Summary
Vi præsenterer en protokol for et glasbaseret, semihydroponisk eksperimentelt system, der understøtter væksten af en række fylogenetisk forskellige planter med eller uden mikrober. Systemet er kompatibelt med forskellige vækstmedier og tillader ikke-destruktiv rodekssudatprøveudtagning til downstream-analyse.
Abstract
Root exudates former grænsefladen mellem plante og jord, er involveret i næringsstofcyklus og modulerer interaktioner med jordorganismer. Rodekssudater er dynamiske og formet af biologiske, miljømæssige og eksperimentelle forhold. På grund af deres store mangfoldighed og lave koncentrationer er nøjagtige ekssudatprofiler udfordrende at bestemme, endnu mere i naturlige miljøer, hvor andre organismer er til stede, vender planteafledte forbindelser og producerer yderligere forbindelser selv. Det semihydroponiske glasbeholdereksperimentelle system, der introduceres her, tillader kontrol over biologiske, miljømæssige og eksperimentelle faktorer. Det tillader vækst af forskellige fylogenetisk forskellige plantearter i op til flere måneder med eller uden mikrober i en række forskellige vækstmedier. Det glasbaserede design tilbyder en baggrund med lav metabolit for høj følsomhed og lav miljøpåvirkning, da den kan genbruges. Ekssudater kan udtages ikke-destruktivt, og betingelserne kan ændres i løbet af et eksperiment, hvis det ønskes. Opsætningen er kompatibel med massespektrometrianalyse og andre downstream-analyseprocedurer. Sammenfattende præsenterer vi et alsidigt vækstsystem, der er velegnet til følsom rodekssudatanalyse under forskellige forhold.
Introduction
Inden for tætbefolkede jordarter præsenterer rhizosfæren en kulstofrig niche. Det er formet af planterødder via ekssudation af op til 20% af assimileret kulstof og huser mikrobielle samfund, der adskiller sig fra det hjemmehørende jordmikrobiom 1,2,3,4,5,6. Da forskere udnytter de gavnlige funktioner hos rodassocierede mikrober og potentialet for bæredygtigt landbrug, der følger med det7, har denne observation, ofte betegnet som rhizosfæreeffekten, været fokus for voksende videnskabelig indsats. Indtil videre er den kemiske dialog mellem mikroorganismer og planter, som foreslås at være drivkraften bag rhizosfæreeffekten, imidlertid dårligt forstået, og derfor er den mekanistiske forståelse for udvikling af pålidelige mikrobielle løsninger i landbruget begrænset 8,9,10.
Dekryptering af rodekssudater i jordmiljøer, hvor metabolitter let absorberes af jordpartikler og hurtigt omsættes af mikrobielle samfund, er ikke ligetil, især for plantearter med fine rodsystemer som modelplanten Arabidopsis thaliana11. Dette er grunden til, at rodekssudater i de fleste undersøgelser udtages prøver fra hydroponiske systemer. I disse mikrokosmos holdes luftdele af planter på plads af tilpassede planteholdere eller mere lavmælte materialer som mesh, agar og glasperler. De anvendte beholdere spænder fra petriskåle over multibrøndsplader til forskellige brugerdefinerede og kommercielle kasser med eller uden beluftningsfiltre 12,13,14,15,16,17,18,19. Afhængigt af systemet vil plantevækstbetingelserne variere meget og afspejle naturlige forhold i større eller mindre grad.
Her præsenterer vi et glasbaseret, semihydroponisk system, der er eksperimentelt modtageligt og producerer meget reproducerbare resultater. Det er ligetil at samle og bruge og er baseret på almindeligt tilgængelige materialer. Systemet er baseret på en glasbeholder fyldt med glasperler, der udnytter glasvarernes genanvendelige natur og lavbindende egenskaber (figur 1). Perlerne giver fysisk støtte til den voksende plante og simulerer mekanisk impedans, hvilket bidrager til mere jordlignende rodarkitektur sammenlignet med hydroponiske opsætninger 19,20,21. Hvis de podes med mikrober, præsenterer glasperlerne overflader, som bakterier kan binde sig til.
