Summary
Vi presenterar ett protokoll för ett glasbaserat, semihydroponiskt experimentellt system som stödjer tillväxten av en mängd fylogenetiskt distinkta växter med eller utan mikrober. Systemet är kompatibelt med olika odlingssubstrat och tillåter icke-destruktiv rotexsudatprovtagning för nedströmsanalys.
Abstract
Rotexsudat formar gränsytan mellan växt och jord, är involverade i näringscykeln och modulerar interaktioner med markorganismer. Rotexsudat är dynamiska och formas av biologiska, miljömässiga och experimentella förhållanden. På grund av deras stora mångfald och låga koncentrationer är det svårt att fastställa exakta exsudatprofiler, särskilt i naturliga miljöer där andra organismer är närvarande, som omsätter växtbaserade föreningar och själva producerar ytterligare föreningar. Det semihydroponiska experimentsystemet för glasburkar som introduceras här möjliggör kontroll över biologiska, miljömässiga och experimentella faktorer. Det tillåter tillväxt av olika fylogenetiskt distinkta växtarter i upp till flera månader med eller utan mikrober, i en mängd olika odlingsmedier. Den glasbaserade designen erbjuder en låg metabolitbakgrund för hög känslighet och låg miljöpåverkan eftersom den kan återanvändas. Exsudat kan samplas icke-destruktivt, och förhållandena kan ändras under loppet av ett experiment om så önskas. Installationen är kompatibel med masspektrometrianalys och andra nedströms analytiska procedurer. Sammanfattningsvis presenterar vi ett mångsidigt tillväxtsystem som lämpar sig för känslig rotexsudatanalys under en mängd olika förhållanden.
Introduction
I tätbefolkade jordar utgör rhizosfären en kolrik nisch. Den formas av växtrötter via utsöndring av upp till 20 % av assimilerat kol och hyser mikrobiella samhällen som skiljer sig från det inhemska jordmikrobiomet 1,2,3,4,5,6. I takt med att forskare utnyttjar de fördelaktiga funktionerna hos rotassocierade mikrober och den potential för hållbart jordbruk som följer med det7, har denna observation, ofta kallad rhizosfäreffekten, varit i fokus för växande vetenskapliga ansträngningar. Än så länge är dock den kemiska dialogen mellan mikroorganismer och växter, som föreslås vara drivkraften bakom rhizosfäreffekten, fortfarande dåligt förstådd och därför är den mekanistiska förståelsen för utvecklingen av tillförlitliga mikrobiella lösningar inom jordbruket begränsad 8,9,10.
Att dechiffrera rotexsudat i markmiljöer där metaboliter lätt absorberas av jordpartiklar och snabbt omsätts av mikrobiella samhällen är inte okomplicerat, särskilt inte för växtarter med fina rotsystem som modellväxten Arabidopsis thaliana11. Det är därför som rotexsudat i de flesta studier provtas från hydroponiska system. I dessa mikrokosmos hålls luftiga delar av växter på plats av skräddarsydda växthållare eller mer lågmälda material som nät, agar och glaspärlor. Behållarna som används sträcker sig från petriskålar över flerbrunnsplattor till olika anpassade och kommersiella lådor med eller utan luftningsfilter 12,13,14,15,16,17,18,19. Beroende på systemet kommer växternas tillväxtförhållanden att variera mycket och återspegla naturliga förhållanden i större eller mindre utsträckning.
Här presenterar vi ett glasbaserat, semihydroponiskt system som är experimentellt mottagligt och ger mycket reproducerbara resultat. Den är enkel att montera och använda och är baserad på allmänt tillgängliga material. Systemet är baserat på en glasburk fylld med glaspärlor, som drar nytta av glasvarornas återanvändbara karaktär och lågbindande egenskaper (figur 1). Pärlorna ger fysiskt stöd för den växande växten och simulerar mekanisk impedans, vilket bidrar till en mer jordliknande rotarkitektur jämfört med hydroponiska uppställningar 19,20,21. Om glaspärlorna inokuleras med mikrober utgör de ytor som bakterier kan fästa på.
