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Biology

सेमीहाइड्रोपोनिक रूट एक्सयूडेट प्रोफाइलिंग के लिए एक बहुमुखी ग्लास जार सिस्टम

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/66070
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Institute of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 2Department of Environmental Sciences, University of Basel

Summary

हम एक ग्लास-आधारित, अर्ध-हाइड्रोपोनिक प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो रोगाणुओं के साथ या बिना विभिन्न प्रकार के फ़ाइलोजेनेटिक रूप से अलग-अलग पौधों के विकास का समर्थन करता है। प्रणाली विभिन्न विकास मीडिया के साथ संगत है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए गैर-विनाशकारी रूट एक्सयूडेट नमूनाकरण की अनुमति देती है।

Abstract

रूट एक्सयूडेट्स पौधे-मिट्टी के इंटरफेस को आकार देते हैं, पोषक तत्वों के चक्रण में शामिल होते हैं और मिट्टी के जीवों के साथ बातचीत को संशोधित करते हैं। रूट एक्सयूडेट्स गतिशील हैं और जैविक, पर्यावरण और प्रयोगात्मक स्थितियों द्वारा आकार दिए गए हैं। उनकी व्यापक विविधता और कम सांद्रता के कारण, सटीक एक्सयूडेट प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, यहां तक कि प्राकृतिक वातावरण में और भी अधिक जहां अन्य जीव मौजूद हैं, पौधे से व्युत्पन्न यौगिकों को बदल रहे हैं और स्वयं अतिरिक्त यौगिकों का उत्पादन कर रहे हैं। यहां पेश की गई सेमीहाइड्रोपोनिक ग्लास जार प्रायोगिक प्रणाली जैविक, पर्यावरण और प्रयोगात्मक कारकों पर नियंत्रण की अनुमति देती है। यह विभिन्न विकास माध्यमों की एक किस्म में, रोगाणुओं के साथ या बिना कई महीनों तक विभिन्न फ़ाइलोजेनेटिक रूप से अलग-अलग पौधों की प्रजातियों के विकास की अनुमति देता है। ग्लास-आधारित डिज़ाइन उच्च संवेदनशीलता और कम पर्यावरणीय प्रभाव के लिए कम मेटाबोलाइट पृष्ठभूमि प्रदान करता है क्योंकि इसका पुन: उपयोग किया जा सकता है। एक्सयूडेट्स को गैर-विनाशकारी रूप से नमूना लिया जा सकता है, और यदि वांछित हो तो प्रयोग के दौरान स्थितियों को बदला जा सकता है। सेटअप मास स्पेक्ट्रोमेट्री एनालिटिक्स और अन्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के साथ संगत है। संक्षेप में, हम विभिन्न स्थितियों में संवेदनशील रूट एक्सयूडेट विश्लेषण के लिए अनुकूल एक बहुमुखी विकास प्रणाली प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

घनी आबादी वाली मिट्टी के भीतर, राइजोस्फीयर एक कार्बन युक्त जगह प्रस्तुत करता है। यह 20% तक आत्मसात कार्बन के उत्सर्जन के माध्यम से पौधों की जड़ों द्वारा आकार दिया जाता है और माइक्रोबियल समुदायों को परेशान करता है जो निवासी मिट्टी माइक्रोबायोम 1,2,3,4,5,6 से अलग हैं। जैसा कि शोधकर्ता जड़ से जुड़े रोगाणुओं के लाभकारी कार्योंऔर इसके साथ जाने वाली टिकाऊ कृषि की क्षमता का दोहन कर रहे हैं, यह अवलोकन, जिसे अक्सर राइजोस्फीयर प्रभाव कहा जाता है, बढ़ते वैज्ञानिक प्रयासों का केंद्र रहा है। हालांकि, अब तक, सूक्ष्मजीवों और पौधों के बीच रासायनिक संवाद, जिसे राइजोस्फीयर प्रभाव का चालक माना जाता है, खराब समझा जाता है और इसलिए, कृषि में विश्वसनीय माइक्रोबियल समाधानों के विकास के लिए यंत्रवत समझसीमित है 8,9,10.

मिट्टी के वातावरण में जड़ का अनुमान लगाना जहां चयापचयों को मिट्टी के कणों द्वारा आसानी से अवशोषित किया जाता है और माइक्रोबियल समुदायों द्वारा जल्दी से बदल दिया जाता है, विशेष रूप से पौधों की प्रजातियों के लिए ठीक जड़ प्रणाली जैसे मॉडल प्लांट अरबिडोप्सिस थालियाना11 के साथ। यही कारण है कि, अधिकांश अध्ययनों में, हाइड्रोपोनिक सिस्टम से रूट एक्सयूडेट्स का नमूना लिया जाता है। इन सूक्ष्म जगत में, पौधों के हवाई भागों को अनुकूलित पौधे-धारकों या अधिक कम-कुंजी सामग्री जैसे जाल, अगर और कांच के मोतियों द्वारा जगह में रखा जाता है। उपयोग किए जाने वाले कंटेनर बहु-अच्छी प्लेटों पर पेट्री डिश से लेकर विभिन्न कस्टम और वाणिज्यिक बक्से तक वातन फिल्टर 12,13,14,15,16,17,18,19 के साथ या बिना हैं। प्रणाली के आधार पर, पौधे-विकास की स्थिति बहुत भिन्न होगी और प्राकृतिक परिस्थितियों को अधिक या कम हद तक प्रतिबिंबित करेगी।