Glasbeholderen kan lukkes for at opretholde sterilitet, og systemet er designet til at give tilstrækkelig frihøjde og luftcirkulation, så man undgår et miljø, der er mættet med fugt. Krukkerne er velegnede til langvarig vækst af forskellige plantearter og kan skaleres op og ned ved hjælp af krukker i forskellige størrelser. Her vises ansøgninger for seks plantearter, der dækker C3 og C4 græsser, dicots og bælgplanter. Blandt dem er modelarterne A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monocot), Medicago truncatula (bælgfrugter) samt afgrødearter som Solanum lycopersicum (tomat, dicot), Triticum aestivum (hvede, C3 monocot) og Sorghum bicolor (sorghum, C4 monocot). Den præsenterede protokol inkluderer eksperimentel opsætning af systemet, frøsterilisering og spiring af seks plantearter, transplantation af frøplanter til krukker, forskellige vækstmedier, mikrobeinokulation, rodekssudatprøveudtagning og ekssudatbehandling til analyse.
Protocol
1. Forberedelse af frøplanter: Overfladesterilisering af frø
BEMÆRK: Overfladesterilisering af frø og alle følgende trin skal udføres under sterile forhold, medmindre andet er angivet. Trin 1.1 til 1.4 er specifikke for overfladesterilisering af A. thaliana frø. Andre plantearter har alternative variationer i rørstørrelse (afhængigt af antallet af frø og frøstørrelse), tid i opløsninger og steriliseringsopløsninger (tabel 1).
- Tilsæt frø til et mikrocentrifugerør (maks. 20 mg frø) og dæk frøene med 70% ethanol.
FORSIGTIG: Ethanol er brandfarligt. Brug ikke nær åben ild. - Flyt de lukkede mikrocentrifugerør til en ryster i 15 minutter, og indstil rotationen således, at frøene forsigtigt omrøres.
- Fjern forsigtigt 70% ethanol med en pipette og erstat den med 100% ethanol. Gentag trin 1.2.
- Fjern 100% ethanol og tør frøene ved at lade mikrocentrifugerørets låg være åbne i en steril luftstrøm.
- Når frøene er tørre, spred dem jævnt ud på 0,5x Murashige og Skoog (MS) medium med 0,7% phyto agar ved at knipse røret eller bruge sterile tang. Luk agarpladerne og forsegl dem med 1,25 cm mikroporetape.
- Pladerne anbringes vandret på en hylde i vækstkammeret (16 timer lys/8 timer mørk, 22 °C dag/18 °C nat, 150-160 μmol m-2 s-1).
2. Forberedelse af frøplanter: Overførsel af spirede frø til friske plader
BEMÆRK: Følgende trin er specifikke for A. thaliana og er ikke nødvendige for andre arter.
- Efter spiring overføres 5 til 6 frøplanter til nye 0,7% phyto-agarplader med 0,5x MS-medium ved at placere frøplanterne lineært, ca. 3 cm fra toppen (se rosettens position i figur 2D).
- Forsegl agarplader med 1,25 cm mikroporetape og voks lodret i vækstkammeret (figur 2D), indtil frøplanterne er klar til at blive overført til krukker 15-18 dage efter spiring (tabel 2).
3. Forberedelse af hydroponisk system: Krukkeopsætning
- Tilsæt 150 ml rene 5 mm glasperler til hver ren krukke og luk med låget (figur 1A).
BEMÆRK: I denne protokol er 5 mm glasperler velegnede til de fleste arter22, men perlestørrelsen kan justeres, hvis det ønskes. - Anbring nok aluminiumsfolie over de lukkede glas til at dække låg-til-krukke-krydset og autoklaven (121 °C i 20 min) (figur 1B).
- Hold de forberedte krukker dækket, indtil planterne er klar til at blive overført (tabel 2).
4. Forberedelse af hydroponisk system: Tilsætning af kimplanter
- Når frøplanterne er klar til at blive overført til krukker (tabel 2), skal du fjerne aluminiumsfolien og lågene på glassene i den sterile bænk.
- Hvis glassene skal podes med bakterier, skal du udføre følgende trin, før du går videre til trin 4.3; Ellers skal du springe trin 4.2 over.
- Brug en steril podningssløjfe til at plukke enkelte kolonier fra rene bakteriekulturer på agarplader og suspendere dem i 750 μL steril 10 mM MgCl2. Gentag indtil opløsningen er grumset.