Glasburken kan stängas för att bibehålla steriliteten och systemet är utformat för att ge tillräckligt med utrymme för huvudet och luftcirkulationen, vilket undviker en miljö mättad i fukt. Burkarna är lämpliga för långvarig tillväxt av olika växtarter och kan skalas upp och ner med hjälp av burkar i olika storlekar. Här visas tillämpningar för sex växtarter, som täcker C3- och C4-gräs, dikoter och baljväxter. Bland dem finns modellarterna A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monocot), Medicago truncatula (baljväxter), samt grödor som Solanum lycopersicum (tomat, dicot), Triticum aestivum (vete, C3 monocot) och Sorghum bicolor (sorghum, C4 monocot). Protokollet som presenteras inkluderar experimentell uppställning av systemet, frösterilisering och groning av sex växtarter, transplantation av plantor till burkar, olika odlingsmedier, mikrobinokulering, rotexsudatprovtagning och exsudatbearbetning för analys.
Protocol
1. Beredning av plantor: Ytsterilisering av frön
OBS: Ytsterilisering av frön och alla följande steg måste utföras under sterila förhållanden om inget annat anges. Steg 1.1 till 1.4 är specifika för ytsterilisering av A. thaliana-frön . Andra växtarter har alternativa variationer i rörstorlek (beroende på antal frön och fröstorlek), tid i lösningar och steriliseringslösningar (tabell 1).
- Tillsätt fröna i ett mikrocentrifugrör (max 20 mg frön) och täck fröna med 70 % etanol.
VARNING: Etanol är brandfarligt. Använd inte nära öppen låga. - Flytta de stängda mikrocentrifugrören till en shaker i 15 minuter och ställ in rotationen så att fröna skakas försiktigt.
- Ta försiktigt bort 70 % etanol med en pipett och ersätt den med 100 % etanol. Upprepa steg 1.2.
- Ta bort 100 % etanol och torka fröna genom att lämna mikrocentrifugrörets lock öppna i ett sterilt luftflöde.
- När fröna är torra, sprid ut dem jämnt på 0,5x Murashige och Skoog (MS) medium med 0,7 % fytoagar genom att snärta till röret eller använda en steril pincett. Stäng agarplattorna och försegla dem med 1,25 cm mikroportejp.
- Placera plattorna horisontellt på en hylla i odlingskammaren (16 timmar ljus/8 timmar mörkt, 22 °C dag/18 °C natt, 150-160 μmol m-2 s-1).
2. Beredning av plantor: Överföring av grodda frön till färska tallrikar
OBS: Följande steg är specifika för A. thaliana och behövs inte för andra arter.
- Efter groning, överför 5 till 6 plantor till nya 0,7 % fytoagarplattor med 0,5 x MS-medium genom att placera plantorna linjärt, cirka 3 cm från toppen (se rosettens position i figur 2D).
- Försegla agarplattorna med 1,25 cm mikroportejp och odla vertikalt i odlingskammaren (Figur 2D) tills plantorna är redo att överföras till burkar 15-18 dagar efter groning (tabell 2).
3. Förberedelse av hydroponiskt system: Burkinställning
- Tillsätt 150 ml rena 5 mm glaspärlor i varje ren burk och stäng med locket (Figur 1A).
OBS: I detta protokoll är 5 mm glaspärlor lämpliga för de flesta arter22, men pärlstorleken kan justeras om så önskas. - Placera tillräckligt med aluminiumfolie över de stängda burkarna för att täcka korsningen mellan lock och burk och autoklav (121 °C i 20 minuter) (Figur 1B).
- Håll de förberedda burkarna täckta tills plantorna är redo att överföras (tabell 2).
4. Beredning av hydroponiskt system: Tillsats av plantor
- När plantorna är redo att överföras till burkar (tabell 2), ta bort aluminiumfolien och locken på burkarna i den sterila bänken.
- Om burkarna ska inokuleras med bakterier, utför följande steg innan du går vidare till steg 4.3; Annars hoppar du över steg 4.2.
- Använd en steril inokuleringsslinga för att plocka enstaka kolonier från rena bakteriekulturer på agarplattor och suspendera dem i 750 μl steril 10 mM MgCl2. Upprepa tills lösningen är grumlig.