यहां, हम एक ग्लास-आधारित, अर्ध-हाइड्रोपोनिक प्रणाली प्रस्तुत करते हैं जो प्रयोगात्मक रूप से उत्तरदायी है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करता है। यह इकट्ठा करने और उपयोग करने के लिए सीधा है और आमतौर पर उपलब्ध सामग्रियों पर आधारित है। प्रणाली कांच के मोतियों से भरे ग्लास जार पर आधारित है, जो पुन: प्रयोज्य प्रकृति और कांच के बने पदार्थ (चित्रा 1) के कम-बाध्यकारी गुणों का लाभ उठाती है। मोती बढ़ते पौधे के लिए भौतिक सहायता प्रदान करते हैं और यांत्रिक प्रतिबाधा का अनुकरण करते हैं, जब हाइड्रोपोनिक सेटअप 19,20,21की तुलना में अधिक मिट्टी जैसी जड़ वास्तुकला में योगदान करते हैं। यदि रोगाणुओं के साथ टीका लगाया जाता है, तो कांच के मोती बैक्टीरिया को संलग्न करने के लिए सतहों को प्रस्तुत करते हैं।

ग्लास जार को बाँझपन बनाए रखने के लिए बंद किया जा सकता है और सिस्टम को पर्याप्त हेडस्पेस और वायु परिसंचरण की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे आर्द्रता में संतृप्त वातावरण से बचा जा सके। जार विभिन्न पौधों की प्रजातियों के लंबे समय तक विकास के लिए उपयुक्त हैं और विभिन्न आकार के जार का उपयोग करके ऊपर और नीचे बढ़ाया जा सकता है। यहां, छह पौधों की प्रजातियों के लिए आवेदन दिखाए गए हैं, जिसमें C3 और C4 घास, डाइकोट और फलियां शामिल हैं। उनमें से मॉडल प्रजातियां हैं ए. थालियाना (डाइकोट), ब्रैकिपोडियम डिस्टैचियन (C3 मोनोकोट), मेडिकागो ट्रंकाटुला (फलियां), साथ ही फसल प्रजातियां जैसे सोलनम लाइकोपर्सिकम (टमाटर, डाइकोट), ट्रिटिकम एस्टिवम (गेहूं, C3 मोनोकोट), और सोरघम बाइकलर (ज्वार, C4 मोनोकोट)। प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रणाली के प्रयोगात्मक सेटअप, बीज नसबंदी और छह पौधों की प्रजातियों के अंकुरण, जार के लिए रोपाई के प्रत्यारोपण, विभिन्न विकास मीडिया, सूक्ष्म जीव इनोक्यूलेशन, रूट एक्सयूडेट नमूनाकरण, और एनालिटिक्स के लिए एक्सयूडेट प्रोसेसिंग शामिल हैं।

Protocol

1. रोपाई की तैयारी: बीज की सतह नसबंदी

नोट: बीज की सतह नसबंदी और सभी निम्नलिखित चरणों को बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा उल्लेख न किया गया हो। चरण 1.1 से 1.4 ए. थालियाना बीज की सतह नसबंदी के लिए विशिष्ट हैं। अन्य पौधों की प्रजातियों में ट्यूब आकार (बीज और बीज आकार की संख्या के आधार पर), समाधान में समय, और नसबंदी समाधान (तालिका 1) में वैकल्पिक भिन्नताएं होती हैं।

  1. एक microcentrifuge ट्यूब (बीज की अधिकतम 20 मिलीग्राम) के लिए बीज जोड़ें और 70% इथेनॉल के साथ बीज को कवर.
    चेतावनी: इथेनॉल ज्वलनशील है। खुली लौ के पास प्रयोग न करें।
  2. बंद माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 15 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन में ले जाएं, और रोटेशन सेट करें जैसे कि बीज धीरे उत्तेजित होते हैं।
  3. ध्यान से एक विंदुक के साथ 70% इथेनॉल निकालें और इसे 100% इथेनॉल के साथ बदलें. 1.2 कदम दोहराएँ.
  4. 100% इथेनॉल निकालें और एक बाँझ हवा के प्रवाह में खुला microcentrifuge ट्यूब lids छोड़ने के द्वारा बीज सूखी.
  5. एक बार बीज सूख रहे हैं, ट्यूब flicking या बाँझ संदंश का उपयोग करके 0.7% फाइटो अगर के साथ 0.5x मुराशिगे और स्कूग (एमएस) मध्यम पर समान रूप से उन्हें बाहर फैलो. अगर प्लेटों को बंद करें और उन्हें 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप के साथ सील करें।
  6. प्लेटों को क्षैतिज रूप से विकास कक्ष (16 घंटे प्रकाश/8 घंटे अंधेरा, 22 डिग्री सेल्सियस दिन/18 डिग्री सेल्सियस रात, 150-160 माइक्रोमोल एम-2 एस-1) में एक शेल्फ पर रखें।

2. रोपाई की तैयारी: अंकुरित बीजों को ताजी प्लेटों में स्थानांतरित करना

नोट: निम्नलिखित कदम ए. थालियाना के लिए विशिष्ट हैं और अन्य प्रजातियों के लिए आवश्यक नहीं हैं।

  1. अंकुरण के बाद, रोपाई को रैखिक रूप से रखकर 0.5x एमएस माध्यम के साथ नए 0.7% फाइटो अगर प्लेटों में 5 से 6 अंकुरों को स्थानांतरित करें, शीर्ष से लगभग 3 सेमी ( चित्रा 2 डी में रोसेट की स्थिति देखें)।
  2. 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप के साथ अगर प्लेटों को सील करें और अंकुरण(तालिका 2)के बाद 15-18 दिनों में रोपाई को जार में स्थानांतरित करने के लिए तैयार होने तक विकास कक्ष(चित्रा 2डी)में लंबवत रूप से विकसित करें।

3. हाइड्रोपोनिक प्रणाली की तैयारी: जार सेटअप

  1. प्रत्येक साफ जार में साफ 5 मिमी कांच के मोती के 150 एमएल जोड़ें और ढक्कन (चित्रा 1 ए) के साथ बंद करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, 5 मिमी कांच मोती22 प्रजातियों के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन मनका आकार यदि वांछित समायोजित किया जा सकता है.
  2. ढक्कन-टू-जार जंक्शन और आटोक्लेव (20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस)(चित्रा 1बी)को कवर करने के लिए बंद जार पर पर्याप्त एल्यूमीनियम पन्नी रखें।
  3. तैयार जार को तब तक ढककर रखें जब तक कि पौधे स्थानांतरित होने के लिए तैयार न हो जाएं (तालिका 2)।

