhet og biomekaniske egenskaper. Disse inkluderer linsespinning 3,4,5, akustiske metoder 6,7,8, optiske metoder som Brillouin-mikroskopi9, innrykk 10,11 og kompresjon12,13. Kompresjon er den mest tilgjengelige eksperimentelle teknikken, da den kan utføres med enkel instrumentering (f.eks. glassdeksel14,15) eller et enkelt motorisert trinn. Vi har tidligere vist hvordan de biomekaniske egenskapene til linsen kan estimeres grundig fra en kompresjonstest16. Denne prosessen er teknisk utfordrende og krever spesialisert programvare som ikke er lett tilgjengelig for linseforskere som er interessert i relative stivhetsmålinger. Derfor fokuserer vi i denne studien på tilgjengelige metoder for å estimere linsens elastiske modul mens vi regner med linsestørrelse. Den elastiske modulen er en inneboende materialegenskap relatert til dens deformerbarhet: en høy elastisk modul tilsvarer et stivere materiale.
Testen i seg selv er en parallell platekompresjonstest og kan derfor utføres på egnede kommersielle mekaniske testsystemer. Her ble det konstruert et tilpasset instrument bestående av en motor, lineært stadium, bevegelseskontroller, lastcelle og forsterker. Disse ble styrt ved hjelp av tilpasset programvare som også registrerte tid, posisjon og belastning med jevne mellomrom. Griselinser tar ikke imot, men er lett tilgjengelige og rimelige17. Følgende metode ble utviklet for å gradvis komprimere øyelinsen og kvantifisere dens elastiske modul. Denne metoden kan enkelt replikeres og vil være nyttig i studiet av linsestivhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Griseøyne ble hentet fra et lokalt slakteri. Det var ikke nødvendig med godkjenning fra etiske komiteer.
1. Linsedisseksjon (figur 1)
- Fjern alt omkringliggende vev fra grisens øyne og overflødig kjøtt fra sclera, til bare optisk nerve forblir. Bruk buet tang og liten disseksjonsaks for å fullføre denne prosessen. Bruk nerven som et anker for å holde øyet under disseksjon.
- Bruk en skalpell, gjør en kort omkrets kutt ved limbus, deretter en annen ved ekvator.
MERK: Dette trinnet utføres i denne rekkefølgen for å unngå å skade linsen og kapselen. - Sett mikrosaks inn i kuttet ved limbus og fjern hornhinnen ved å løfte hornhinnen med fine, stumpe tang mens du skjærer rundt omkretsen av hornhinnen.
- Fjern iris ved å løfte med stump tang og klipp bort med mikrosaks.
- Sett disseksjonssaks inn i ekvatorialkuttet, og kutt deretter omkretsen rundt hele ekvator til scleraen er bisected.
- Når kuttet er fullført, fjern den bakre delen av sclera. Fjern glasslegemet forsiktig med tang, og etterlat minimalt med rester for å unngå å skade linsen. Hvis nødvendig, kutt glasslegemet koronalt for å la bakre trekke seg bort fra linsen og fremre segment.
- Lag en meridional kutt gjennom sclera fra fremre til bakre ved hjelp av mikrosaks.
- Begynn med det nye meridionale kuttet gjennom scleraen, bruk mikrosaks for å kutte zonulene bort fra linsen. Bruk vekten av linsen eller kanten av disseksjonsfatet, strekk forsiktig zonulene når du trekker linsen og sclera litt fra hverandre, slik at mikrosaksene kan kutte mellom linsen og ciliærlegemet, gjennom zonulene og rundt linsens omkrets. Dette vil isolere linsen uten å skade linsekapselen hvis det gjøres riktig.
- Hvis ønskelig, fjern kapselen med tang for å punktere kapselen ved ekvator, og fjern deretter kapselen med to tang.
- Plasser linsen i fosfatbufret saltvann (PBS). Inspiser linsen visuelt for eventuelle skader før mekanisk testing.
2. Linsekompresjon med/uten linsekapsel (figur 2)
MERK: Alle trinnene her, med unntak av trinn 2.1 og 2.4, er datastyrte.
- Oppnå eller konstruer et parallelt platekompresjonsapparat som har en lastcelle med 50 gram-kraftkapasitet med evnen til å måle forskyvning i størrelsesorden 1 μm.
- Programmer det motoriserte trinnet og last cellen for å utføre lasteregimet beskrevet nedenfor (f.eks. Tilleggsfil 1).
- Fyll nesten en firkantet boks med 1 5/8 tommer x 1 5/8 tommer med PBS og plasser den på komprimeringsplattformen.