- Valfritt: Tvätta suspensionen 3 gånger med 750 μl steril 10 mM MgCl2 x 5 min centrifugering vid 1 000 × g och rumstemperatur följt av avlägsnande av supernatanten och återsuspension av pelleten i 750 μl 10 mM MgCl2.
- Frivilligt: Om flera olika bakteriearter inokuleras, blanda suspensionerna av enskilda stammar som beretts i steg 4.2.1–4.2.2 i lika stora proportioner innan du fortsätter.
- Justera den optiska densiteten vid våglängd 600 nm (OD600) till 0.2-0.4 i 0.5x MS-medium (pH 5.7 till 5.9, justerat med KOH) eller annat valfritt odlingsmedium (se steg 4.3). Mät OD600 igen för att kontrollera om lösningen har spätts korrekt.
VARNING: KOH är frätande; Använd handskar och labbrock. - Späd suspensionen ytterligare till OD600 0,002-0,004 i samma medium (1:100 spädning).
OBS: Den slutliga celltätheten beror på vilken bakteriestam som används, men enligt vår erfarenhet motsvarar detta inokulum cirka 3-6 × 105 celler ml-1. - Tillsätt 35 ml av den slutliga spädningen per burk. Tillsätt 35 ml sterilt odlingsmedium för att kontrollera burkarna. Rör om pärlorna så att de täcks jämnt med 0,5 x MS-media innan plantan överförs så att rötterna inte torkar. Gå vidare till steg 4.4.
- Tillsätt 35 ml 0,5 x MS-medium i varje burk (pH 5,7 till 5,9, justera med KOH). Rör om pärlorna så att de täcker jämnt med 0,5 x MS-media innan du överför plantan så att rötterna inte torkar.
OBS: Odlingsmediet kan modifieras, till exempel genom avlägsnande av näringsämnen, tillsats av osmolyter för att inducera saltstress eller användning av olika pH-värden eller odlingsmedier. VARNING: KOH är frätande; Använd handskar och labbrock. - Lägg 3-5 A. thaliana-plantor i en burk genom att placera rotsystemen mellan glaspärlorna.
OBS: Antalet plantor per burk är annorlunda för andra arter (tabell 2). - Flytta runt pärlorna med steril pincett eller sked för att täcka rötterna och lyfta ut bladen ur mediet (Figur 1C).
OBS: Flytta försiktigt växterna och pärlorna för att undvika att bryta rötterna och stressa växterna. - Lägg 2 remsor 1.25 cm mikroportejp över toppen av burkarna och lägg försiktigt locket ovanpå (Figur 1D-F).
OBS: Tryck inte ner locket för att undvika att hindra luftväxlingen. - Täck springan mellan locket och burken med 2,5 cm mikroportejp för att bibehålla steriliteten samtidigt som luftväxlingen tillåts, och placera burkarna i en tillväxtkammare (Figur 1G,H).
- Ställ in 4-8 burkar per experimentbetingelse, beroende på den biologiska frågeställningen och den förväntade variabiliteten.
- Se till att inkludera biologiska negativa kontroller (t.ex. burkar utan växter) för att ta hänsyn till metabolitbakgrunden i det experimentella systemet. Ställ in samma antal replikat för negativa kontroller som för experimentella behandlingar (t.ex. fyrbenta kontroller).
- För längre tillväxtperioder, byt ut odlingsmediet varje vecka: ta bort resten av odlingsmediet med en 25 ml volymetrisk pipett och tillsätt 35 ml färskt medium.
5. Insamling av rotexsudat
- När plantorna når önskad ålder tar du bort den 2,5 cm långa mikroportejpen och locket i den sterila bänken.
OBS: För A. thaliana under våra tillväxtförhållanden representerar 21 dagar efter groning ett moget vegetativt stadium innan blomningen börjar. Det vegetativa utvecklingsstadiet är specifikt för växtarten, och tidpunkten för tillväxtperioden ändras med växtarten; Denna tidpunkt kan ändras beroende på forskningsfrågan. - För sterilitetstestning, alikvot 20 μL odlingsmedium och pipett på LB-agarplattor.
- För inokulerade burkar, alikvot 100 μl odlingsmedium att användas för räkning av kolonibildande enheter (CFU) (t.ex. i spädningsserie23).