- Valgfrit: Suspensionen vaskes 3x med 750 μL steril 10 mMMgCl2 med 5 minutters centrifugering ved 1.000 × g og stuetemperatur efterfulgt af fjernelse af supernatanten og resuspension af pellet i 750 μL 10 mM MgCl2.
- Valgfrit: Ved podning af flere forskellige bakteriearter blandes suspensionerne af enkeltstammer fremstillet i trin 4.2.1-4.2.2 i lige store forhold, før der fortsættes.
- Den optiske tæthed ved bølgelængde 600 nm (OD600) justeres til 0,2-0,4 i 0,5x MS-medium (pH 5,7 til 5,9, justeret med KOH) eller et andet vækstmedium efter eget valg (se trin 4.3). OD600 måles igen for at kontrollere, om opløsningen er fortyndet korrekt.
FORSIGTIG: KOH er ætsende; Brug handsker og laboratoriefrakke. - Suspensionen fortyndes yderligere til OD600 0,002-0,004 i samme substrat (1:100 fortynding).
BEMÆRK: De endelige celletætheder afhænger af den anvendte bakteriestamme, men efter vores erfaring svarer dette podemateriale til ca. 3-6 × 105 celler ml-1. - Tilsæt 35 ml af den endelige fortynding pr. Krukke. Tilsæt 35 ml sterilt vækstmedium til kontrolglassene. Rør perlerne til jævnt at dække med 0,5x MS medier før planteoverførsel, så rødderne ikke tørrer. Fortsæt til trin 4.4.
- Tilsæt 35 ml 0,5x MS-medium til hver krukke (pH 5,7 til 5,9, juster med KOH). Rør perlerne til jævnt at dække med 0,5x MS medier før planteoverførsel, så rødderne ikke tørrer.
BEMÆRK: Vækstmediet kan ændres, for eksempel ved fjernelse af næringsstoffer, tilsætning af osmolytter for at fremkalde saltstress eller anvendelse af forskellige pH-værdier eller vækstmedier. FORSIGTIG: KOH er ætsende; Brug handsker og laboratoriefrakke. - Placer 3-5 A. thaliana planter i en krukke ved at placere rodsystemet mellem glasperlerne.
BEMÆRK: Antallet af planter pr. krukke er forskelligt for andre arter (tabel 2). - Flyt perlerne rundt med sterile pincet eller skeer for at dække rødderne og løft bladene ud af mediet (figur 1C).
BEMÆRK: Flyt forsigtigt planter og perler for at undgå at bryde rødderne og stresse planterne. - Tilsæt 2 strimler 1,25 cm mikroporetape på tværs af toppen af glassene og læg forsigtigt låget ovenpå (figur 1D-F).
BEMÆRK: Tryk ikke låget ned for at undgå at blokere luftudvekslingen. - Dæk mellemrummet mellem låg og krukke med 2,5 cm mikroporetape for at opretholde sterilitet, samtidig med at luftudveksling tillades, og anbring glassene i et vækstkammer (figur 1G, H).
- Opsæt 4-8 krukker pr. eksperimentel tilstand, afhængigt af det biologiske spørgsmål og den forventede variation.
- Sørg for at inkludere biologiske negative kontroller (f.eks. Krukker uden planter) for at tage højde for forsøgssystemets metabolitbaggrund. Opsæt det samme antal replikater til negative kontroller som til eksperimentelle behandlinger (f.eks. firdobler).
- I længere vækstperioder udskiftes vækstmediet ugentligt: Fjern resten af vækstmediet med en 25 ml volumetrisk pipet og tilsæt 35 ml frisk medium.
5. Indsamling af rodekssudater
- Når planterne når den ønskede alder, skal du fjerne 2,5 cm mikroporebåndet og låget i den sterile bænk.
BEMÆRK: For A. thaliana i vores vækstbetingelser repræsenterer 21 dage efter spiring et modent vegetativt stadium før blomstringens begyndelse. Vegetativt udviklingsstadium er specifikt for plantearten, og tidspunktet for vækstperioden ændres med plantearter; Denne timing kan ændres afhængigt af forskningsspørgsmålet. - Til sterilitetstest alikvote 20 μL vækstmedium og pipet på LB agarplader.
- For podede krukker alikvote 100 μL vækstmedium til brug for kimdannende enhedstællinger (CFU) (f.eks. i en fortyndingsserie23).