4. हाइड्रोपोनिक प्रणाली की तैयारी: रोपाई का जोड़

  1. जब रोपाई जार (तालिका 2) में स्थानांतरित करने के लिए तैयार हैं, तो बाँझ बेंच में एल्यूमीनियम पन्नी और जार के ढक्कन को हटा दें।
  2. यदि जार को बैक्टीरिया के साथ टीका लगाया जाना है, तो चरण 4.3 पर जाने से पहले निम्न चरणों का पालन करें; अन्यथा, चरण 4.2 को छोड़ दें।
    1. एक बाँझ टीका पाश का प्रयोग, अगर प्लेटों पर शुद्ध जीवाणु संस्कृतियों से एकल कालोनियों लेने और बाँझ 10 मिमी MgCl2 के 750 माइक्रोन में उन्हें निलंबित. तब तक दोहराएं जब तक कि समाधान अशांत न हो जाए।
    2. वैकल्पिक: 1,000 ×ग्राम और कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 10 एमएम एमजीसीएल2 के 750 माइक्रोन के साथ निलंबन 3x को धोएं और 10 एमएम एमजीसीएल2 के 750 माइक्रोन में गोली के पुनरुत्थान और पुनरुत्थान के बाद कमरे के तापमान को धोएं।
    3. वैकल्पिक: यदि कई अलग-अलग जीवाणु प्रजातियों को टीका लगाया जाता है, तो आगे बढ़ने से पहले समान अनुपात में चरण 4.2.1-4.2.2 में तैयार एकल उपभेदों के निलंबन को मिलाएं।
    4. तरंग दैर्ध्य 600 एनएम (आयुध डिपो600) पर ऑप्टिकल घनत्व को 0.5x एमएस माध्यम (पीएच 5.7 से 5.9, KOH के साथ समायोजित) या पसंद के किसी अन्य विकास माध्यम में 0.2-0.4 तक समायोजित करें (चरण 4.3 देखें)। OD600 को फिर से मापें ताकि यह जांचा जा सके कि समाधान सही तरीके से पतला हुआ था या नहीं।
      चेतावनी: KOH संक्षारक है; दस्ताने और लैब कोट पहनें।
    5. निलंबन को उसी माध्यम (1:100 कमजोर पड़ने) में आयुध डिपो600 0.002-0.004 तक पतला करें।
      नोट: अंतिम सेल घनत्व इस्तेमाल किया जीवाणु तनाव पर निर्भर करेगा, लेकिन हमारे अनुभव में, इस inoculum लगभग 3-6 × 105 कोशिकाओं एमएल 1 से मेल खाती है.
    6. जार प्रति अंतिम कमजोर पड़ने के 35 एमएल जोड़ें. जार को नियंत्रित करने के लिए बाँझ विकास माध्यम के 35 एमएल जोड़ें। पौधे हस्तांतरण से पहले 0.5x एमएस मीडिया के साथ समान रूप से कोट करने के लिए मोतियों हिलाओ ताकि जड़ें सूख न जाएं। 4.4 कदम के लिए आगे बढ़ें.
  3. प्रत्येक जार में 0.5x एमएस माध्यम के 35 एमएल जोड़ें (पीएच 5.7 से 5.9, केओएच के साथ समायोजित करें)। पौधे के हस्तांतरण से पहले 0.5x एमएस मीडिया के साथ समान रूप से कोट करने के लिए मोतियों को हिलाएं ताकि जड़ें सूख न जाएं।
    नोट: विकास माध्यम को संशोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पोषक तत्वों को हटाकर, नमक तनाव को प्रेरित करने के लिए ऑस्मोलाइट्स के अलावा, या विभिन्न पीएच मूल्यों या विकास मीडिया का उपयोग। चेतावनी: KOH संक्षारक है; दस्ताने और लैब कोट पहनें।
  4. कांच के मोतियों के बीच जड़ प्रणाली रखकर 3-5 ए थालियाना पौधों को एक जार में रखें।
    नोट: प्रति जार पौधों की संख्या अन्य प्रजातियों (तालिका 2) के लिए अलग है।
  5. जड़ों को कवर करने और मीडिया (चित्रा 1C) से बाहर पत्तियों लिफ्ट करने के लिए बाँझ संदंश या चम्मच के साथ चारों ओर मोती ले जाएँ.
    नोट: जड़ों को तोड़ने और पौधों पर जोर देने से बचने के लिए पौधों और मोतियों को सावधानी से स्थानांतरित करें।
  6. जार के शीर्ष पर 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप के 2 स्ट्रिप्स जोड़ें और धीरे से ढक्कन को शीर्ष पर रखें (चित्र 1 डी-एफ)।
    नोट: वायु विनिमय में बाधा डालने से बचने के लिए ढक्कन को नीचे न धकेलें।
  7. हवा विनिमय की अनुमति देते हुए बाँझपन बनाए रखने के लिए 2.5 सेमी माइक्रोपोर टेप के साथ ढक्कन और जार के बीच की खाई को कवर करें, और जार को विकास कक्ष(चित्रा 1जी,एच)में रखें।
  8. जैविक प्रश्न और अपेक्षित परिवर्तनशीलता के आधार पर प्रयोगात्मक स्थिति प्रति 4-8 जार सेट करें।
  9. प्रयोगात्मक प्रणाली के मेटाबोलाइट पृष्ठभूमि के लिए खाते में जैविक नकारात्मक नियंत्रण (जैसे, पौधों के बिना जार) को शामिल करना सुनिश्चित करें। प्रयोगात्मक उपचार (जैसे, चौगुनी) के लिए के रूप में नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रतिकृतियों की एक ही संख्या सेट करें.
  10. विस्तारित विकास अवधि के लिए, विकास माध्यम साप्ताहिक को बदलें: शेष विकास माध्यम को 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक पिपेट के साथ हटा दें और ताजा माध्यम के 35 एमएल में जोड़ें।