OBS: Enligt vår erfarenhet varierar bakterietätheten inom 105-10 8 levande celler ml-1 av tillväxtmediet.
- För inokulerade burkar, alikvot 100 μl odlingsmedium att användas för räkning av kolonibildande enheter (CFU) (t.ex. i spädningsserie23).
- Ta bort så mycket odlingsmedium som möjligt med en 25 ml volymetrisk pipett och undvik skador på rötterna.
- Tillsätt 50 ml uppsamlingsmedium (t.ex. 20 mM ammoniumacetat; pH 5,7-5,9 justerat med HCl) genom att pipettera längs burkens väggar för att undvika att bladen blir blöta. Stäng burkarna med lock och inkubera dem under sterila förhållanden under önskad tid för uppsamling av sårvätska. För tidskänsliga experiment är 2 h ett bra insamlingsfönster.
VARNING: HCl är frätande; Använd handskar och labbrock. För längre uppsamlingstider för rotexsudat, linda in locken igen med tejp och flytta burkarna till tillväxtkammaren. - Efter 2 timmar avlägsnas önskad mängd uppsamlingsmedia i rör (t.ex. 50 ml för analyser eller analyser med koncentrerade exsudat, eller 2 ml för direkt användning). Förvara de uppsamlade rotexsudaten vid -80 °C tills vidare bearbetning eller analys.
- Vid arbete med inokulerade burkar, centrifugera de uppsamlade exsudaten i 10 minuter vid 5 000 × g och 4 °C och använd endast supernatanter för analysen. Alternativt kan exsudaten filtreras med ett 0,22 μm eller 0,45 μm filter.
- Om experimentet är en del av en tidsserie, ta bort allt återstående uppsamlingsmedium från burkarna och tillsätt 35 ml 0,5 x MS-medium. Sätt tillbaka locket och 2,5 cm tejp innan du sätter tillbaka burkarna i tillväxtkammaren.
- Mät roten och skjut färsk vikt av alla plantor i en burk för att senare normalisera rotexsudat efter plantvikt.
OBS: Växtvävnader kan provtas dessutom om så önskas.
6. Bearbetning av rotexsudat för masspektrometri
- Beroende på analysmetod frystorkas rotexsudaten för att koncentrera och avlägsna uppsamlingsmediet (-80 °C vid 0,37 mbar tills det inte finns någon vätska). Förvaras vid -80 °C tills analysklart.
OBS: Data som presenteras här genererades med flödesinjektion TOF-MS-analys på ett instrument för exakt massa kvadrupol time-of-flight. - Före injektion i analysinstrumentet bereds frystorkade exsudat eller obearbetade rotexsudat späds ut med uppsamlingsmedium i enlighet med rotens färskvikt.
OBS: Insamlingsmediet valdes för att vara kompatibelt med masspektrometern. Beroende på analysmetod kan dock avsaltningssteg vara nödvändiga före injektionen.
Representative Results
Det experimentella systemet som introduceras här gör det möjligt att kontrollera experimentella och miljömässiga faktorer som förändrar rotexsudationsprofiler. Vi jämförde A. thaliana-tillväxt under olika ljusförhållanden, växtålder och plantdensitet i två olika laboratorier (Figur 3). Plantorna såg friska ut i alla laboratorier (figur 3A,B). Korta dagsförhållanden (10 timmar ljus jämfört med 16 timmar ljus, figur 3) resulterade i högre rotmassa jämfört med långa dagar (Figur 3C,D). På samma sätt var den totala rotmassan för alla växter som odlades under långa dagar mindre än under korta dagar (Figur 3C). Sammantaget var variationen i tillväxt inom och mellan burkar låg mellan laboratorierna.
Glasburkssystemet är kompatibelt med en mängd olika växtarter och utvecklingsstadier. Slutpunkten för analys av rotexsudat är vanligtvis 21 dagar, eftersom många växtarter under våra experimentella förhållanden befinner sig i ett moget vegetativt stadium innan de övergår till reproduktionsstadiet (Figur 4A-E). Växter kan enkelt tas bort från det experimentella systemet utan synliga skador på rotsystemet. Således är det enkelt att bestämma vävnadsvikter eller använda vävnader för nedströmsanalys. De högsta skottvikterna hittades för vete, följt av durra och tomat. De högsta rotvikterna återfanns för durra, följt av vete och M. truncatula. Förhållandet mellan rot och skott skiljer sig åt mellan olika arter. Sammantaget varierade vävnadsvikterna mellan 100 mg och 800 mg.