BEMÆRK: Det er vores erfaring, at bakterietætheder ligger inden for 10 5-108 levende celler ml-1 vækstmedium.
- For podede krukker alikvote 100 μL vækstmedium til brug for kimdannende enhedstællinger (CFU) (f.eks. i en fortyndingsserie23).
- Fjern så meget vækstmedium som muligt med en 25 ml volumetrisk pipet, undgå beskadigelse af rødderne.
- Tilsæt 50 ml opsamlingsmedium (f.eks. 20 mM ammoniumacetat; pH 5,7-5,9 justeret med HCI) ved pipettering langs glassets vægge for at undgå at gøre bladene våde. Luk glassene med låg og inkuber dem under sterile forhold til den ønskede tid for ekssudatopsamling. For tidsfølsomme eksperimenter er 2 timer et godt indsamlingsvindue.
FORSIGTIG: HCI er ætsende; Brug handsker og laboratoriefrakke. For længere opsamlingstider for rodekssudat skal du pakke lågene igen med tape og flytte glassene til vækstkammeret. - Efter 2 timer fjernes den ønskede mængde opsamlingsmedier i reagensglas (f.eks. 50 ml til analyser eller analyser med koncentrerede ekssudater eller 2 ml til direkte brug). Opbevar den opsamlede rodekssudat ved -80 °C indtil yderligere behandling eller analyse.
- Når du arbejder med podede glas, centrifugeres de opsamlede ekssudater i 10 minutter ved 5.000 × g og 4 °C, og der anvendes kun supernatanter til analysen. Alternativt filtreres ekssudaterne med et 0,22 μm eller 0,45 μm filter.
- Hvis eksperimentet er en del af en tidsserie, skal du fjerne alt resterende indsamlingsmedium fra krukker og tilføje 35 ml 0,5x MS-medium. Sæt låget og 2,5 cm tape på igen, inden glassene sættes tilbage i vækstkammeret.
- Mål roden og skyd frisk vægt af alle planterne i en krukke for senere at normalisere rodekssudater efter plantevægt.
BEMÆRK: Plantevæv kan desuden udtages, hvis det ønskes.
6. Behandling af rodekssudater til massespektrometri
- Afhængigt af analysemetoden frysetørres roden for at koncentrere sig, og opsamlingsmediet fjernes (-80 °C ved 0,37 mbar, indtil der ikke er væske til stede). Opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til analyse.
BEMÆRK: De data, der præsenteres her, blev genereret med flow-injektion TOF-MS-analyse på et nøjagtigt quadrupole time-of-flight-instrument. - Før injektion i analyseinstrumentet rekonstitueres frysetørrede ekssudater eller fortyndes uforarbejdede rodekssudater med opsamlingssubstrat i henhold til den friske rodvægt.
BEMÆRK: Opsamlingsmediet blev valgt til at være kompatibelt med massespektrometeret. Afhængigt af analysemetoden kan det dog være nødvendigt at afsalte trin før injektion.
Representative Results
Det eksperimentelle system, der introduceres her, tillader kontrol af eksperimentelle og miljømæssige faktorer, der ændrer rodekssudationsprofiler. Vi sammenlignede A. thaliana vækst under forskellige lysforhold, plantealder og plantetætheder på tværs af to forskellige laboratorier (figur 3). Planter så sunde ud på tværs af laboratorier (figur 3A, B). Kortdagsforhold (10 timers lys vs. 16 timers lys, figur 3) resulterede i højere rodmasse sammenlignet med langdagsforhold (figur 3C, D). Tilsvarende var den samlede rodmasse af alle planter dyrket under langvarige forhold mindre end i kortdag (figur 3C). Samlet set var variationen i væksten inden for og mellem krukker lav på tværs af laboratorier.
Glasbeholdersystemet er kompatibelt med en række plantearter og udviklingsstadier. Endepunktet for rodekssudatanalyse er typisk 21 dage, da mange plantearter under vores eksperimentelle forhold er i et modent vegetativt stadium, før de overgår til reproduktionsstadiet (figur 4A-E). Planter kan let fjernes fra forsøgssystemet uden synlig skade på rodsystemet. Således er det ligetil at bestemme vævsvægte eller bruge væv til nedstrømsanalyse. De højeste skudvægte blev fundet for hvede, efterfulgt af sorghum og tomat. De højeste rodvægte blev fundet for sorghum, efterfulgt af hvede og M. truncatula. Forholdet mellem rod og skud varierer mellem arter. Samlet set varierede vævsvægten mellem 100 mg og 800 mg.