5. रूट एक्सयूडेट्स का संग्रह

  1. जब पौधे वांछित उम्र तक पहुंच जाते हैं, तो बाँझ बेंच में 2.5 सेमी माइक्रोपोर टेप और ढक्कन को हटा दें।
    नोट: हमारे विकास की स्थिति में ए. थालियाना के लिए, अंकुरण के 21 दिन बाद फूल आने से पहले एक परिपक्व वनस्पति चरण का प्रतिनिधित्व करता है। वनस्पति विकास का चरण पौधों की प्रजातियों के लिए विशिष्ट है, और पौधों की प्रजातियों के साथ विकास अवधि का समय बदलता है; इस समय को शोध प्रश्न के आधार पर संशोधित किया जा सकता है।
  2. बाँझपन परीक्षण के लिए, एलबी अगर प्लेटों पर विकास माध्यम और पिपेट के 20 माइक्रोन विभाज्य के लिए।
    1. टीका जार के लिए, कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीएफयू) के लिए उपयोग करने के लिए विकास माध्यम के विभाज्य 100 माइक्रोन (उदाहरण के लिए, एक कमजोर पड़ने श्रृंखला23 में) मायने रखता है।
      नोट: हमारे अनुभव में, बैक्टीरियल घनत्व विकास माध्यम के 10 5-108 जीवित कोशिकाओं एमएल -1 के भीतर होता है।
  3. जड़ों को नुकसान से बचने के लिए, 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक पिपेट के साथ जितना संभव हो उतना विकास माध्यम निकालें।
  4. पत्तियों को गीला करने से बचने के लिए जार की दीवारों के साथ पाइपिंग करके संग्रह माध्यम (जैसे, 20 मिमी अमोनियम एसीटेट; पीएच 5.7-5.9 एचसीएल के साथ समायोजित) के 50 एमएल जोड़ें। जार को ढक्कन के साथ बंद करें और उन्हें एक्सयूडेट संग्रह के वांछित समय के लिए बाँझ परिस्थितियों में इनक्यूबेट करें। समय के प्रति संवेदनशील प्रयोगों के लिए, 2 घंटे एक अच्छा संग्रह खिड़की है.
    चेतावनी: एचसीएल संक्षारक है; दस्ताने और लैब कोट पहनें। लंबे समय तक रूट एक्सयूडेट संग्रह समय के लिए, ढक्कन को फिर से टेप के साथ लपेटें और जार को विकास कक्ष में ले जाएं।
  5. 2 घंटे के बाद, ट्यूबों में संग्रह मीडिया की वांछित मात्रा को हटा दें (उदाहरण के लिए, केंद्रित एक्सयूडेट्स का उपयोग करके परख या विश्लेषण के लिए 50 एमएल, या प्रत्यक्ष उपयोग के लिए 2 एमएल)। आगे की प्रक्रिया या विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्रित रूट exudates स्टोर करें।
    1. टीका जार के साथ काम करते समय, 5,000 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एकत्रित एक्सयूडेट्स को अपकेंद्रित्र करें और केवल विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, फ़िल्टर एक 0.22 सुक्ष्ममापी या 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ exudates निष्फल है.
  6. यदि प्रयोग एक समय श्रृंखला का हिस्सा है, जार से सभी शेष संग्रह माध्यम को हटा दें और 0.5x एमएस माध्यम के 35 एमएल जोड़ें। जार को विकास कक्ष में वापस करने से पहले ढक्कन और 2.5 सेमी टेप को बदलें।
  7. जड़ को मापें और एक जार में सभी पौधों के ताजा वजन को शूट करें ताकि बाद में पौधे के वजन से जड़ के उत्सर्जन को सामान्य किया जा सके।
    नोट: यदि वांछित हो तो पौधे के ऊतकों को इसके अलावा नमूना लिया जा सकता है।

6. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रसंस्करण रूट एक्सयूडेट्स

  1. विश्लेषणात्मक विधि के आधार पर, फ्रीज-ड्राई रूट को ध्यान केंद्रित करने और संग्रह माध्यम को हटाने के लिए एक्सयूडेट्स (-80 डिग्री सेल्सियस 0.37 एमबार पर जब तक कोई तरल मौजूद न हो)। विश्लेषण करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यहां प्रस्तुत डेटा एक सटीक-द्रव्यमान चौगुनी समय-उड़ान उपकरण पर प्रवाह-इंजेक्शन टीओएफ-एमएस विश्लेषण के साथ उत्पन्न हुआ था।
  2. विश्लेषणात्मक उपकरण में इंजेक्शन से पहले, फ्रीज सूखे exudates पुनर्गठन या जड़ ताजा वजन के अनुसार संग्रह माध्यम के साथ असंसाधित जड़ exudates पतला.
    नोट: संग्रह माध्यम मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ संगत होने के लिए चुना गया था। हालांकि, विश्लेषणात्मक विधि के आधार पर, इंजेक्शन से पहले डिसाल्टिंग कदम आवश्यक हो सकते हैं।

Representative Results

प्रयोगात्मक प्रणाली यहाँ शुरू की जड़ exudation प्रोफाइल को बदलने प्रयोगात्मक और पर्यावरणीय कारकों के नियंत्रण की अनुमति देता है. हमने दो अलग-अलग प्रयोगशालाओं (चित्रा 3) में विभिन्न प्रकाश स्थितियों, पौधे की उम्र और पौधों की घनत्व के तहत ए. थालियाना विकास की तुलना की। पौधों प्रयोगशालाओं (चित्रा 3 ए, बी) भर में स्वस्थ देखा. शॉर्ट-डे की स्थिति (10 एच रोशनी बनाम 16 एच प्रकाश, चित्रा 3) के परिणामस्वरूप लंबे दिन की स्थितियों (चित्रा 3सी, डी) की तुलना में उच्च जड़ द्रव्यमान हुआ। इसी तरह, लंबे दिन की स्थितियों में उगाए गए सभी पौधों का कुल जड़ द्रव्यमान शॉर्ट-डे (चित्रा 3 सी) की तुलना में छोटा था। कुल मिलाकर, जार के भीतर और बीच में विकास की परिवर्तनशीलता प्रयोगशालाओं में कम थी।