En central aspekt av experimentella system som möjliggör insamling av rotexsudat är kontrollerad inokulering med mikrober för att studera interaktioner mellan växter och mikrober i en definierad miljö. Det experimentella system som presenteras kan hållas sterilt även vid upprepad manipulation (se "kontroll"-betingelsen i figur 5), och bakterier kan tillsättas och bibehållas under längre perioder. När 33 dagar gamla A. thaliana-plantor inokulerades med en blandning av kommensala bakterier vid OD600 0,004, kvarstod bakterierna i 12 dagar, vilket var hela experimentets varaktighet (Figur 5). Kolonibildande enheter ökade till och med 100 gånger i odlingsmediet och koloniserade även rötterna (Figur 5C). Fenotyperna hos inokulerade växter gick inte att skilja från dem hos sterila växter (figur 5A,B).
Det presenterade experimentella systemet möjliggör insamling av exsudat under många experimentella förhållanden. Här presenterar vi utsöndringsprofiler av A. thaliana Col-0 som samlats in antingen i ammoniumacetat eller i vatten från samma växter i följd (Figur 6A). Exsudat förvarades vid -80 °C fram till analys, normaliserades efter rotvikt och analyserades med masspektrometri. Prover av burkar som innehöll växter filtrerades mot experimentella kontroller (burkar utan växter). Av 2 163 metaboliter uppvisade 436 en signal över bakgrunden (20,16 %) och behölls för analys. Av dessa uppvisade 416 eller 95 % av föreningarna en distinkt förekomst mellan de experimentella betingelserna. 26 metaboliter kunde dock inte hänföras till någon form av förening och är därför inte definierade. De flesta metaboliter (406 eller 98 %) var vanligare i vattenuppsamlade exsudat. Den på varandra följande samlingen av exsudat först i ammoniumacetat och senare i vatten kan påverka utsöndringsprofilen, eftersom metaboliska signaler kan spädas ut med tiden. Den nästan uteslutande högre utsöndringssignalen i vatten som samlats in som en andra tidpunkt stöder dock inte denna hypotes: Exsudatuppsamling i rent vatten skapar sannolikt en osmotisk chock för växter, vilket orsakar den ökade mängden metaboliter jämfört med ett uppsamlingslösningsmedel som är ekvimolärt med tillväxtlösningen (20 mM ammoniumacetat är ekvimolärt med 0,5 gånger MS-medium). Undersökning av kemiska klasser av identifierade föreningar för båda tillväxtbetingelserna visade att majoriteten av föreningarna är organiska syror och derivat (28,6 %) följt av organiska syreföreningar (18 %), organoheterocykliska föreningar (14,2 %) och lipider (13,2 %). Endast en liten undergrupp av metaboliter tillhör fenylpropanoider och polyketider (8,7 %) och bensenoider (6 %). Organiska kväveföreningar, nukleosider, svavelorganiska föreningar, alkaloider, lignaner och besläktade föreningar utgör mellan 2 % och 0,5 % av de klassificerade föreningarna (figur 6B). Fördelningen av metaboliter som avbildas här motsvarar redan publicerade data med hjälp av andra typer av insamlingssystem för rotexsudat24.