Et centralt aspekt af eksperimentelle systemer, der tillader rodekssudatopsamling, er den kontrollerede podning med mikrober for at studere plante-mikrobe-interaktioner i et defineret miljø. Det præsenterede eksperimentelle system kan holdes sterilt selv ved gentagen manipulation (se 'kontrol' tilstand i figur 5), og bakterier kan tilsættes og vedligeholdes i længere perioder. Når 33 dage gamle A. thaliana planter blev podet med en blanding af kommensale bakterier ved OD600 0,004, fortsatte bakterier i 12 dage, hvilket var eksperimentets fulde varighed (figur 5). Kolonidannende enheder steg endda 100 gange i vækstmediet og koloniserede også rødderne (figur 5C). Fænotyper af podede planter kunne ikke skelnes fra sterile planter (figur 5A,B).
Det præsenterede eksperimentelle system tillader ekssudatopsamling under mange eksperimentelle forhold. Her præsenterer vi ekssudationsprofiler af A. thaliana Col-0 indsamlet enten i ammoniumacetat eller i vand fra de samme planter fortløbende (figur 6A). Ekssudater blev opbevaret ved -80 °C indtil analyse, normaliseret ved rodvægt og analyseret ved massespektrometri. Prøver af krukker indeholdende planter blev filtreret mod eksperimentelle kontroller (krukker uden planter). Ud af 2.163 metabolitter viste 436 et signal over baggrunden (20,16 %) og blev udvalgt til analyse. Af disse viste 416 eller 95% af forbindelserne tydelig overflod mellem de eksperimentelle betingelser. Imidlertid kunne 26 metabolitter ikke tilskrives nogen form for forbindelse og er derfor ikke defineret. De fleste metabolitter (406 eller 98%) var mere rigelige i vandindsamlede ekssudater. Den fortløbende samling af ekssudater først i ammoniumacetat og senere i vand kan påvirke ekssudationsprofilen, da metaboliske signaler kan fortyndes med tiden. Det næsten udelukkende højere ekssudationssignal i vand indsamlet som et andet tidspunkt understøtter imidlertid ikke denne hypotese: Ekssudatopsamling i rent vand skaber sandsynligvis et osmotisk chok for planter, hvilket forårsager de øgede metabolitmængder sammenlignet med et opsamlingsopløsningsmiddel, der er ækvivalent med vækstopløsningen (20 mM ammoniumacetat er ækvivalent til 0,5x MS-medium). Undersøgelse af kemiske klasser af identificerede forbindelser af begge vækstbetingelser viste, at størstedelen af forbindelserne er organiske syrer og derivater (28,6%) efterfulgt af organiske oxygenforbindelser (18%), organoheterocykliske forbindelser (14,2%) og lipider (13,2%). Kun en lille delmængde af metabolitter tilhører phenylpropanoider og polyketider (8,7%) og benzenoider (6%). Organiske nitrogenforbindelser, nukleosider, organosulfurforbindelser, alkaloider, lignaner og beslægtede forbindelser repræsenterer mellem 2% og 0,5% af de klassificerede forbindelser (figur 6B). Den fordeling af metabolitter, der er afbildet her, svarer til allerede offentliggjorte data ved hjælp af andre typer indsamlingssystemer for rodekssudater24.
