Summary
Mikroplu veya mikropsuz filogenetik olarak farklı çeşitli bitkilerin büyümesini destekleyen cam bazlı, yarı hidroponik bir deney sistemi için bir protokol sunuyoruz. Sistem, farklı büyüme ortamlarıyla uyumludur ve aşağı akış analizi için tahribatsız kök eksüda örneklemesine izin verir.
Abstract
Kök eksüdaları bitki-toprak arayüzünü şekillendirir, besin döngüsünde yer alır ve toprak organizmaları ile etkileşimleri modüle eder. Kök eksüdaları dinamiktir ve biyolojik, çevresel ve deneysel koşullara göre şekillenir. Geniş çeşitlilikleri ve düşük konsantrasyonları nedeniyle, doğru eksüda profillerinin belirlenmesi zordur, hatta diğer organizmaların bulunduğu, bitki kaynaklı bileşiklerin ters çevrildiği ve ek bileşiklerin kendileri üretildiği doğal ortamlarda daha da zordur. Burada tanıtılan yarı hidroponik cam kavanoz deney sistemi, biyolojik, çevresel ve deneysel faktörler üzerinde kontrol sağlar. Filogenetik olarak farklı çeşitli bitki türlerinin, çeşitli farklı büyüme ortamlarında, mikroplu veya mikropsuz birkaç aya kadar büyümesine izin verir. Cam bazlı tasarım, yeniden kullanılabildiği için yüksek hassasiyet ve düşük çevresel etki için düşük metabolitli bir arka plan sunar. Eksüdalar tahribatsız bir şekilde örneklenebilir ve istenirse bir deney sırasında koşullar değiştirilebilir. Kurulum, kütle spektrometrisi analitiği ve diğer aşağı akış analitik prosedürleriyle uyumludur. Özetle, çeşitli koşullarda hassas kök eksüda analizi için uygun çok yönlü bir büyüme sistemi sunuyoruz.
Introduction
Yoğun nüfuslu topraklarda, rizosfer karbon açısından zengin bir niş sunar. Asimile edilmiş karbonun %20'ye kadarının eksüdasyonu yoluyla bitki kökleri tarafından şekillendirilir ve yerleşik toprak mikrobiyomu 1,2,3,4,5,6'dan farklı mikrobiyal toplulukları barındırır. Araştırmacılar, kökle ilişkili mikropların yararlı işlevlerinden ve onunla birlikte gelen sürdürülebilir tarım potansiyelindenyararlandıkça, 7, genellikle rizosfer etkisi olarak adlandırılan bu gözlem, artan bilimsel çabaların odak noktası olmuştur. Bununla birlikte, şimdiye kadar, rizosfer etkisinin itici gücü olduğu öne sürülen mikroorganizmalar ve bitkiler arasındaki kimyasal diyalog tam olarak anlaşılamamıştır ve bu nedenle, tarımda güvenilir mikrobiyal çözümlerin geliştirilmesine yönelik mekanik anlayış sınırlıdır 8,9,10.
Metabolitlerin toprak parçacıkları tarafından kolayca emildiği ve mikrobiyal topluluklar tarafından hızla çevrildiği toprak ortamlarında kök eksüdalarının deşifre edilmesi, özellikle model bitki Arabidopsis thaliana11 gibi ince kök sistemlerine sahip bitki türleri için kolay değildir. Bu nedenle, çoğu çalışmada kök eksüdaları hidroponik sistemlerden örneklenir. Bu mikro kozmoslarda, bitkilerin hava kısımları, özelleştirilmiş bitki tutucular veya ağ, agar ve cam boncuklar gibi daha düşük anahtar malzemeler tarafından yerinde tutulur. Kullanılan kaplar, çok kuyulu plakalar üzerindeki Petri kaplarından, havalandırma filtreli veya filtresiz çeşitli özel ve ticari kutularakadar çeşitlilik gösterir 12,13,14,15,16,17,18,19. Sisteme bağlı olarak, bitki yetiştirme koşulları büyük ölçüde değişecek ve doğal koşulları az ya da çok yansıtacaktır.
Burada, deneysel olarak uygun ve yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar üreten cam bazlı, yarı hidroponik bir sistem sunuyoruz. Montajı ve kullanımı kolaydır ve yaygın olarak bulunan malzemelere dayanmaktadır. Sistem, cam eşyaların yeniden kullanılabilir doğasından ve düşük bağlayıcı özelliklerinden yararlanarak, cam boncuklarla doldurulmuş bir cam kavanoza dayanmaktadır (Şekil 1). Boncuklar, büyüyen bitki için fiziksel destek sağlar ve mekanik empedansı simüle ederek, hidroponik kurulumlara kıyasla daha fazla toprak benzeri kök mimarisine katkıda bulunur 19,20,21. Mikroplarla aşılanırsa, cam boncuklar bakterilerin tutunabileceği yüzeyler sunar.