Figur 1: Inställning av glasburk. (A) Burk med glaspärlor. (B) Burk med glaspärlor redo att autoklaveras. (C) Plantor i burkar (ovanifrån). (D) Plantor i burk (ovanifrån) med 1,25 cm mikroportejp. (E) Plantor i burkar (sedd från sidan) med 1,25 cm mikroportejp. (F) Plantor i burkar (sedd från sidan) med 1,25 cm mikroportejp och lock. (G) Komplett burkuppsättning med plantor i burkar (sidovy) med 1,25 cm mikroportejp, lock och 2,5 cm mikroportejp. (H) Slutför installationen av burken (överst view). (I) Plantor som är 21 dagar gamla och redo för skörd (ovanifrån). Burkens storlek 147 mm höjd x 100 mm diameter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ytsteriliserade plantor på 0,5x Murashige och Skoog medium agarplattor i en tillväxtkammare. A) Arabidopsis thaliana (6 dagar gammal), B) Brachypodium distachyon (6 dagar gammal), C) Medicago truncatula (6 dagar gammal), D ) A. thaliana (18 dagar gammal). Agarplattans storlek 120 mm x 120 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Arabidopsis thaliana Col-0-växter som odlas i burkar under korta och långa ljusförhållanden. A) Burk med tre 33 dagar gamla plantor som odlats under korta dagsförhållanden (10 timmar ljus/14 timmar mörkt, 220 μmol m-2 S-1 ljusintensitet, 21 °C dag/18 °C natt) och B) Burk med fem 21 dagar gamla plantor som odlats under långa dagar (16 timmar ljus/8 timmar mörkt, 150–160 μmol m-2 s-1 ljusintensitet, 22 °C dag/18 °C natt). Rotvikten för (C) alla plantor i en burk och (D) för enskilda plantor. ** representerar signifikansvärden för t-test (p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fem fylogenetiskt distinkta arter på dag 21 i det sterila glasburkssystemet. (A) Modell monocot Brachypodium distachyon, (B) modell baljväxt Medicago truncatula, (C) dikot Solanum lycopersicum (tomat), (D) dicot Sorghum bicolor, (E) monocot Triticum aestivum (vete). F) Färskvikt av rötter och skott av arten som odlats i glasburkar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 dagar gammal) odlad under korta dagar. A) I steril form eller B) inokulerad i 12 dagar med ett konsortium av kommensala bakterier. C) Kolonibildande enheter för sterila (kontroll) och inokulerade burkar av tillväxtsubstratet (vänster) och roten (höger). N = 4 burkar för steril kontroll och n = 8 burkar för inokulerat tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Distinkta rotexsudatprofiler för 21 dagar gamla A. thaliana Col-0. Exsudat samlades in under 2 timmar i sterilt 20 mM ammoniumacetat (pH 5,7) följt av 2 timmars uppsamling i sterilt filtrerat avjoniserat vatten. Metaboliter detekterades med masspektrometri med direktinjektion. A) Principalkomponentanalys av 436 metaboliter som påvisats över bakgrundsnivån (jämförelse av burkar med växter med burkar utan växter). PC: huvudkomponent med variansen förklarad. Blå: vattenuppsamlade exsudat, gul: ammoniumacetatuppsamlade exsudat. (B) Cirkeldiagram med 416 metaboliter som skiljer sig signifikant mellan försöksbetingelserna (Tukey-test) färgade enligt superklassen (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Art | Beredning av utsäde | Tid i 70% etanol (min) | Koncentration av natriumhypoklorit (NaClO) (v/v % blekmedel) | Tid i blekmedel (min) | ||
| Arabidopsis thaliana | 15 | Ingen; 100% etanol | 15 | |||
| Brachypodium distachyon* | Skal | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorghum bicolor* | Skal | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | Skal | 0.5 | 12 | 20 | ||
Tabell 1: Metoder för sterilisering av ytfrö för flera arter. *Tvättas 4-5 gånger med filtrerat avjoniserat vatten mellan etanol och blekmedel och i slutet; Eninkubation i 3-6 timmar efter blekmedel, ersätts med filtrerat avjoniserat vatten var 30:e minut.
| Art | Dag till burkar | Antal anläggningar |
| Brachypodium distachyon | 4 till 5 | 3 |
| Sorghum bicolor | 4 till 5 | 3 |
| Triticum aestivum | 4 till 5 | 2 |
| Medicago truncatula | 5 till 6 | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 till 8 | 3 |
| Arabidopsis thaliana | 17 | 3 till 5 |
Tabell 2: Plantornas ålder i dagar för överföring till burkar och antal plantor per burk för olika växtarter.