ग्लास जार प्रणाली विभिन्न प्रकार की पौधों की प्रजातियों और विकास के चरणों के साथ संगत है। रूट एक्सयूडेट विश्लेषण के लिए समापन बिंदु आम तौर पर 21 दिन होता है, क्योंकि हमारी प्रयोगात्मक स्थितियों में, कई पौधों की प्रजातियां प्रजनन चरण(चित्रा 4ए-ई)में संक्रमण से पहले एक परिपक्व वनस्पति चरण में होती हैं। जड़ प्रणाली को दृश्य क्षति के बिना पौधों को प्रयोगात्मक प्रणाली से आसानी से हटाया जा सकता है। इस प्रकार, ऊतक भार निर्धारित करना या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ऊतकों का उपयोग करना सीधा है। गेहूं के लिए उच्चतम शूट वेट पाए गए, इसके बाद ज्वार और टमाटर थे। ज्वार के लिए उच्चतम जड़ वजन पाए गए, इसके बाद गेहूं और एम। रूट: शूट अनुपात प्रजातियों के बीच भिन्न होता है। कुल मिलाकर, ऊतक वजन 100 मिलीग्राम और 800 मिलीग्राम के बीच भिन्न होता है।

रूट एक्सयूडेट संग्रह की अनुमति देने वाली प्रयोगात्मक प्रणालियों का एक केंद्रीय पहलू एक परिभाषित वातावरण में पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए रोगाणुओं के साथ नियंत्रित टीकाकरण है। प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली भी दोहराया हेरफेर ( चित्रा 5 में नियंत्रण हालत देखें) के साथ बाँझ रखा जा सकता है, और बैक्टीरिया जोड़ा और विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है. जब 33 दिन पुराने ए thaliana पौधों आयुध डिपो600 0.004 पर commensal बैक्टीरिया का एक मिश्रण के साथ inoculated थे, बैक्टीरिया 12 दिनों के लिए बनी रही, जो प्रयोग (चित्रा 5) की पूरी अवधि थी. कॉलोनी बनाने इकाइयों भी विकास माध्यम में 100 गुना वृद्धि हुई है और भी जड़ों (चित्रा 5C) उपनिवेश है. टीका लगाए गए पौधों के फेनोटाइप बाँझ पौधों (चित्रा 5 ए, बी) से अप्रभेद्य थे।

प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली कई प्रयोगात्मक स्थितियों में संग्रह exudate की अनुमति देता है. यहां, हम अमोनियम एसीटेट में या एक ही पौधों से पानी में एकत्र किए गए ए. थालियाना कॉल-0 के एक्सयूडेशन प्रोफाइल को लगातार प्रस्तुत करते हैं (चित्र 6ए)। विश्लेषण तक एक्सयूडेट्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, रूट वजन द्वारा सामान्यीकृत किया गया था, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया था। पौधों वाले जार के नमूनों को प्रयोगात्मक नियंत्रण (पौधों के बिना जार) के खिलाफ फ़िल्टर किया गया था। 2,163 चयापचयों में से, 436 ने पृष्ठभूमि (20.16%) के ऊपर एक संकेत दिखाया और विश्लेषण के लिए बनाए रखा गया। इनमें से, 416 या 95% यौगिकों ने प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच अलग-अलग बहुतायत दिखाई। हालांकि, 26 चयापचयों को किसी भी प्रकार के यौगिक के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता है और इस प्रकार परिभाषित नहीं किया गया है। अधिकांश मेटाबोलाइट्स (406 या 98%) पानी से एकत्रित एक्सयूडेट्स में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। पहले अमोनियम एसीटेट में और बाद में पानी में एक्सयूडेट्स का लगातार संग्रह एक्सयूडेशन प्रोफाइल को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि चयापचय संकेत समय के साथ पतला हो सकते हैं। हालांकि, दूसरे टाइमपॉइंट के रूप में एकत्र किए गए पानी में लगभग विशेष रूप से उच्च एक्सयूडेशन सिग्नल इस परिकल्पना का समर्थन नहीं करता है: शुद्ध पानी में एक्सयूडेट संग्रह संभवतः पौधों के लिए एक आसमाटिक झटका पैदा करता है, जो विकास समाधान के लिए एक संग्रह विलायक संतुलन की तुलना में बढ़े हुए मेटाबोलाइट बहुतायत का कारण बनता है (20 मिमी अमोनियम एसीटेट 0.5x एमएस माध्यम के बराबर है)। दोनों विकास स्थितियों के पहचाने गए यौगिकों के रासायनिक वर्गों की जांच से पता चला है कि अधिकांश यौगिक कार्बनिक अम्ल और डेरिवेटिव (28.6%) हैं, इसके बाद कार्बनिक ऑक्सीजन यौगिक (18%), ऑर्गेनोहेट्रोक्साइक्लिक यौगिक (14.2%), और लिपिड (13.2%) हैं। चयापचयों का केवल एक छोटा सबसेट फेनिलप्रोपानोइड्स और पॉलीकेटाइड्स (8.7%) और बेंजेनोइड (6%) से संबंधित है। कार्बनिक नाइट्रोजन यौगिक, न्यूक्लियोसाइड, ऑर्गोसल्फर यौगिक, एल्कलॉइड, लिग्नान, और संबंधित यौगिक वर्गीकृत यौगिकों के 2% और 0.5% के बीच प्रतिनिधित्व करते हैं (चित्र 6बी)। यहाँ दर्शाया चयापचयों का वितरण रूट exudates संग्रह प्रणाली24 के अन्य प्रकार का उपयोग कर पहले से ही प्रकाशित डेटा से मेल खाती है.