Steriliteyi korumak için cam kavanoz kapatılabilir ve sistem, neme doymuş bir ortamdan kaçınarak yeterli üst boşluk ve hava sirkülasyonu sağlayacak şekilde tasarlanmıştır. Kavanozlar, farklı bitki türlerinin uzun süreli büyümesi için uygundur ve farklı büyüklükteki kavanozlar kullanılarak büyütülebilir ve küçültülebilir. Burada, C3 ve C4 otlarını, dikotları ve baklagilleri kapsayan altı bitki türü için uygulamalar gösterilmektedir. Bunlar arasında model türler A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monokot), Medicago truncatula (baklagil) ve Solanum lycopersicum (domates, dikot), Triticum aestivum (buğday, C3 monokot) ve Sorghum bicolor (sorgum, C4 monokot) gibi mahsul türleri bulunmaktadır. Sunulan protokol, sistemin deneysel kurulumunu, altı bitki türünün tohum sterilizasyonunu ve çimlenmesini, fidelerin kavanozlara nakledilmesini, farklı büyüme ortamlarını, mikrop aşılamayı, kök eksüda örneklemesini ve analitik için eksüda işlemeyi içerir.
Protocol
1. Fidelerin hazırlanması: Tohumların yüzey sterilizasyonu
NOT: Tohumların yüzey sterilizasyonu ve sonraki tüm adımlar, aksi belirtilmedikçe steril koşullarda yapılmalıdır. 1.1'den 1.4'e kadar olan adımlar, A. thaliana tohumlarının yüzey sterilizasyonu için spesifiktir. Diğer bitki türleri, tüp boyutunda (tohum sayısına ve tohum boyutuna bağlı olarak), çözeltilerde geçen süre ve sterilizasyon çözeltilerinde alternatif varyasyonlara sahiptir (Tablo 1).
- Bir mikrosantrifüj tüpüne tohum ekleyin (maksimum 20 mg tohum) ve tohumları% 70 etanol ile kaplayın.
DİKKAT: Etanol yanıcıdır. Açık alevin yakınında kullanmayın. - Kapalı mikrosantrifüj tüplerini 15 dakika boyunca bir çalkalayıcıya taşıyın ve dönüşü tohumlar hafifçe çalkalanacak şekilde ayarlayın.
- % 70 etanolü bir pipetle dikkatlice çıkarın ve% 100 etanol ile değiştirin. Adım 1.2'yi tekrarlayın.
- % 100 etanolü çıkarın ve mikrosantrifüj tüpü kapaklarını steril bir hava akışında açık bırakarak tohumları kurutun.
- Tohumlar kuruduktan sonra, tüpü hafifçe vurarak veya steril forseps kullanarak% 0.7 fito agar ile 0.5x Murashige ve Skoog (MS) ortamına eşit olarak yayın. Agar plakalarını kapatın ve 1,25 cm mikro gözenekli bantla kapatın.
- Plakaları büyüme odasındaki bir rafa yatay olarak yerleştirin (16 saat aydınlık/8 saat karanlık, 22 °C gündüz/18 °C gece, 150-160 μmol m-2 s-1).
2. Fidelerin hazırlanması: Çimlenen tohumların taze tabaklara aktarılması
NOT: Aşağıdaki adımlar A. thaliana'ya özeldir ve diğer türler için gerekli değildir.
- Çimlenmeden sonra, fideleri üstten yaklaşık 3 cm uzağa doğrusal olarak yerleştirerek 5 ila 6 fideyi 0.5x MS ortamlı yeni% 0.7 fito agar plakalarına aktarın ( Şekil 2D'deki rozetin konumuna bakın).
- Agar plakalarını 1.25 cm mikro gözenekli bantla kapatın ve fideler çimlenmeden 15-18 gün sonra kavanozlara aktarılmaya hazır olana kadar büyüme odasında dikey olarak büyütün (Şekil 2D) (Tablo 2).
3. Hidroponik sistemin hazırlanması: Kavanoz kurulumu
- Her temiz kavanoza 150 mL temiz 5 mm cam boncuk ekleyin ve kapakla kapatın (Şekil 1A).
NOT: Bu protokolde çoğu tür22 için 5 mm cam boncuklar uygundur, ancak istenirse boncuk boyutu ayarlanabilir. - Kapalı kavanozların üzerine, kapak-kavanoz bağlantısını ve otoklavı (20 dakika boyunca 121 °C) kaplayacak kadar alüminyum folyo yerleştirin (Şekil 1B).
- Bitkiler aktarılmaya hazır olana kadar hazırlanan kavanozları kapalı tutun (Tablo 2).
4. Hidroponik sistemin hazırlanması: Fide ilavesi
- Fideler kavanozlara aktarılmaya hazır olduğunda (Tablo 2), steril tezgahtaki kavanozların alüminyum folyosunu ve kapaklarını çıkarın.
- Kavanozlara bakteri aşısı yapılacaksa, adım 4.3'e geçmeden önce aşağıdaki adımları uygulayın; Aksi takdirde, Adım 4.2'yi atlayın.
- Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, agar plakaları üzerindeki saf bakteri kültürlerinden tek kolonileri seçin ve bunları 750 μL steril 10 mM MgCl2 içinde süspanse edin. Çözelti bulanıklaşana kadar tekrarlayın.
- İsteğe bağlı: Süspansiyonu 3x 750 μL steril 10 mM MgCl2 ile 1.000 × g ve oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleme ile yıkayın, ardından süpernatantın çıkarılması ve peletin 750 μL 10 mM MgCl2'de yeniden süspansiyonu yapın.
- İsteğe bağlı: Birkaç farklı bakteri türü aşılanıyorsa, devam etmeden önce 4.2.1-4.2.2 adımlarında hazırlanan tek suşların süspansiyonlarını eşit oranlarda karıştırın.
- Optik yoğunluğu 600x MS ortamında (pH600 ila 0.5, KOH ile ayarlanmış) veya tercih edilen başka bir büyüme ortamında 0.2-0.4 dalga boyunda (OD 5.5) ayarlayın (bkz. adım 4.3). Çözeltinin doğru şekilde seyreltilip seyreltilmediğini kontrol etmek için OD600'ü tekrar ölçün.
DİKKAT: KOH aşındırıcıdır; Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. - Süspansiyonu aynı ortamda OD600 0.002-0.004'e kadar seyreltin (1:100 seyreltme).
NOT: Nihai hücre yoğunlukları kullanılan bakteri suşuna bağlı olacaktır, ancak deneyimlerimize göre bu aşı yaklaşık 3-6 × 105 hücre mL-1'e karşılık gelir. - Kavanoz başına 35 mL son seyreltme ekleyin. Kavanozları kontrol etmek için 35 mL steril büyüme ortamı ekleyin. Köklerin kurumaması için bitki transferinden önce boncukları 0.5x MS ortamı ile eşit şekilde kaplamak için karıştırın. Adım 4.4'e geçin.
- Her kavanoza 35 mL 0.5x MS ortamı ekleyin (pH 5.7 ila 5.9, KOH ile ayarlayın). Bitki transferinden önce boncukları 0.5x MS ortamı ile eşit şekilde kaplamak için karıştırın, böylece kökler kurumaz.
NOT: Büyüme ortamı, örneğin besin maddelerinin uzaklaştırılması, tuz stresini indüklemek için ozmolitlerin eklenmesi veya farklı pH değerlerinin veya büyüme ortamının kullanılmasıyla değiştirilebilir. DİKKAT: KOH aşındırıcıdır; Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. - 3-5 adet A. thaliana bitkisini kök sistemlerini cam boncukların arasına yerleştirerek bir kavanoza koyun.
NOT: Kavanoz başına düşen bitki sayısı diğer türler için farklıdır (Tablo 2). - Kökleri örtmek için boncukları steril forseps veya kaşıklarla hareket ettirin ve yaprakları ortamdan kaldırın (Şekil 1C).
NOT: Kökleri kırmamak ve bitkileri strese sokmamak için bitkileri ve boncukları dikkatlice hareket ettirin. - Kavanozların üstüne 2 şerit 1.25 cm mikro gözenekli bant ekleyin ve kapağı yavaşça üstüne yerleştirin (Şekil 1D-F).
NOT: Hava değişimini engellememek için kapağı aşağı bastırmayın. - Hava değişimine izin verirken steriliteyi korumak için kapak ile kavanoz arasındaki boşluğu 2.5 cm mikro gözenekli bantla kapatın ve kavanozları bir büyüme odasına yerleştirin (Şekil 1G,H).
- Biyolojik soruya ve beklenen değişkenliğe bağlı olarak deneysel koşul başına 4-8 kavanoz ayarlayın.
- Deney sisteminin metabolit arka planını hesaba katmak için biyolojik negatif kontrolleri (örneğin, bitkisiz kavanozlar) dahil ettiğinizden emin olun. Negatif kontroller için deneysel tedavilerle aynı sayıda kopya ayarlayın (örneğin, dörtlü kopyalar).
- Uzun büyüme periyotları için, büyüme ortamını haftalık olarak değiştirin: büyüme ortamının geri kalanını 25 mL hacimsel pipetle çıkarın ve 35 mL taze ortam ekleyin.
5. Kök eksüdaların toplanması
- Bitkiler istenilen yaşa ulaştığında steril tezgahtaki 2,5 cm'lik mikro gözenekli bandı ve kapağı çıkarın.
NOT: Büyüme koşullarımızda A. thaliana için, çimlenmeden 21 gün sonra, çiçeklenme başlangıcından önce olgun bir vejetatif aşamayı temsil eder. Vejetatif gelişim aşaması bitki türüne özgüdür ve büyüme periyodunun zamanlaması bitki türlerine göre değişir; Bu zamanlama araştırma sorusuna bağlı olarak değiştirilebilir. - Sterilite testi için, 20 μL büyüme ortamını alikotlayın ve LB agar plakalarına pipetleyin.