Discussion
Det experimentella systemet som presenteras här är baserat på glasburkar och glaspärlor och ger därmed ett enkelt, lättskött och mångsidigt semihydroponiskt system för att studera rotutsöndring i olika sammanhang. Det har använts i studier som undersökt utsöndringsprofilerna hos olika växtarter25, utsöndringens respons på olika tillväxtförhållanden25, samt inverkan av markens fysiokemiska egenskaper på utsöndring22. Systemet är lämpligt för alla växtarter som testas här under längre tillväxtperioder, från veckor till månader. Upprätthållandet av sterila förhållanden är enkelt, liksom inokuleringen med bakterier, som kvarstår under den analyserade 2-veckors tillväxtperioden. Således möjliggör det experimentella systemet inte bara en kontrollerad insamling av rotexsudat under sterila förhållanden, utan det kan också användas för att studera interaktioner mellan växter och mikrober. Dessutom kan växternas odlingsmedier varieras för att studera metaboliska svar på olika näringsnivåer, och tillväxtperioderna kan justeras genom att anpassa ljusförhållandena eller använda burkar av olika storlek.
Studier av rotexsudat under hydroponiska eller semihydroponiska förhållanden är fortfarande standard inom området, främst på grund av den förbättrade upplösningen av lågkoncentrerade metaboliter11. Många hydroponiska metoder förlitar sig på petriskålar, flerbrunnsplattor eller andra små behållare som möjliggör sterilitet och hög genomströmning men begränsar experimenten till små växter eller plantor som odlas i miljöer med hög luftfuktighet 17,18,26,27. I den presenterade glasburksuppsättningen tillhandahålls tillräckligt med huvudutrymme av de jämförbart stora burkarna, vilket möjliggör förlängda tillväxtperioder. Mikroportejpremsor säkerställer luftväxling samtidigt som steriliteten bibehålls. På så sätt kan även höga monocots som korn och majs odlas i glasburken i flera veckor. Små växter som A. thaliana och klöver kan studeras i 4-5 veckor efter groning, inklusive vegetativa och reproduktiva stadier.
Alternativa hydroponiska uppställningar finns också tillgängliga för större anläggningar, men dessa kräver ofta skräddarsydda lådor och inlopp gjorda av nät, skumskivor och ingreppskorgar för växtstöd 15,28,29,30. Dessutom är dessa enheter vanligtvis inte inställda för att vara sterila, eller så kräver de utmanande installations- och underhållsprocedurer för att hålla dem fria från mikrobiella och/eller kemiska föroreningar. Installation och underhåll av sterilitet i det presenterade experimentella systemet är okomplicerat. Dessutom minskar användningen av glas för burkar och pärlor förekomsten av föroreningar som läcker ut från plast och sparar resurser eftersom det enkelt kan tvättas och återanvändas.
Glaspärlor har tidigare använts för att efterlikna jordpartiklar. De inducerar naturlig rotutveckling i rotutsöndringsprovtagningsanordningar såsom exsudationsfällor31 eller andra semihydroponiska system19. Glasburken drar nytta av denna utveckling och introducerar pärlorna som en koloniseringsyta för mikrober. I jord utvecklas mikrobiomet runt växtrötter i en halvfast miljö, med kompakta partiklar och utrymmen fyllda med luft eller vatten. Även om glasburken inte inkluderar aktiv luftning av odlingsmediet, vilket gör att den nedre vätskefasen sannolikt inte innehåller optimala syrenivåer, skapar kombinationen av en större pärlvolym med en mindre volym av tillväxtmediet en fuktig men ändå luftig övre fas där mikrober kan växa under oxiska förhållanden. Andra har föreslagit att skaka tillväxtbehållare26,28 eller använda slangar kopplade till luftpumpar19,29 för att upprätthålla lufttillförseln i hydroponiska tillväxtsystem. Dessa system är dock antingen inställda på att inte vara sterila eller kräver specialmaterial och konstant övervakning för att upprätthålla steriliteten. Dessutom, vid skakning, var mycket försiktig för att undvika att skott dränks i tillväxtlösningar och skador på rotsystemen. Icke desto mindre, om så önskas, kan den experimentella uppställningen anpassas med ytterligare material för luftning.