Figure 1
चित्रा 1: ग्लास जार सेटअप। (ए) ग्लास मोतियों के साथ जार। (बी) ग्लास मोतियों के साथ जार आटोक्लेव होने के लिए तैयार है। (सी) जार में अंकुर (शीर्ष दृश्य)। (डी) 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप के साथ एक जार (शीर्ष दृश्य) में अंकुर। (ई) 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप के साथ जार (साइड व्यू) में अंकुर। (एफ) जार में अंकुर (साइड व्यू) 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप और ढक्कन के साथ। (जी) 1.25 सेमी माइक्रोपोर टेप, ढक्कन और 2.5 सेमी माइक्रोपोर टेप के साथ जार (साइड व्यू) में रोपाई के साथ पूरा जार सेटअप। (एच) पूरा जार सेटअप (शीर्ष दृश्य)। (I) पौधे 21 दिन पुराने और फसल के लिए तैयार (शीर्ष दृश्य)। जार का आकार 147 मिमी ऊंचाई x 100 मिमी व्यास। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक विकास कक्ष में 0.5x मुराशिगे और स्कूग मध्यम अगर प्लेटों पर सतह-निष्फल अंकुर। (ए) अरबिडोप्सिस थालियाना (6 दिन पुराना), (बी) ब्रैकिपोडियम डिस्टैचियन (6 दिन पुराना), (सी) मेडिकागो ट्रंकाटुला (6 दिन पुराना), (डी) ए थालियाना (18 दिन पुराना)। अगर प्लेट का आकार 120 मिमी x 120 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Arabidopsis thaliana Col-0 पौधे छोटे और लंबे दिन की हल्की परिस्थितियों में जार में उगाए जाते हैं। (ए) तीन 33 दिन पुराने पौधों के साथ जार जो शॉर्ट-डे स्थितियों (10 घंटे प्रकाश / 14 घंटे अंधेरे, 220 माइक्रोमोल एम -2 एस -1 प्रकाश तीव्रता, 21 डिग्री सेल्सियस दिन / 18 डिग्री सेल्सियस रात) और (बी) जार में उगाए गए पांच 21-दिवसीय पौधों के साथ लंबे समय तक की स्थिति (16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे, 150-160 μmol m-2 s-1 प्रकाश तीव्रता, 22 °C दिन/18 °C रात)। (C) एक जार के सभी पौधों और (D) एकल पौधों के जड़ वजन। ** टी-टेस्ट के महत्व मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं (पी < 0.05)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बाँझ ग्लास जार सिस्टम सेटअप में 21 दिन में पांच phylogenetically अलग प्रजातियां। (ए) मॉडल मोनोकोट ब्रैकिपोडियम डिस्टैचियन, (बी) मॉडल फलियां मेडिकागो ट्रंकाटुला, (सी) डाइकोट सोलनम लाइकोपर्सिकम (टमाटर), (डी) डाइकोट सोरघम बाइकलर, (ई) मोनोकोट ट्रिटिकम एस्टिवम (गेहूं)। (च) कांच के जार में उगाई गई प्रजातियों की जड़ों और अंकुरों का ताजा वजन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33-दिन पुराना) शॉर्ट-डे स्थितियों में उगाया जाता है। (ए) एक बाँझ सेटअप में या (बी) कॉमेंसल बैक्टीरिया के एक संघ के साथ 12 दिनों के लिए टीका लगाया गया। (सी) बाँझ (नियंत्रण) और विकास सब्सट्रेट (बाएं) और जड़ (दाएं) के टीका जार के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ। बाँझ नियंत्रण की स्थिति के लिए N = 4 जार, और टीका लगाई गई स्थिति के लिए n = 8 जार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 21 दिन पुराने ए थालियाना कर्नल -0 के लिए विशिष्ट रूट एक्सयूडेट प्रोफाइल। बाँझ फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी में 2 घंटे के बाद बाँझ 20 मिमी अमोनियम एसीटेट (पीएच 5.7) में एक्सयूडेट्स एकत्र किए गए थे। प्रत्यक्ष इंजेक्शन का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मेटाबोलाइट्स का पता लगाया गया था। (ए) पृष्ठभूमि स्तर से ऊपर पाए गए 436 चयापचयों का प्रमुख घटक विश्लेषण (पौधों के बिना जार के खिलाफ पौधों के साथ जार की तुलना)। पीसी: समझाया गया विचरण की मात्रा के साथ प्रमुख घटक। नीला: पानी से एकत्रित exudates, पीला: अमोनियम एसीटेट-एकत्रित exudates। (बी) 416 चयापचयों के पाई चार्ट प्रयोगात्मक शर्तों (Tukey परीक्षण) superclass के अनुसार रंग के बीच काफी अलग (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रजातियां बीज की तैयारी 70% इथेनॉल में समय (मिनट) सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaClO) की सांद्रता (v/v % ब्लीच) ब्लीच में समय (मिनट)
अरबिडोप्सिस थालियाना 15 कोई नहीं; 100% इथेनॉल 15
ब्रैकिपोडियम डिस्टैचियन* देभूसी 0.5 6 5
मेडिकागो ट्रंकटुला*ए 30 6 30
सोलनम लाइकोपर्सिकम* 0.5 6 5
ज्वार बाइकलर* देभूसी 0.5 6 30
ट्रिटिकम एस्टिवम* देभूसी 0.5 12 20

तालिका 1: कई प्रजातियों के लिए सतह बीज नसबंदी के तरीके। * इथेनॉल और ब्लीच के बीच और अंत में फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी के साथ 4-5x धोया; ब्लीच के बाद 3-6 घंटे के लिए एकइनक्यूबेशन, हर 30 मिनट में फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी के साथ बदलना।