Figur 1: Opsætning af glasburk. (A) Krukke med glasperler. (B) Krukke med glasperler, der er klar til at blive autoklaveret. (C) Frøplanter i krukker (set ovenfra). (D) Frøplanter i en krukke (set ovenfra) med 1,25 cm mikroporetape. (E) Frøplanter i krukker (set fra siden) med 1,25 cm mikroporetape. (F) Frøplanter i krukker (set fra siden) med 1,25 cm mikroporetape og låg. (G) Komplet krukkeopsætning med frøplanter i krukker (set fra siden) med 1,25 cm mikroporetape, låg og 2,5 cm mikroporetape. (H) Komplet glasopsætning (set ovenfra). (I) Planter, der er 21 dage gamle og klar til høst (set ovenfra). Krukke størrelse 147 mm højde x 100 mm diameter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Overfladesteriliserede frøplanter på 0,5x Murashige og Skoog medium agarplader i et vækstkammer. A) Arabidopsis thaliana (6 dage gammel) B) Brachypodium distachyon (6 dage gammel) C) Medicago truncatula (6 dage gammel) D ) A. thaliana (18 dage gammel). Agarplade størrelse 120 mm x 120 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Arabidopsis thaliana Col-0 planter dyrket i krukker under korte og lange dages lysforhold. A) krukke med tre 33 dage gamle planter, der dyrkes på korte dage (10 timer lys/14 timer mørke, 220 μmol m-2 s-1 lysintensitet, 21 °C dag/18 °C nat) og B) krukke med fem 21 dage gamle planter, der dyrkes på lange dage (16 timer lys/8 timer mørke, 150-160 μmol m-2 s-1 lysintensitet, 22 °C dag/18 °C nat). Rodvægt af (C) alle planter af en krukke og (D) af enkeltplanter. ** repræsenterer signifikansværdier for t-test (p < 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Fem fylogenetisk forskellige arter på dag 21 i opsætningen af det sterile glasbeholdersystem. (A) Model monocot Brachypodium distachyon, (B) model legume Medicago truncatula, (C) dicot Solanum lycopersicum (tomat), (D) dicot Sorghum bicolor, (E) monocot Triticum aestivum (hvede). (F) Frisk vægt af rødder og skud af de arter, der dyrkes i glaskrukker. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 dage gammel) dyrket under kortvarige forhold. (A) I en steril opsætning eller (B) podet i 12 dage med et konsortium af kommensale bakterier. C) Kolonidannende enheder til sterile (kontrol) og podede krukker af vækstsubstratet (venstre) og roden (højre). N = 4 krukker til den sterile kontroltilstand og n = 8 krukker til den podede tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Forskellige rodekssudatprofiler for 21 dage gamle A. thaliana Col-0. Ekssudater blev opsamlet i 2 timer i sterilt 20 mM ammoniumacetat (pH 5,7) efterfulgt af 2 timers opsamling i sterilfiltreret deioniseret vand. Metabolitter blev påvist ved massespektrometri ved direkte injektion. (A) Analyse af hovedbestanddele af 436 metabolitter påvist over baggrundsniveauet (sammenligning af krukker med planter mod krukker uden planter). PC: hovedkomponent med mængden af varians forklaret. Blå: vandopsamlede ekssudater, gule: ammoniumacetatopsamlede ekssudater. (B) Cirkeldiagram over 416 metabolitter, der er signifikant forskellige mellem eksperimentelle betingelser (Tukey-test) farvet i henhold til superklassen (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Art | Forberedelse af frø | Tid i 70% ethanol (min) | Koncentration af natriumhypochlorit (NaClO) (v/v % blegemiddel) | Tid i blegemiddel (min.) | ||
| Arabidopsis thaliana | 15 | Ingen; 100% ethanol | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | Afskallet | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorghum bicolor* | Afskallet | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | Afskallet | 0.5 | 12 | 20 | ||
Tabel 1: Steriliseringsmetoder for overfladefrø for flere arter. *Vasket 4-5x med filtreret deioniseret vand mellem ethanol og blegemiddel og i slutningen; eninkubation i 3-6 timer efter blegemiddel, erstattes med filtreret deioniseret vand hvert 30. minut.
| Art | Dag til krukker | Antal planter |
| Brachypodium distachyon | 4 til 5 | 3 |
| Sorghum bicolor | 4 til 5 | 3 |
| Triticum aestivum | 4 til 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 til 6 | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 til 8 | 3 |
| Arabidopsis thaliana | 17 | 3 til 5 |
Tabel 2: Frøplanternes alder i dage for overførsel til krukker og antal planter pr. krukke for forskellige plantearter.
