Summary
Presentiamo un metodo automatizzato per caratterizzare il modulo elastico effettivo di una lente oculare utilizzando un test di compressione.
Abstract
Le proprietà biomeccaniche del cristallino oculare sono essenziali per la sua funzione di elemento ottico a potenza variabile. Queste proprietà cambiano drasticamente con l'età nel cristallino umano, con conseguente perdita della visione da vicino chiamata presbiopia. Tuttavia, i meccanismi di questi cambiamenti rimangono sconosciuti. La compressione della lente offre un metodo relativamente semplice per valutare la rigidità biomeccanica della lente in senso qualitativo e, se abbinata a tecniche analitiche appropriate, può aiutare a quantificare le proprietà biomeccaniche. Fino ad oggi sono stati eseguiti diversi test di compressione delle lenti, sia manuali che automatizzati, ma questi metodi applicano in modo incoerente aspetti chiave dei test biomeccanici come il precondizionamento, le velocità di carico e il tempo tra le misurazioni. Questo documento descrive un test di compressione dell'obiettivo completamente automatizzato in cui uno stadio motorizzato è sincronizzato con una telecamera per acquisire la forza, lo spostamento e la forma dell'obiettivo attraverso un protocollo di caricamento preprogrammato. Da questi dati si può quindi calcolare un modulo elastico caratteristico. Anche se qui è stato dimostrato utilizzando lenti suine, l'approccio è appropriato per la compressione di lenti di qualsiasi specie.
Introduction
Il cristallino è l'organo trasparente e flessibile che si trova nell'occhio che gli permette di mettere a fuoco a diverse distanze modificando il suo potere di rifrazione. Questa capacità è nota come accomodamento. Il potere refrattivo è alterato a causa della contrazione e del rilassamento del muscolo ciliare. Quando il muscolo ciliare si contrae, il cristallino si ispessisce e si sposta in avanti, aumentando il suo potere refrattivo 1,2. L'aumento del potere di rifrazione consente all'obiettivo di mettere a fuoco gli oggetti vicini. Con l'avanzare dell'età, il cristallino diventa più rigido e questa capacità di adattarsi viene gradualmente persa; Questa condizione è nota come presbiopia. Il meccanismo di irrigidimento rimane sconosciuto, almeno in parte a causa delle difficoltà associate alla caratterizzazione biomeccanica della lente.
Una varietà di metodi sono stati impiegati per stimare la rigidità della lente e le proprietà biomeccaniche. Questi includono la rotazione della lente 3,4,5, i metodi acustici 6,7,8, i metodi ottici come la microscopia di Brillouin9, l'indentazione10,11 e la compressione12,13. La compressione è la tecnica sperimentale più accessibile in quanto può essere eseguita con semplice strumentazione (es. vetrini coprioggetti14,15) o con un singolo stadio motorizzato. Abbiamo precedentemente mostrato come le proprietà biomeccaniche della lente possano essere rigorosamente stimate da un test di compressione16. Questo processo è tecnicamente impegnativo e richiede un software specializzato non facilmente accessibile ai ricercatori di lenti interessati alle misurazioni della rigidità relativa. Pertanto, nel presente studio, ci concentriamo su metodi accessibili per stimare il modulo elastico della lente tenendo conto delle dimensioni della lente. Il modulo elastico è una proprietà intrinseca del materiale legata alla sua deformabilità: ad un modulo elastico elevato corrisponde un materiale più rigido.
Il test stesso è un test di compressione su piastra parallela e può quindi essere eseguito su idonei sistemi di prova meccanici commerciali. Qui, è stato costruito uno strumento personalizzato composto da un motore, uno stadio lineare, un controller di movimento, una cella di carico e un amplificatore. Questi sono stati controllati utilizzando un software personalizzato che ha anche registrato il tempo, la posizione e il carico a intervalli regolari. Le lenti Pig non si adattano ma sono facilmente accessibili e poco costose17. Il seguente metodo è stato sviluppato per comprimere in modo incrementale il cristallino dell'occhio e quantificarne il modulo elastico. Questo metodo può essere facilmente replicato e sarà utile nello studio della rigidità della lente.