प्रजातियां जार के लिए दिन पौधों की संख्या
ब्रैकिपोडियम डिस्टैचियन 4 से 5 3
सोरघम बाइकलर 4 से 5 3
ट्रिटिकम एस्टिवम 4 से 5 2
मेडिकागो ट्रंकटुला 5 से 6 3
सोलनम लाइकोपर्सिकम 7 से 8 3
अरबिडोप्सिस थालियाना 17 3 से 5

तालिका 2: जार में स्थानांतरण के लिए दिनों में रोपाई की आयु और विभिन्न पौधों की प्रजातियों के लिए प्रति जार पौधों की संख्या।

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली ग्लास जार और ग्लास मोतियों पर आधारित है और इस प्रकार विभिन्न संदर्भों में रूट एक्सयूडेशन का अध्ययन करने के लिए एक सरल, कम रखरखाव और बहुमुखी अर्धहाइड्रोपोनिक प्रणाली प्रदान करती है। इसका उपयोग विभिन्न पौधों की प्रजातियों के एक्सयूडेशन प्रोफाइल की जांच करने वाले अध्ययनों में किया गया है25, विभिन्न विकास स्थितियों के लिए एक्सयूडेशन की प्रतिक्रियाएं25, साथ ही एक्सयूडेशन22 पर मिट्टी के भौतिक रासायनिक गुणों का प्रभाव। यह प्रणाली हफ्तों से लेकर महीनों तक विस्तारित विकास अवधि के लिए यहां परीक्षण की गई सभी पौधों की प्रजातियों के लिए उपयुक्त है। बाँझ स्थितियों का रखरखाव सीधा है, जैसा कि बैक्टीरिया के साथ टीकाकरण है, जो विश्लेषण किए गए 2-सप्ताह की वृद्धि अवधि में बना रहता है। इस प्रकार, प्रयोगात्मक प्रणाली न केवल बाँझ परिस्थितियों में रूट एक्सयूडेट्स के नियंत्रित संग्रह की अनुमति देती है, बल्कि इसका उपयोग पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, पौधे के विकास मीडिया को विभिन्न पोषक तत्वों के स्तर पर चयापचय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विविध किया जा सकता है, और विकास की अवधि को प्रकाश की स्थिति को अनुकूलित करके या विभिन्न आकार के जार का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है।

हाइड्रोपोनिक या अर्धहाइड्रोपोनिक स्थितियों में रूट exudates का अध्ययन मुख्य रूप से कम एकाग्रता चयापचयों11 की वृद्धि के संकल्प की वजह से क्षेत्र में मानक रहता है. कई हाइड्रोपोनिक दृष्टिकोण पेट्री व्यंजन, बहु-अच्छी प्लेटों, या अन्य छोटे कंटेनरों पर भरोसा करते हैं जो बाँझपन और उच्च थ्रूपुट की अनुमति देते हैं लेकिन उच्च आर्द्रता वाले वातावरण 17,18,26,27में उगाए गए छोटे पौधों या रोपाई तक प्रयोग को सीमित करते हैं। प्रस्तुत ग्लास जार सेटअप में, तुलनात्मक रूप से बड़े जार द्वारा पर्याप्त हेड स्पेस प्रदान किया जाता है, जिससे विस्तारित विकास अवधि की अनुमति मिलती है। माइक्रोपोर टेप धारियां बाँझपन बनाए रखते हुए सुरक्षित वायु विनिमय करती हैं। इस प्रकार, जौ और मक्का जैसे लंबे मोनोकॉट भी ग्लास जार सेटअप में कई हफ्तों तक उगाए जा सकते हैं। ए. थालियाना और तिपतिया घास जैसे छोटे पौधों का अंकुरण के बाद 4-5 सप्ताह तक अध्ययन किया जा सकता है, जिसमें वनस्पति और प्रजनन चरण शामिल हैं।

वैकल्पिक हाइड्रोपोनिक सेटअप बड़े पौधों के लिए भी उपलब्ध हैं, लेकिन इन्हें अक्सर प्लांट सपोर्ट 15,28,29,30 के लिए जाल, फोम बोर्ड और एनग्राफ्टमेंट बास्केट से बने कस्टम-निर्मित बक्से और इनलेट की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इन उपकरणों को आमतौर पर बाँझ होने के लिए स्थापित नहीं किया जाता है, या उन्हें माइक्रोबियल और / या रासायनिक संदूषण से मुक्त रखने के लिए चुनौतीपूर्ण सेटअप और रखरखाव प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली में बाँझपन का सेटअप और रखरखाव सीधा है। इसके अलावा, जार और मोतियों के लिए कांच का उपयोग प्लास्टिक से निकलने वाले दूषित पदार्थों की उपस्थिति को कम करता है और संसाधनों को बचाता है क्योंकि इसे आसानी से धोया और पुन: उपयोग किया जा सकता है।

मिट्टी के कणों की नकल करने के लिए पहले कांच के मोती लगाए गए हैं। वे इस तरह के एक्सयूडेशन जाल31 या अन्य अर्ध-हाइड्रोपोनिक सिस्टम19 जैसे रूट एक्सयूडेशन सैंपलिंग उपकरणों में प्राकृतिक जड़ विकास को प्रेरित करते हैं। ग्लास-जार सेटअप इस विकास का लाभ उठाता है और रोगाणुओं के लिए उपनिवेश सतह के रूप में मोतियों का परिचय देता है। मिट्टी में, पौधों की जड़ों के चारों ओर माइक्रोबायोम एक अर्धठोस वातावरण में विकसित होता है, जिसमें कॉम्पैक्ट कण और हवा या पानी से भरे स्थान होते हैं। भले ही ग्लास जार सेटअप में विकास माध्यम का सक्रिय वातन शामिल नहीं होता है, जिसके कारण निचले तरल चरण में इष्टतम ऑक्सीजन का स्तर नहीं होता है, एक छोटे विकास मध्यम मात्रा के साथ एक बड़े मनका की मात्रा का संयोजन एक आर्द्र अभी तक वातित ऊपरी चरण बनाता है जहां रोगाणु ऑक्सीक परिस्थितियों में बढ़ सकते हैं। दूसरों ने विकास कंटेनरों26,28 को हिला देने या हाइड्रोपोनिक विकास प्रणालियों में हवा की आपूर्ति बनाए रखने के लिएएयर पंप 19,29 के साथ मिलकर टयूबिंग का उपयोग करने का प्रस्ताव दिया है। हालांकि, उन प्रणालियों को या तो बाँझ नहीं होने के लिए स्थापित किया जाता है, या बाँझपन बनाए रखने के लिए विशेष सामग्री और निरंतर निगरानी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, झटकों के मामले में, विकास समाधान में शूटिंग के डूबने और रूट सिस्टम को नुकसान से बचने के लिए बहुत देखभाल। फिर भी, यदि वांछित है, तो प्रस्तुत प्रयोगात्मक सेटअप वातन के लिए अतिरिक्त सामग्री के साथ अनुकूलित किया जा सकता है।