- Aşılanmış kavanozlar için, Koloni Oluşturan Birim (CFU) sayımları için kullanılacak 100 μL büyüme ortamının alikotu (örneğin, bir seyreltme serisinde23).
NOT: Deneyimlerimize göre, bakteri yoğunlukları, büyüme ortamının 105-10 8 canlı hücre mL-1'i arasında değişir.
- Aşılanmış kavanozlar için, Koloni Oluşturan Birim (CFU) sayımları için kullanılacak 100 μL büyüme ortamının alikotu (örneğin, bir seyreltme serisinde23).
- Köklere zarar vermemek için 25 mL'lik bir hacimsel pipetle mümkün olduğunca fazla büyüme ortamını çıkarın.
- Yaprakların ıslanmasını önlemek için kavanozun duvarları boyunca pipetleyerek 50 mL toplama ortamı (örneğin, 20 mM amonyum asetat; HCl ile ayarlanmış pH 5.7-5.9) ekleyin. Kavanozları kapaklarla kapatın ve istenen eksüda toplama süresi boyunca steril koşullarda inkübe edin. Zamana duyarlı deneyler için 2 saat iyi bir toplama aralığıdır.
DİKKAT: HCl aşındırıcıdır; Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Daha uzun kök eksüda toplama süreleri için, kapakları tekrar bantla sarın ve kavanozları büyüme odasına taşıyın. - 2 saat sonra, istenen miktarda toplama ortamını tüplere çıkarın (ör., konsantre eksüdalar kullanılarak yapılan tahliller veya analizler için 50 mL veya doğrudan kullanım için 2 mL). Toplanan kök eksüdalarını daha fazla işleme veya analize kadar -80 °C'de saklayın.
- Aşılanmış kavanozlarla çalışırken, toplanan eksüdaları 5.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve analiz için sadece süpernatanlar kullanın. Alternatif olarak, eksüdaları 0,22 μm veya 0,45 μm filtre ile filtreyle sterilize edin.
- Deney bir zaman serisinin parçasıysa, kalan tüm toplama ortamını kavanozlardan çıkarın ve 35 mL 0,5x MS ortamı ekleyin. Kavanozları büyütme odasına geri koymadan önce kapağı ve 2,5 cm'lik bandı değiştirin.
- Kökü ölçün ve daha sonra kök eksüdalarını bitki ağırlığına göre normalleştirmek için tüm bitkilerin taze ağırlığını bir kavanozda çekin.
NOT: İstenirse bitki dokularından ek olarak numune alınabilir.
6. Kütle spektrometrisi için kök eksüdaların işlenmesi
- Analitik yönteme bağlı olarak, toplama ortamını konsantre etmek ve çıkarmak için kök eksüdalarını dondurarak kurutun (sıvı kalmayana kadar 0,37 mbar'da -80 °C). Analize hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Burada sunulan veriler, doğru kütleli dört kutuplu bir uçuş süresi cihazında akış enjeksiyonlu TOF-MS analizi ile oluşturulmuştur. - Analitik cihaza enjeksiyondan önce, dondurularak kurutulmuş eksüdaları sulandırın veya işlenmemiş kök eksüdalarını kök taze ağırlığına göre toplama ortamı ile seyreltin.
NOT: Toplama ortamı, kütle spektrometresi ile uyumlu olacak şekilde seçilmiştir. Bununla birlikte, analitik yönteme bağlı olarak, enjeksiyondan önce tuzdan arındırma adımları gerekli olabilir.
Representative Results
Burada tanıtılan deneysel sistem, kök eksüdasyon profillerini değiştiren deneysel ve çevresel faktörlerin kontrolüne izin verir. İki farklı laboratuvarda farklı aydınlatma koşulları, bitki yaşı ve bitki yoğunlukları altında A. thaliana büyümesini karşılaştırdık (Şekil 3). Bitkiler laboratuvarlarda sağlıklı görünüyordu (Şekil 3A,B). Kısa gün koşulları (10 saat ışıklara karşı 16 saat ışık, Şekil 3), uzun gün koşullarına kıyasla daha yüksek kök kütlesi ile sonuçlandı (Şekil 3C, D). Benzer şekilde, uzun gün koşullarında yetiştirilen tüm bitkilerin toplam kök kütlesi, kısa gün koşullarına göre daha küçüktü (Şekil 3C). Genel olarak, kavanozların içindeki ve arasındaki büyümenin değişkenliği laboratuvarlar arasında düşüktü.