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Protocol
Gli occhi di maiale sono stati ottenuti da un mattatoio locale. Non è stata richiesta l'approvazione del comitato etico.
1. Dissezione della lente (Figura 1)
- Rimuovere tutto il tessuto circostante dagli occhi del maiale e la carne in eccesso dalla sclera, fino a quando non rimane solo il nervo ottico. Usa una pinza curva e piccole forbici da dissezione per completare questo processo. Usa il nervo come ancora per tenere l'occhio durante la dissezione.
- Usando un bisturi, fai un breve taglio circonferenziale sul limbus, poi un altro all'equatore.
NOTA: Questo passaggio viene eseguito in questo ordine per evitare di danneggiare la lente e la capsula. - Inserire le microforbici nel taglio in corrispondenza del limbus e rimuovere la cornea sollevando la cornea con una pinza a punta smussata mentre si taglia intorno alla circonferenza della cornea.
- Rimuovere l'iride sollevandola con una pinza a punta smussata e tagliarla con microforbici.
- Inserire le forbici di dissezione nel taglio equatoriale, quindi tagliare circonferenzialmente attorno all'intero equatore fino a quando la sclera non è divisa in due.
- Una volta completato il taglio, rimuovere la porzione posteriore della sclera. Rimuovere delicatamente il vitreo con una pinza, lasciando residui minimi per evitare di danneggiare la lente. Se necessario, tagliare l'umor vitreo coronalmente per consentire al posteriore di staccarsi dal cristallino e dal segmento anteriore.
- Fai un taglio meridionale attraverso la sclera da anteriore a posteriore usando le microforbici.
- Partendo dal nuovo taglio meridionale attraverso la sclera, usa le microforbici per tagliare le zonule lontano dalla lente. Usando il peso della lente o il bordo della piastra di dissezione, allungare delicatamente le zonule quando si separano leggermente la lente e la sclera, consentendo alle microforbici di tagliare tra la lente e il corpo ciliare, attraverso le zonule e intorno alla circonferenza della lente. Questo isolerà la lente senza danneggiare la capsula della lente se fatto correttamente.
- Se lo si desidera, rimuovere la capsula utilizzando una pinza per perforare la capsula all'equatore, quindi staccare la capsula utilizzando due pinze.
- Posizionare l'obiettivo in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Ispezionare visivamente l'obiettivo per eventuali danni prima di eseguire il test meccanico.
2. Compressione dell'obiettivo con/senza capsula dell'obiettivo (Figura 2)
NOTA: Tutti i passaggi qui, ad eccezione dei passaggi 2.1 e 2.4, sono controllati da computer.
- Ottenere o costruire un apparato di compressione a piastre parallele avente una cella di carico con capacità di forza di 50 grammi con la capacità di misurare lo spostamento dell'ordine di 1 μm.
- Programmare lo stadio motorizzato e caricare la cella per eseguire il regime di carico descritto di seguito (ad esempio, File supplementare 1).
- Riempi quasi una scatola quadrata di 1 5/8 pollici x 1 5/8 pollici con PBS e posizionala sulla piattaforma di compressione.
- Abbassare la piastra superiore a contatto con la piastra inferiore per determinare il limite inferiore di movimento e l'altezza assoluta della fessura.
- Sollevare la piastra superiore di ~15 mm.
- Centrare la lente nella scatola, facendo attenzione che il piano equatoriale sia orizzontale.
- Abbassare la piastra superiore vicino alla superficie superiore dell'obiettivo, ma non a contatto con essa.
- Avviare il movimento per portare la piastra superiore a contatto con l'obiettivo, utilizzando il force feedback con una soglia di contatto di 3 mN.
- Iniziare la registrazione dei dati dopo la determinazione del contatto, del tempo di registrazione, della posizione della piastra superiore rispetto alla piastra inferiore e della forza a 500 Hz.
- Applicare un carico di precondizionamento in cui l'obiettivo viene compresso del 2,5% della sua altezza iniziale tre volte, poi del 5% tre volte, quindi del 7,5% tre volte a una velocità dell'1%/s.
- Mantenere costante la posizione della piastra superiore per 1 minuto dopo il precondizionamento.