Discussion
Det eksperimentelle system, der præsenteres her, er baseret på glaskrukker og glasperler og giver således et simpelt, lavt vedligeholdelsesniveau og alsidigt halvhydroponisk system til at studere rodekssudation i forskellige sammenhænge. Det er blevet brugt i undersøgelser, der undersøger ekssudationsprofilerne for forskellige plantearter25, ekssudationens reaktioner på forskellige vækstbetingelser25 samt indflydelsen af jordens fysiokemiske egenskaber på ekssudation22. Systemet er velegnet til alle plantearter, der testes her i længere vækstperioder, der spænder fra uger til måneder. Vedligeholdelsen af sterile forhold er ligetil, ligesom podningen med bakterier, som vedvarer i løbet af den analyserede 2-ugers vækstperiode. Således tillader det eksperimentelle system ikke kun en kontrolleret samling af rodekssudater under sterile forhold, men det kan også bruges til at studere plante-mikrobe-interaktioner. Desuden kan plantevækstmedierne varieres for at studere metaboliske reaktioner på forskellige næringsstofniveauer, og vækstperioder kan justeres ved at tilpasse lysforholdene eller bruge krukker i forskellige størrelser.
Undersøgelse af rodekssudater under hydroponiske eller semihydroponiske forhold forbliver standard i marken, hovedsageligt på grund af den forbedrede opløsning af metabolitter med lav koncentration11. Mange hydroponiske tilgange er afhængige af petriskåle, multibrøndplader eller andre små beholdere, der tillader sterilitet og høj gennemstrømning, men begrænser eksperimentering til små planter eller frøplanter dyrket i miljøer med høj luftfugtighed 17,18,26,27. I den præsenterede glasbeholderopsætning tilvejebringes tilstrækkelig hovedplads af de sammenligneligt store krukker, hvilket tillader forlængede vækstperioder. Micropore tape striber sikker luftudveksling, samtidig med at steriliteten opretholdes. Således kan selv høje monocots som byg og majs dyrkes i glasbeholderopsætningen i flere uger. Små planter som A. thaliana og kløver kan studeres i 4-5 uger efter spiring, herunder vegetative og reproduktive stadier.
Alternative hydroponiske opsætninger er også tilgængelige for større anlæg, men disse kræver ofte specialfremstillede kasser og indløb lavet af mesh, skumplader og engraftmentkurve til plantestøtte 15,28,29,30. Derudover er disse enheder normalt ikke indstillet til at være sterile, eller de kræver udfordrende opsætnings- og vedligeholdelsesprocedurer for at holde dem fri for mikrobielle og / eller kemiske kontamineringer. Opsætning og vedligeholdelse af sterilitet i det præsenterede eksperimentelle system er ligetil. Derudover reducerer brugen af glas til krukker og perler tilstedeværelsen af forurenende stoffer, der udvaskes fra plast, og sparer ressourcer, da det let kan vaskes og genbruges.
Glasperler er tidligere blevet anvendt til at efterligne jordpartikler. De inducerer naturlig rodudvikling i udstyr til prøveudtagning af rodekssudation, såsom ekssudationsfælder31 eller andre semihydroponiske systemer19. Glaskrukkeopsætningen udnytter denne udvikling og introducerer perlerne som koloniseringsoverflade for mikrober. I jord udvikler mikrobiomet omkring planterødder sig i et halvfast miljø med kompakte partikler og rum fyldt med luft eller vand. Selvom glasbeholderopsætningen ikke inkluderer aktiv beluftning af vækstmediet, hvorfor den nedre væskefase sandsynligvis ikke indeholder optimale iltniveauer, skaber kombinationen af et større perlevolumen med et mindre vækstmediumvolumen en fugtig, men luftet øvre fase, hvor mikrober kan vokse under oxiske forhold. Andre har foreslået at ryste vækstbeholdere26,28 eller bruge slanger koblet til luftpumper19,29 for at opretholde lufttilførsel i hydroponiske vækstsystemer. Disse systemer er imidlertid enten indstillet til ikke at være sterile eller kræver specialmateriale og konstant overvågning for at opretholde steriliteten. Derudover er der i tilfælde af omrystning meget omhu for at undgå nedsænkning af skud i vækstopløsninger og beskadigelse af rodsystemer. Ikke desto mindre kunne den præsenterede eksperimentelle opsætning, hvis det ønskes, tilpasses med yderligere materiale til beluftning.