Cam kavanoz sistemi, çeşitli bitki türleri ve gelişim aşamaları ile uyumludur. Kök eksüda analizi için son nokta tipik olarak 21 gündür, çünkü deney koşullarımızda birçok bitki türü üreme aşamasına geçmeden önce olgun bir vejetatif aşamadadır (Şekil 4A-E). Bitkiler, kök sistemine gözle görülür bir zarar vermeden deney sisteminden kolayca çıkarılabilir. Bu nedenle, doku ağırlıklarının belirlenmesi veya aşağı akış analizi için dokuların kullanılması basittir. En yüksek sürgün ağırlıkları buğdayda bulunurken, bunu sorgum ve domates izlemiştir. En yüksek kök ağırlıkları sorgum için bulunurken, bunu buğday ve M. truncatola izledi. Kök:sürgün oranı türler arasında farklılık gösterir. Genel olarak, doku ağırlıkları 100 mg ile 800 mg arasında değişmiştir.
Kök eksüda toplamaya izin veren deneysel sistemlerin merkezi bir yönü, tanımlanmış bir ortamda bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için mikroplarla kontrollü aşılamadır. Sunulan deney sistemi, tekrarlanan manipülasyonla bile steril tutulabilir (Şekil 5'teki 'kontrol' koşuluna bakınız) ve bakteriler eklenebilir ve uzun süreler boyunca korunabilir. 33 günlük A. thaliana bitkileri OD600 0.004'te bir kommensal bakteri karışımı ile aşılandığında, bakteriler deneyin tam süresi olan 12 gün boyunca devam etti (Şekil 5). Koloni oluşturan birimler büyüme ortamında 100 kat arttı ve ayrıca kökleri kolonize etti (Şekil 5C). Aşılanmış bitkilerin fenotipleri, steril bitkilerinkinden ayırt edilemezdi (Şekil 5A,B).
Sunulan deneysel sistem, birçok deneysel koşulda eksüda toplanmasına izin verir. Burada, aynı bitkilerden amonyum asetat veya suda art arda toplanan A. thaliana Col-0'ın eksüdasyon profillerini sunuyoruz (Şekil 6A). Eksüdalar, analize kadar -80 °C'de saklandı, kök ağırlığına göre normalize edildi ve kütle spektrometrisi ile analiz edildi. Bitki içeren kavanoz örnekleri, deneysel kontrollere (bitkisiz kavanozlar) göre filtrelendi. 2.163 metabolitten 436'sı arka planın üzerinde bir sinyal gösterdi (% 20.16) ve analiz için tutuldu. Bunlardan, bileşiklerin 416 veya% 95'i, deney koşulları arasında belirgin bolluk gösterdi. Bununla birlikte, 26 metabolit herhangi bir bileşiğe atfedilemez ve bu nedenle tanımlanmamıştır. Çoğu metabolit (% 406 veya% 98) su ile toplanan eksüdalarda daha bol miktarda bulunur. Eksüdaların önce amonyum asetatta ve daha sonra suda art arda toplanması, metabolik sinyaller zamanla seyrelebileceğinden eksüdasyon profilini etkileyebilir. Bununla birlikte, ikinci bir zaman noktası olarak toplanan sudaki neredeyse tamamen daha yüksek eksüdasyon sinyali bu hipotezi desteklememektedir: Saf suda eksüda toplanması muhtemelen bitkiler için ozmotik bir şok yaratır, bu da büyüme çözeltisine eşmolar bir toplama çözücüsüne kıyasla metabolit bolluğunun artmasına neden olur (20 mM amonyum asetat, 0.5x MS ortamına eşmolardır). Her iki büyüme koşulunda tanımlanan bileşiklerin kimyasal sınıflarının araştırılması, bileşiklerin çoğunluğunun organik asitler ve türevleri (% 28.6), ardından organik oksijen bileşikleri (% 18), organoheterosiklik bileşikler (% 14.2) ve lipitler (% 13.2) olduğunu göstermiştir. Metabolitlerin sadece küçük bir alt kümesi fenilpropanoidlere ve poliketidlere (% 8.7) ve benzenoidlere (% 6) aittir. Organik azot bileşikleri, nükleositler, organosülfür bileşikleri, alkaloidler, lignanlar ve ilgili bileşikler, sınıflandırılan bileşiklerin %2 ila %0.5'ini temsil eder (Şekil 6B). Burada gösterilen metabolitlerin dağılımı, diğer kök eksüda toplama sistemleri24 kullanılarak önceden yayınlanmış verilere karşılık gelir.