- Applicare una compressione del 15% a una velocità dell'1%/s, seguita dallo scarico alla stessa velocità.
- Continuare il movimento di scarico fino a quando la piastra superiore non si è allontanata di un ulteriore 2% dello spessore della lente scarica dalla piastra inferiore per assicurarsi che la lente sia staccata dalla piastra superiore.
3. Stima del modulo della lente
- Stimare lo spessore della lente in base alla distanza dello strumento nel punto di contatto. In alternativa, utilizzare l'analisi dell'immagine per misurare lo spessore di una fotografia scattata prima del test.
- Calcolare il modulo elastico E utilizzando il modello di Hertz per la compressione di una sfera tra piastre parallele (equazione [1]; Supplemento 2).
(1)
Dove R è il raggio di curvatura nel punto di contatto (assunto pari alla metà dello spessore della lente); F è la forza di compressione riportata dalla cella di carico;
è il rapporto di Poisson (assunto pari a 0,5 corrispondente ad un materiale incomprimibile); e u è l'avvicinamento verso il basso dello stadio superiore dal punto di contatto. Si noti che il modulo elastico e il rapporto di Poisson sono proprietà del materiale che indicano rispettivamente la rigidità intrinseca della lente e la relativa comprimibilità della lente.
NOTA: Questo metodo trascura qualsiasi ruolo della capsula del cristallino, ma tiene conto approssimativamente delle dimensioni del cristallino, consentendo il confronto tra le specie.
(1)
è il rapporto di Poisson (assunto pari a 0,5 corrispondente ad un materiale incomprimibile); e u è l'avvicinamento verso il basso dello stadio superiore dal punto di contatto. Si noti che il modulo elastico e il rapporto di Poisson sono proprietà del materiale che indicano rispettivamente la rigidità intrinseca della lente e la relativa comprimibilità della lente.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sei lenti suine sono state compresse, prima con la capsula intatta, poi dopo un'attenta rimozione della capsula. I valori di spessore erano di 7,65 ± 0,43 mm per le lenti incapsulate e di 6,69 ± 0,29 mm per le lenti decapsulate (media ± deviazione standard). Una tipica cronologia di caricamento è illustrata nella Figura 3. Le curve forza-spostamento risultanti erano ben adattate dal modello di Hertz (cioè, avevano una forza proporzionale allo spostamento elevato alla potenza di 1,5; Figura 4). Questo valeva sia per le lenti incapsulate che per quelle decapsulate.
Le lenti sono state prima compresse del 15% del loro spessore scaricato con una capsula intatta, quindi dopo la rimozione della capsula. È stato precedentemente dimostrato che la compressione assiale del 15% dello spessore iniziale non provoca danni alle suture della lente18. La decapsulazione ha comportato una significativa diminuzione del modulo elastico effettivo (n = 6; p = 0,0138; Figura 5).
Figura 1: Tecnica di dissezione. (A) I tessuti extraoculari vengono rimossi. (B) Viene praticato un taglio circonferenziale in corrispondenza del limbus. (C) Viene praticato un taglio circonferenziale all'equatore. (D) La cornea viene rimossa. (E) L'iride viene rimossa. (F) L'occhio viene diviso in due all'equatore, quindi (G) il vitreo viene rimosso, lasciando (H) un anello anulare contenente il cristallino, il corpo ciliare e le zonule ancora attaccate alla sclera. (I) Viene praticato un taglio meridionale attraverso la sclera per (J) dare accesso alle zonule, (K) che vengono tagliate lasciando (L) il cristallino incapsulato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Apparecchiatura per prove di compressione. (A) Schema e (B) fotografia dell'apparecchiatura di compressione dell'obiettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cronologia di caricamento applicata per una lente suina incapsulata. In alto: Cronologia degli spostamenti. In basso: Cronologia delle forze. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dati tipici di forza-spostamento montati con il modello Hertz. A sinistra: dati per una lente suina incapsulata. A destra: dati di compressione per lo stesso obiettivo dopo il decapsulamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Grafico a scatola e baffo di moduli elastici effettivi di lenti suincole incapsulate e decapsulate. Il modulo effettivo delle lenti incapsulate era significativamente superiore a quello delle lenti decapsulate (p = 0,013), indicando che la presenza della capsula può alterare sostanzialmente la rigidità effettiva della lente. I dati si riferiscono a sei obiettivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: applicazione MATLAB per il controllo dell'apparato di compressione delle lenti. Fare clic qui per scaricare il file.