- Senk den øvre platen i kontakt med den nedre platen for å bestemme den nedre bevegelsesgrensen og absolutt gaphøyde.
- Løft den øvre platen med ~ 15 mm.
- Sentrer linsen i esken, og pass på at ekvatorialplanet er horisontalt.
- Senk den øvre platen nær, men ikke i kontakt med, den øvre overflaten av objektivet.
- Start bevegelse for å flytte den øvre platen i kontakt med linsen, ved hjelp av krafttilbakemelding med en kontaktterskel på 3 mN.
- Start dataregistrering ved bestemmelse av kontakt, opptakstid, posisjon av den øvre platen i forhold til den nedre platen og kraft ved 500 Hz.
- Bruk en forkondisjoneringsbelastning der objektivet komprimeres med 2,5 % av starthøyden tre ganger, deretter 5 % tre ganger og deretter 7,5 % tre ganger med en hastighet på 1 %/s.
- Hold posisjonen til den øvre platen konstant i 1 min etter forkondisjonering.
- Påfør en 15% komprimering med en hastighet på 1% / s, etterfulgt av lossing med samme hastighet.
- Fortsett lossebevegelsen til den øvre platen har reist ytterligere 2 % av den ubelastede linsetykkelsen bort fra bunnplaten for å sikre at linsen er festet fra den øvre platen.
3. Estimering av linsemodul
- Beregn tykkelsen på objektivet basert på instrumentets gap ved kontaktpunktet. Alternativt kan du bruke bildeanalyse til å måle tykkelsen fra et fotografi tatt før testing.
- Beregn den elastiske modulen E ved hjelp av Hertz-modellen for komprimering av en kule mellom parallelle plater (ligning [1]; Tilleggsfil 2).
(1)
hvor R er krumningsradiusen ved kontaktpunktet (antatt lik halvparten av linsetykkelsen); F er kompresjonskraften rapportert av lastcellen;
er Poissons forhold (antatt lik 0,5 tilsvarende et inkompressibelt materiale); og u er den nedadgående tilnærmingen til det øvre trinnet fra kontaktpunktet. Merk at den elastiske modulen og Poissons forhold er materialegenskaper som indikerer henholdsvis objektivets iboende stivhet og objektivets relative komprimerbarhet.
MERK: Denne metoden forsømmer enhver rolle linsekapselen, men tar omtrent hensyn til linsens størrelse, slik at man kan sammenligne mellom arter.
(1)
er Poissons forhold (antatt lik 0,5 tilsvarende et inkompressibelt materiale); og u er den nedadgående tilnærmingen til det øvre trinnet fra kontaktpunktet. Merk at den elastiske modulen og Poissons forhold er materialegenskaper som indikerer henholdsvis objektivets iboende stivhet og objektivets relative komprimerbarhet.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks svineglass ble komprimert, først med kapselen intakt, deretter etter forsiktig fjerning av kapselen. Tykkelsesverdiene var 7,65 ± 0,43 mm for innkapslede objektiver og 6,69 ± 0,29 mm for innkapslede objektiver (gjennomsnittlig ± standardavvik). En typisk lastehistorikk er vist i figur 3. De resulterende kraftforskyvningskurvene var godt tilpasset Hertz-modellen (dvs. de hadde en kraft proporsjonal med forskyvningen hevet til kraften på 1,5; Figur 4). Dette gjaldt både de innkapslede og innkapslede linsene.
Linsene ble først komprimert med 15% av deres ubelastede tykkelse med en intakt kapsel, deretter etter fjerning av kapselen. Aksial kompresjon med 15% av den opprinnelige tykkelsen har tidligere vist seg å ikke forårsake skade på linsesuturene18. Dekapsulering resulterte i en signifikant reduksjon i effektiv elastisk modul (n = 6; p = 0,0138; Figur 5).