Şekil 1: Cam kavanoz kurulumu. (A) Cam boncuklu kavanoz. (B) Otoklavlanmaya hazır cam boncuklu kavanoz. (C) Kavanozlardaki fideler (üstten görünüm). (D) 1,25 cm mikro gözenekli bantlı bir kavanozda (üstten görünüm) fideler. (E) 1,25 cm mikro gözenekli bantlı kavanozlarda (yandan görünüm) fideler. (F) 1,25 cm mikro gözenekli bant ve kapaklı kavanozlarda (yandan görünüm) fideler. (G) 1,25 cm mikro gözenekli bant, kapak ve 2,5 cm mikro gözenekli bant ile kavanozlarda (yandan görünüm) fidelerle kavanoz kurulumunu tamamlayın. (H) Kavanoz kurulumunu tamamlayın (üstten görünüm). (I) 21 günlük ve hasada hazır bitkiler (üstten görünüm). Kavanoz boyutu 147 mm yükseklik x 100 mm çap. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir büyüme odasında 0.5x Murashige ve Skoog orta agar plakaları üzerinde yüzeyde sterilize edilmiş fideler. (A) Arabidopsis thaliana (6 günlük), (B) Brachypodium distachyon (6 günlük), (C) Medicago truncatula (6 günlük), (D) A. thaliana (18 günlük). Agar plaka boyutu 120 mm x 120 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kısa ve uzun gün ışık koşullarında kavanozlarda yetiştirilen Arabidopsis thaliana Col-0 bitkileri. (A) Kısa gün koşullarında (10 saat aydınlık/14 saat karanlık, 220 μmol m-2 s-1 ışık yoğunluğu, 21 °C gündüz/18 °C gece) yetiştirilen 33 günlük üç bitki içeren kavanoz ve (B) uzun gün koşullarında (16 saat aydınlık/8 saat karanlık) yetiştirilen beş adet 21 günlük bitki içeren kavanoz, 150-160 μmol m-2 s-1 ışık yoğunluğu, 22 °C gündüz/18 °C gece). (C) bir kavanozdaki tüm bitkilerin ve (D) tek bitkilerin kök ağırlığı. ** t-testinin anlamlılık değerlerini temsil eder (p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Steril cam kavanoz sistemi kurulumunda 21. günde filogenetik olarak farklı beş tür. (A) Model monokot Brachypodium distachyon, (B) model baklagil Medicago truncatula, (C) dikot Solanum lycopersicum (domates), (D) dikot Sorgum bicolor, (E) monokot Triticum aestivum (buğday). (F) Cam kavanozlarda yetiştirilen türlerin köklerinin ve sürgünlerinin taze ağırlığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 günlük) kısa gün koşullarında yetiştirilir. (A) Steril bir kurulumda veya (B) 12 gün boyunca bir kommensal bakteri konsorsiyumu ile aşılanmıştır. (C) Büyüme substratının (solda) ve kökün (sağda) steril (kontrol) ve aşılanmış kavanozları için koloni oluşturan birimler. Steril kontrol koşulu için N = 4 kavanoz ve aşılanmış durum için n = 8 kavanoz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 21 günlük A. thaliana Col-0 için farklı kök eksüda profilleri. Eksüdalar, steril 20 mM amonyum asetat (pH 5.7) içinde 2 saat toplandı, ardından steril filtrelenmiş deiyonize suda 2 saat toplandı. Metabolitler, direkt enjeksiyon kullanılarak kütle spektrometresi ile tespit edildi. (A) Arka plan seviyesinin üzerinde tespit edilen 436 metabolitin temel bileşen analizi (bitkili kavanozların bitkisiz kavanozlarla karşılaştırılması). PC: açıklanan varyans miktarı ile ana bileşen. Mavi: su ile toplanan eksüdalar, sarı: amonyum asetat ile toplanan eksüdalar. (B) Üst sınıfa (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/) göre renklendirilmiş deney koşulları (Tukey testi) arasında önemli ölçüde farklı 416 metabolitin pasta grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tür | Tohum hazırlama | %70 etanolde geçen süre (dk) | Sodyum hipoklorit (NaClO) konsantrasyonu (h/h% ağartıcı) | Çamaşır suyunda geçen süre (dk) | ||
| Arabidopsis thaliana | 15 | Hiç kimse; % 100 etanol | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | Dehusk | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorgum bicolor* | Dehusk | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | Dehusk | 0.5 | 12 | 20 | ||
Tablo 1: Birden fazla tür için yüzey tohumu sterilizasyon yöntemleri. * Etanol ve ağartıcı arasında ve sonunda filtrelenmiş deiyonize su ile 4-5 kez yıkanır; ağartıcıdan sonra 3-6 saat inkübasyon, her 30 dakikada birfiltrelenmiş deiyonize su ile değiştirilir.
| Tür | Kavanozlara gün | Bitki sayısı |
| Brakhipodium distakyon | 4 ila 5 | 3 |
| Sorgum bicolor | 4 ila 5 | 3 |
| Triticum aestivum | 4 ila 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 ila 6 | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 ila 8 | 3 |
| Arabidopsis thaliana | 17 | 3 ila 5 |
Tablo 2: Fidanların kavanozlara transfer gün cinsinden yaşı ve çeşitli bitki türleri için kavanoz başına düşen bitki sayısı.