File supplementare 2: funzione MATLAB per stimare il modulo elastico dai dati di forza-compressione. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
La compressione delle lenti è un metodo versatile per stimare la rigidità delle lenti. Le procedure sopra descritte consentono il confronto tra lenti di specie diverse e dimensioni diverse. Tutte le deformazioni sono normalizzate rispetto alle dimensioni dell'obiettivo e il calcolo del modulo elastico tiene conto approssimativamente delle dimensioni dell'obiettivo. Il modulo effettivo è considerevolmente superiore al modulo riportato in precedenza per la lente suina 4,7,11,19, almeno in parte a causa dell'uso dello spessore piuttosto che del raggio di curvatura: i raggi di curvatura polari della lente suina sono significativamente più grandi della metà dello spessore 20.
La semplice analisi (cioè l'uso del modello di Hertz) qui presentata presenta diverse limitazioni chiave. Innanzitutto, non tiene conto della presenza della capsula del cristallino. È stato dimostrato che la presenza della capsula può alterare significativamente le proprietà biomeccaniche del cristallino16,21. Pertanto, questo metodo è meglio applicato alle lenti decapsulate. Ciò è particolarmente importante quando si confrontano le specie nei casi in cui la capsula può avere spessori o proprietà biomeccaniche significativamente diversi. Questo metodo presuppone anche che la lente sia meccanicamente omogenea; Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che questo non è generalmente il caso per le lenti suine o umane 4,5,6,10,11,22. Pertanto, è meglio considerare il valore del modulo elastico calcolato come modulo effettivo, che è presumibilmente correlato alla media volumetrica del modulo spazialmente variabile all'interno della lente. Il modello di Hertz presuppone che la lente sia linearmente elastica, mentre è noto che è viscoelastica; Pertanto, la semplice analisi qui proposta non è in grado di fornire informazioni sulla viscoelasticità del cristallino. Lavori precedenti hanno anche dimostrato che il metodo e la durata della conservazione della lente prima del test possono alterare le proprietà della lente4; Tutte le lenti suine sono state quindi testate immediatamente dopo la dissezione all'arrivo in laboratorio.
La differenza nelle misure forza-spostamento è dovuta al rumore dell'amplificatore della cella di carico: la rimozione della capsula rende le misure di forza notevolmente inferiori, e quindi il rapporto segnale/rumore è inferiore. Le assunzioni utilizzate per derivare il modello di Hertz includono in modo importante che la sfera sia un materiale omogeneo; Pertanto, il modulo elastico effettivo è in qualche modo la media della deformabilità del cristallino e della sua capsula quando la capsula è presente. Ciò rende particolarmente difficili i confronti tra specie e tra età perché una lente suina ha una capsula spessa ~60 μm, mentre una lente di topo o umana ha una capsula spessa 5-15 μm. Il modulo elastico della capsula può anche variare con la specie e l'età, sebbene queste dipendenze siano sconosciute. Pertanto, mentre è possibile ottenere un adattamento meno rumoroso con la capsula, il confronto è intrinsecamente confuso dalla presenza della capsula: questo è il motivo per cui si consiglia di eseguire il test senza la capsula.
Infine, il modulo effettivo è stato calcolato assumendo che il raggio di curvatura fosse la metà dello spessore della lente. Questo è vero solo per una lente sferica; La lente suina è significativamente asferica e quindi i valori del modulo effettivo sono considerevolmente più alti di quelli che sarebbero se si utilizzasse invece il raggio di curvatura. Quest'ultima ipotesi può essere superata misurando i raggi di curvatura, anche se questo può essere complicato per la superficie inferiore che è sempre piatta a causa del contatto con la piastra inferiore. È anche meno importante per le lenti più sferiche come le lenti murine. Meglio ancora è l'uso dell'analisi agli elementi finiti inversi per accertare le proprietà meccaniche della lente16.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Supportato dalla sovvenzione R01 EY035278 (MR) del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
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