Et afgørende aspekt at overveje i alle plante-mikrobe-interaktionsundersøgelser, der undersøger stofskiftet, er, at mikrober nedbryder planteafledte forbindelser og producerer metabolitter alene. Uden en specialiseret steril eksperimentel opsætning er det ikke muligt at skelne mellem plante- og mikrobeafledte metabolitter. For at hæmme mikrobiel aktivitet og berige planteafledte forbindelser foreslog Oburger et al. at kemisk sterilisere rodekssudatprøvetagningsopløsningen for at hæmme bakteriel nedbrydning32. Effekten af kemiske inhibitorer kunne undersøges i det præsenterede eksperimentelle system, hvor ekssudationsprofiler for sterile versus ikke-sterile planter behandlet med eller uden inhibitoren sammenlignes.
En hovedbegrænsning ved den præsenterede glasbeholderopsætning er, at vækstbetingelserne forbliver meget kunstige sammenlignet med jord. Ekssudater fra jorddyrkede planter indsamles ofte enten fra nedsivningssystemer13, hvor opløsningsmiddelgennemstrømninger samles i bunden af vækstbeholdere, eller jordhydroponiske hybridsystemer, hvor planter oprindeligt dyrkes i jord og derefter overføres til hydroponiske forhold16,33. I modsætning til glasbeholderopsætningen er disse procedurer normalt destruktive og tillader ikke flere samlinger over tid i skiftende vækstmiljøer. Mens der i perkoleringssystemer udtages prøver af jordbaggrunden sammen med ekssudaterne, omgås problemet med høj jordmetabolisk baggrund i jordhydroponiske hybridsystemer med overførsel til hydroponiske forhold til ekssudatopsamling. Selvom restitutionstider er blevet implementeret for at reducere metabolitlækage via sårede rødder11, er planteoverførslen meget forstyrrende, og sår vil sandsynligvis fortsætte, og plantemetabolismen kan ændre sig som reaktion på overførsel til hydroponiske forhold. Desuden fremkaldes et osmotisk chok i mange tilfælde ved at overføre planter til vand i stedet for en passende vækstopløsning16,33. I den præsenterede protokol udveksles vækstopløsningen med en ækvimolær opløsning for at opretholde osmotisk balance, hvilket stadig gør det muligt at fange ekssudation inden for et kort, defineret tidsvindue. Ændringen af vækstopløsningen er almindelig praksis i mange offentliggjorte undersøgelser og kan let opnås i hydroponiske opsætninger uden rodsår 12,16,26,34. På grund af sin alsidighed kan det præsenterede eksperimentelle system let tilpasses til at efterligne mere naturlige forhold, for eksempel ved at anvende sterilt eller ikke-sterilt jordekstrakt som en vækstopløsning med eller uden tilstedeværelse af faste jordpartikler. Den gradvise ændring mod naturlige forhold gør det muligt at studere virkningen af de forskellige fysiokemiske jordegenskaber og mikrobielle tilstedeværelse på plantemetabolisme og fysiologi. Før det videnskabelige samfund har en god forståelse af ekssudation i forskellige miljøer, er det ønskeligt at anvende jordbaserede og hydroponiske systemer parallelt, da begge opsætninger har deres fordele og begrænsninger13.
Afslutningsvis skiller den præsenterede semihydroponiske, glasbaserede eksperimentelle opsætning sig ud på grund af sin enkelhed kombineret med høj alsidighed af applikationer. Det præsenterer en tilgængelig, billig måde at indsamle og studere ekssudation under sterile forhold eller i kombination med mikrober og plante-mikrobe-interaktioner.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Dr. Nicola Zamboni og Prof. Dr. Uwe Sauer fra ETH Zürich, Schweiz, for at bestemme rodekssudationsprofilerne med direkte injektion og Prof. Dr. Klaus Schläppi fra Basel Universitet for A. thaliana kommensale bakterier. Desuden anerkender vi Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 til JS, der støtter S.M., A.S., E.M.S.) og PSC-Syngenta Fellowship-programmet (tildelt professor Dr. Klaus Schläppi og JS, der støtter C.J.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
| Aluminum foil | FORA GmbH | ||
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
| Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
| Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
| Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
| Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
References
- Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
- Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738 (2018).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
- Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
- Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
- Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
- Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286 (2023).
- O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473 (2022).
- Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
- Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
- Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
- Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
- Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170 (2018).
- Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25 (2022).
- Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
- Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207 (2020).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033 (2016).
- McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649 (2023).
- Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955 (2017).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606 (2018).
- Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
- Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
- Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498 (2012).
- Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577 (2020).