Discussion
Burada sunulan deneysel sistem, cam kavanozlara ve cam boncuklara dayanmaktadır ve bu nedenle, çeşitli bağlamlarda kök eksüdasyonunu incelemek için basit, az bakım gerektiren ve çok yönlü bir yarı hidroponik sistem sağlar. Farklı bitki türlerinin eksüdasyon profillerini25, eksüdasyonun farklı büyüme koşullarınatepkilerini 25 ve ayrıca toprak fizyokimyasal özelliklerinin eksüdasyonüzerindeki etkisini 22 araştıran çalışmalarda kullanılmıştır. Sistem, haftalardan aylara kadar değişen uzun büyüme dönemleri için burada test edilen tüm bitki türleri için uygundur. Steril koşulların korunması, analiz edilen 2 haftalık büyüme periyodu boyunca devam eden bakterilerle aşılama gibi basittir. Bu nedenle, deney sistemi sadece steril koşullarda kök eksüdalarının kontrollü bir şekilde toplanmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için de kullanılabilir. Ayrıca, bitki büyüme ortamı, farklı besin seviyelerine metabolik tepkileri incelemek için çeşitlendirilebilir ve büyüme süreleri, ışık koşullarına uyarlanarak veya farklı büyüklükteki kavanozlar kullanılarak ayarlanabilir.
Hidroponik veya yarı hidroponik koşullarda kök eksüdalarının incelenmesi, esas olarak düşük konsantrasyonlu metabolitlerin gelişmiş çözünürlüğü nedeniyle sahada standart olmaya devam etmektedir11. Birçok hidroponik yaklaşım, sterilite ve yüksek verime izin veren, ancak deneyleri yüksek nemli ortamlarda yetiştirilen küçük bitkiler veya fidelerle sınırlayanPetri kaplarına, çok kuyulu plakalara veya diğer küçük kaplara dayanır 17,18,26,27. Sunulan cam kavanoz kurulumunda, nispeten büyük kavanozlar tarafından yeterli kafa alanı sağlanır ve bu da uzun büyüme sürelerine izin verir. Mikro gözenekli bant şeritleri, steriliteyi korurken hava değişimini güvence altına alır. Böylece, arpa ve mısır gibi uzun monokotlar bile cam kavanoz kurulumunda birkaç hafta boyunca yetiştirilebilir. A. thaliana ve yonca gibi küçük bitkiler, vejetatif ve üreme aşamaları da dahil olmak üzere çimlenmeden sonra 4-5 hafta boyunca incelenebilir.
Daha büyük bitkiler için alternatif hidroponik kurulumlar da mevcuttur, ancak bunlar genellikle bitki desteği15,28,29,30 için ağ, köpük levhalar ve aşılama sepetlerinden yapılmış özel yapım kutular ve girişler gerektirir. Ek olarak, bu cihazlar genellikle steril olacak şekilde ayarlanmamıştır veya onları mikrobiyal ve/veya kimyasal kontaminasyonlardan uzak tutmak için zorlu kurulum ve bakım prosedürleri gerektirir. Sunulan deney sisteminde sterilitenin kurulumu ve bakımı basittir. Ek olarak, kavanozlar ve boncuklar için cam kullanımı, plastiklerden sızan kirleticilerin varlığını azaltır ve kolayca yıkanıp yeniden kullanılabildiği için kaynak tasarrufu sağlar.
Cam boncuklar daha önce toprak parçacıklarını taklit etmek için uygulanmıştır. Eksüdasyon tuzakları31 veya diğer yarı hidroponik sistemler19 gibi kök eksüdasyon örnekleme cihazlarında doğal kök gelişimini indüklerler. Cam kavanoz kurulumu bu gelişmeden yararlanır ve boncukları mikroplar için bir kolonizasyon yüzeyi olarak tanıtır. Toprakta, bitki köklerinin etrafındaki mikrobiyom, kompakt parçacıklar ve hava veya su ile dolu boşluklarla yarı katı bir ortamda gelişir. Cam kavanoz kurulumu, düşük sıvı fazın muhtemelen optimal oksijen seviyeleri içermemesi nedeniyle büyüme ortamının aktif olarak havalandırılmasını içermese de, daha büyük bir boncuk hacminin daha küçük bir büyüme ortamı hacmiyle kombinasyonu, mikropların oksik koşullar altında büyüyebileceği nemli ancak havalandırılmış bir üst faz oluşturur. Diğerleri, hidroponik büyüme sistemlerinde hava beslemesini sürdürmek için büyüme kaplarını26,28 sallamayı veya hava pompalarına19,29 bağlı borular kullanmayı önerdiler. Bununla birlikte, bu sistemler ya steril olmayacak şekilde ayarlanmıştır ya da steriliteyi korumak için özel malzeme ve sürekli gözetim gerektirir. Ek olarak, sallama durumunda, sürgünlerin büyüme çözeltilerine batırılmasını ve kök sistemlerine zarar vermesini önlemek için çok özen gösterin. Bununla birlikte, istenirse, sunulan deney düzeneği havalandırma için ek malzeme ile uyarlanabilir.