En viktig aspekt att ta hänsyn till i alla studier av växt-mikrobinteraktion som undersöker metabolism är att mikrober bryter ner växtbaserade föreningar och producerar metaboliter på egen hand. Utan en specialiserad steril experimentuppställning är det inte möjligt att skilja mellan växt- och mikrobbaserade metaboliter. För att hämma mikrobiell aktivitet och berika växtbaserade föreningar föreslog Oburger et al. att kemiskt sterilisera rotexsudatprovtagningslösningen för att hämma bakteriell nedbrytning32. Effekten av kemiska inhibitorer kunde studeras i det presenterade experimentella systemet, där man jämförde exsudationsprofiler för sterila kontra icke-sterila växter som behandlats med eller utan inhibitor.
En huvudsaklig begränsning med den presenterade glasburksuppsättningen är att tillväxtförhållandena förblir mycket artificiella jämfört med jord. Exsudat från jordodlade växter samlas ofta antingen in från perkolationssystem13, där lösningsmedelsflöden samlas upp vid basen av tillväxtbehållare, eller jord-hydroponiska hybridsystem, där växter initialt odlas i jord och sedan överförs till hydroponiska förhållanden16,33. Till skillnad från glasburkar är dessa procedurer vanligtvis destruktiva och tillåter inte flera insamlingar över tid i föränderliga tillväxtmiljöer. I perkolerande system provtas dessutom jordbakgrunden tillsammans med exsudat, medan man i jord-hydroponiska hybridsystem kringgår problemet med hög metabolisk bakgrund i jorden genom att övergå till hydroponiska förhållanden för uppsamling av exsudat. Även om återhämtningstider har implementerats för att minska metabolitläckage via skadade rötter11, är växtöverföringen mycket störande och sår kommer sannolikt att kvarstå, och växtmetabolismen kan förändras som svar på överföring till hydroponiska förhållanden. Dessutom induceras i många fall en osmotisk chock genom att växter överförs till vatten i stället för en lämplig tillväxtlösning16,33. I det presenterade protokollet byts tillväxtlösningen ut mot en ekvimolär lösning för att upprätthålla osmotisk balans, vilket fortfarande gör det möjligt att fånga upp utsöndring inom ett kort, definierat tidsfönster. Byte av tillväxtlösning är vanlig praxis i många publicerade studier och kan enkelt uppnås i hydroponiska uppställningar utan rotskador 12,16,26,34. På grund av sin mångsidighet kan det experimentella systemet som presenteras enkelt anpassas för att efterlikna mer naturliga förhållanden, till exempel genom att använda sterilt eller icke-sterilt jordextrakt som en tillväxtlösning med eller utan närvaro av fasta jordpartiklar. Den gradvisa förändringen mot naturliga förhållanden gör det möjligt att studera effekterna av de olika fysiokemiska markegenskaperna och den mikrobiella närvaron på växternas metabolism och fysiologi. Innan forskarsamhället har en god förståelse för utsöndring i olika miljöer är det önskvärt att använda jordbaserade och hydroponiska system parallellt, eftersom båda uppställningarna har sina fördelar och begränsningar13.
Sammanfattningsvis sticker den presenterade semihydroponiska, glasbaserade experimentella uppställningen ut på grund av sin enkelhet i kombination med hög mångsidighet av applikationer. Det presenterar ett lättillgängligt, billigt sätt att samla in och studera utsöndring under sterila förhållanden, eller i kombination med mikrober och växt-mikrobinteraktioner.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Dr. Nicola Zamboni och Prof. Dr. Uwe Sauer från ETH Zürich, Schweiz, för bestämning av rotutsöndringsprofilerna med direktinjektion och Prof. Dr. Klaus Schläppi från universitetet i Basel för A. thaliana kommensala bakterier. Vidare erkänner vi Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 till J.S., som stöder S.M., A.S., E.M.S.) och PSC-Syngenta Fellowship-programmet (beviljat till Prof. Dr. Klaus Schläppi och J.S., som stöder C.J.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
| Aluminum foil | FORA GmbH | ||
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
| Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
| Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
| Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
| Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
References
- Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
- Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738 (2018).
- Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
- Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
- Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
- Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
- Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286 (2023).
- O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473 (2022).
- Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
- Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
- Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
- Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
- Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170 (2018).
- Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25 (2022).
- Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
- Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207 (2020).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033 (2016).
- McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649 (2023).
- Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955 (2017).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606 (2018).
- Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
- Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
- Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498 (2012).
- Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577 (2020).