Figur 1: Disseksjonsteknikk. (A) Det ekstraokulære vevet fjernes. (B) En omkrets kuttes ved limbus. (C) Et omkretssnitt gjøres ved ekvator. (D) Hornhinnen fjernes. (E) Iris fjernes. (F) Øyet er todelt ved ekvator, deretter (G) glasslegemet fjernes, og etterlater (H) en ringformet ring som inneholder linsen, ciliary kroppen og zonules fortsatt festet til sclera. (I) En meridional kutt er laget gjennom sclera å (J) gi tilgang til zonules, (K) som er kuttet bort forlater (L) den innkapslede linsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kompresjonstestapparat. (A) Skjematisk og (B) fotografi av linsekompresjonsapparatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Anvendt lastehistorikk for en innkapslet svinelinse. Øverst: Forskyvningshistorikk. Nederst: Styrkehistorikk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Typiske kraftforskyvningsdata tilpasset Hertz-modellen. Venstre: Data for en innkapslet svinelinse. Høyre: Komprimeringsdata for samme objektiv etter innkapsling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Boks- og whiskerplott av innkapslet og innkapslet svinelinse effektiv elastisk moduli. Den effektive modulen til de innkapslede linsene var signifikant høyere enn for de innkapslede linsene (p = 0,013), noe som indikerer at tilstedeværelsen av kapselen vesentlig kan endre linsens effektive stivhet. Data er for seks linser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: MATLAB-applikasjon for å kontrollere linsekompresjonsapparatet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: MATLAB-funksjon for å estimere den elastiske modulen fra kraftkomprimeringsdata. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Linsekompresjon er en allsidig metode for å estimere objektivets stivhet. Prosedyrene beskrevet ovenfor tillater sammenligning mellom linser av forskjellige arter og forskjellige størrelser. Alle deformasjoner normaliseres mot linsestørrelse, og beregningen av den elastiske modulen tar omtrent hensyn til linsestørrelse. Den effektive modulen er betydelig høyere enn modulen som er rapportert tidligere for svinelinsen 4,7,11,19, i det minste delvis på grunn av bruken av tykkelse i stedet for krumningsradius: svinelinsens polare krumningsradier er betydelig større enn halvparten av tykkelsen20.
Den enkle analysen (dvs. bruk av Hertz-modellen) som presenteres her, har flere viktige begrensninger. For det første tar det ikke hensyn til tilstedeværelsen av linsekapselen. Det har vist seg at tilstedeværelsen av kapselen kan endre de biomekaniske egenskapene til linsen16,21 betydelig. Derfor er denne metoden best brukt på innkapslede linser. Dette er spesielt viktig ved sammenligning av arter i tilfeller der kapselen kan ha vesentlig forskjellig tykkelse eller biomekaniske egenskaper. Denne metoden forutsetter også at linsen er mekanisk homogen; Vi og andre har tidligere vist at dette generelt ikke er tilfelle for svine- eller menneskelinser 4,5,6,10,11,22. Det er derfor best å vurdere den elastiske modulverdien beregnet som en effektiv modul, som antagelig er relatert til det volumetriske gjennomsnittet av den romlig varierende modulen i linsen. Hertz-modellen antar at linsen er lineært elastisk, mens den er kjent for å være viskoelastisk; Dermed er den enkle analysen som foreslås her, ikke i stand til å gi informasjon om linsens viskoelastisitet. Tidligere arbeid har også vist at metoden og varigheten av linselagring før testing kan endre linsens egenskaper4; Alle svineglass ble derfor testet umiddelbart etter disseksjon ved ankomst til laboratoriet.
Forskjellen i kraftforskyvningsmålingene skyldes støy fra lastcelleforsterkeren: fjerning av kapselen gjør kraftmålingene betydelig lavere, og derfor er signal-støy-forholdet lavere. Forutsetningene som er brukt for å utlede Hertz-modellen inkluderer at sfæren er et homogent materiale; Derfor er den effektive elastiske modulen på en eller annen måte gjennomsnittlig deformerbarheten til linsen og dens kapsel når kapselen er til stede. Dette gjør sammenligninger mellom arter og alder spesielt vanskelig fordi en svinelinse har en kapsel ~ 60 μm tykk, mens en mus eller menneskelig linse har en kapsel i det 5-15 μm tykke området. Den elastiske modulen til kapselen kan også variere med art og alder, selv om disse avhengighetene er ukjente. Således, mens det er mulig å få en mindre støyende passform med kapselen, er sammenligningen iboende forvirret av tilstedeværelsen av kapselen - dette er grunnen til at vi anbefaler å utføre testen uten kapselen.
Til slutt ble den effektive modulen beregnet under forutsetning av at krumningsradiusen var halvparten av tykkelsen på linsen. Dette gjelder bare for en sfærisk linse; Svinelinsen er betydelig asfærisk, og de effektive modulverdiene er derfor betydelig høyere enn de ville vært hvis krumningsradiusen ble brukt i stedet. Denne siste antagelsen kan overvinnes ved å måle krumningsradiene, selv om dette kan være komplisert for den nedre overflaten som alltid er flat på grunn av kontakt med den nedre platen. Det er også mindre viktig for mer sfæriske linser som murine linser. Enda bedre er bruken av invers endelig elementanalyse for å fastslå de mekaniske egenskapene til linsen16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Støttet av National Institutes of Health grant R01 EY035278 (MR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