Metabolizmayı araştıran tüm bitki-mikrop etkileşimi çalışmalarında göz önünde bulundurulması gereken önemli bir husus, mikropların bitki kaynaklı bileşikleri parçalaması ve kendi başlarına metabolitler üretmesidir. Özel bir steril deney düzeneği olmadan, bitki ve mikrop kaynaklı metabolitler arasında ayrım yapmak mümkün değildir. Mikrobiyal aktiviteyi inhibe etmek ve bitki kaynaklı bileşikleri zenginleştirmek için, Oburger ve ark. bakteriyel bozunmayı engellemek için kök eksüda örnekleme solüsyonunu kimyasal olarak sterilize etmeyi önerdi32. Kimyasal inhibitörlerin etkisi, inhibitör ile veya inhibitör olmadan tedavi edilen steril ve steril olmayan bitkilerin eksüdasyon profillerini karşılaştırarak sunulan deneysel sistemde incelenebilir.
Sunulan cam kavanoz kurulumunun temel bir sınırlaması, büyüme koşullarının toprağa kıyasla çok yapay kalmasıdır. Toprakta yetiştirilen bitkilerden elde edilen eksüdalar genellikle ya süzülme sistemlerinden13 toplanır, burada çözücü akışlarının büyüme kaplarının tabanında toplandığı veya bitkilerin başlangıçta toprakta yetiştirildiği ve daha sonra hidroponik koşullara aktarıldığı toprak-hidroponik hibrit sistemlerdir 16,33. Cam kavanoz kurulumunun aksine, bu prosedürler genellikle yıkıcıdır ve değişen büyüme ortamlarında zaman içinde birden fazla toplamaya izin vermez. Ayrıca, süzülen sistemlerde toprak zemini eksüdalarla birlikte örneklenirken, toprak-hidroponik hibrit sistemlerde eksüda toplama için hidroponik koşullara geçiş ile yüksek toprak metabolik arka planı sorunu aşılır. Yaralı kökler11 yoluyla metabolit sızıntısını azaltmak için iyileşme süreleri uygulanmış olsa da, bitki transferi çok bozucudur ve yaraların devam etmesi muhtemeldir ve bitki metabolizması hidroponik koşullara geçişe yanıt olarak değişebilir. Ayrıca, birçok durumda, bitkilerin uygun bir büyüme çözeltisi yerine suya aktarılmasıyla ozmotik bir şok indüklenir16,33. Sunulan protokolde, büyüme çözeltisi, ozmotik dengeyi korumak için eşmolar bir çözelti ile değiştirilir ve yine de kısa, tanımlanmış bir zaman penceresi içinde eksüdasyonu yakalamaya izin verir. Büyüme çözeltisinin değiştirilmesi, yayınlanmış birçok çalışmada yaygın bir uygulamadır ve hidroponik kurulumlarda kök yarası olmadan kolayca elde edilebilir 12,16,26,34. Çok yönlülüğü nedeniyle, sunulan deneysel sistem, örneğin katı toprak parçacıkları olsun veya olmasın bir büyüme çözeltisi olarak steril veya steril olmayan toprak özü kullanılarak daha doğal koşulları taklit edecek şekilde kolayca uyarlanabilir. Doğal koşullara doğru kademeli değişim, farklı fizyokimyasal toprak özelliklerinin ve mikrobiyal varlığın bitki metabolizması ve fizyolojisi üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. Bilimsel topluluk, çeşitli ortamlarda eksüdasyonu iyi bir şekilde anlamadan önce, her iki kurulumun da avantajları ve sınırlamaları olduğundan, toprak bazlı ve hidroponik sistemlerin paralel olarak kullanılması arzu edilir13.
Sonuç olarak, sunulan yarı hidroponik, cam tabanlı deney düzeneği, yüksek çok yönlülük ile birleşen basitliği nedeniyle öne çıkmaktadır. Steril koşullarda veya mikroplar ve bitki-mikrop etkileşimleri ile kombinasyon halinde eksüdasyonu toplamak ve incelemek için erişilebilir, düşük maliyetli bir yol sunar.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
İsviçre'nin ETH Zürih kentinden Prof. Dr. Nicola Zamboni ve Prof. Dr. Uwe Sauer'e direkt enjeksiyon ile kök eksüdasyon profillerini belirledikleri için ve Basel Üniversitesi'nden Prof. Dr. Klaus Schläppi'ye A. thaliana kommensal bakterisi için teşekkür ederiz. Ayrıca, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'nı (S.M., A.S., E.M.S.'yi destekleyen J.S.'ye PR00P3_185831) ve PSC-Syngenta Burs programını (Prof. Dr. Klaus Schläppi ve J.S.'ye verilen, C.J.'yi destekleyen) kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
| Aluminum foil | FORA GmbH | ||
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
| Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
| Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
| Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
| Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
References
- Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
- Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738 (2018).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
- Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
- Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
- Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
- Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286 (2023).
- O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473 (2022).
- Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
- Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
- Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
- Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
- Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170 (2018).
- Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25 (2022).
- Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
- Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207 (2020).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033 (2016).
- McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649 (2023).
- Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955 (2017).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606 (2018).
- Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
- Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
- Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498 (2012).
- Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577 (2020).