चयापचय की जांच करने वाले सभी पौधे-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन अध्ययनों पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि रोगाणु पौधे-व्युत्पन्न यौगिकों को नीचा दिखाते हैं और अपने दम पर चयापचयों का उत्पादन करते हैं। एक विशेष बाँझ प्रयोगात्मक सेटअप के बिना, पौधे और सूक्ष्म जीव व्युत्पन्न चयापचयों के बीच अंतर करना संभव नहीं है। माइक्रोबियल गतिविधि को बाधित करने और पौधे व्युत्पन्न यौगिकों को समृद्ध करने के लिए, Oburger एट अल रासायनिक बैक्टीरिया के क्षरण32 को रोकने के लिए जड़ exudate नमूना समाधान निष्फल बाँझ करने के लिए प्रस्तावित. रासायनिक अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली में किया जा सकता है, जो अवरोधक के साथ या उसके बिना इलाज किए गए बाँझ बनाम गैर-बाँझ पौधों के एक्सयूडेशन प्रोफाइल की तुलना करता है।

प्रस्तुत ग्लास जार सेटअप की एक मुख्य सीमा यह है कि मिट्टी की तुलना में विकास की स्थिति बहुत कृत्रिम रहती है। मिट्टी उगाए पौधों से exudates अक्सर या तो percolation प्रणाली13, जहां विलायक flowthrough विकास कंटेनरों, या मिट्टी हाइड्रोपोनिक संकर प्रणालियों के आधार पर इकट्ठा कर रहे हैं जहां पौधों शुरू में मिट्टी में उगाया जाता है और फिर हाइड्रोपोनिक शर्तों16,33 करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं से एकत्र कर रहे हैं. ग्लास जार सेटअप के विपरीत, ये प्रक्रियाएं आमतौर पर विनाशकारी होती हैं, बदलते विकास वातावरण में समय के साथ कई संग्रह की अनुमति नहीं देती हैं। इसके अलावा, जबकि परकोलेटिंग सिस्टम में, मिट्टी की पृष्ठभूमि को एक्सयूडेट्स के साथ नमूना लिया जाता है, मिट्टी-हाइड्रोपोनिक हाइब्रिड सिस्टम में उच्च मिट्टी चयापचय पृष्ठभूमि की समस्या को एक्सयूडेट संग्रह के लिए हाइड्रोपोनिक स्थितियों में स्थानांतरण के साथ दरकिनार किया जाता है। हालांकि वसूली बार घायल जड़ों11 के माध्यम से मेटाबोलाइट रिसाव को कम करने के लिए लागू किया गया है, संयंत्र हस्तांतरण बहुत विघटनकारी है और घावों के बने रहने की संभावना है, और संयंत्र चयापचय हाइड्रोपोनिक शर्तों के लिए हस्तांतरण के जवाब में बदल सकता है. इसके अलावा, कई उदाहरणों में, एक आसमाटिक सदमे एक उपयुक्त विकास समाधान16,33 के बजाय पानी के लिए पौधों को स्थानांतरित करके प्रेरित है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, आसमाटिक संतुलन बनाए रखने के लिए एक समतुल्य समाधान के साथ विकास समाधान का आदान-प्रदान किया जाता है, फिर भी एक छोटी, परिभाषित समय खिड़की के भीतर एक्सयूडेशन को पकड़ने की अनुमति देता है। विकास समाधान का परिवर्तन कई प्रकाशित अध्ययनों में आम बात है और आसानी से 12,16,26,34 जड़ घायल बिना हाइड्रोपोनिक सेटअप में प्राप्त किया जा सकता है। इसकी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, प्रस्तुत प्रयोगात्मक प्रणाली को आसानी से अधिक प्राकृतिक परिस्थितियों की नकल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ठोस मिट्टी के कणों की उपस्थिति के साथ या बिना विकास समाधान के रूप में बाँझ या गैर-बाँझ मिट्टी के अर्क का उपयोग करके। प्राकृतिक परिस्थितियों के प्रति क्रमिक परिवर्तन विभिन्न भौतिक रासायनिक मिट्टी के गुणों और पौधे के चयापचय और शरीर विज्ञान पर माइक्रोबियल उपस्थिति के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है। इससे पहले कि वैज्ञानिक समुदाय विभिन्न वातावरणों में exudation की एक अच्छी समझ है, यह समानांतर में मिट्टी आधारित और हाइड्रोपोनिक प्रणालियों को रोजगार के लिए वांछनीय है, के रूप में दोनों setups उनके फायदे और सीमाओं13.

अंत में, प्रस्तुत अर्ध-हाइड्रोपोनिक, ग्लास-आधारित प्रयोगात्मक सेटअप अनुप्रयोगों की उच्च बहुमुखी प्रतिभा के साथ संयुक्त इसकी सादगी के कारण बाहर खड़ा है। यह बाँझ परिस्थितियों में या रोगाणुओं और पौधे-सूक्ष्म जीवों के साथ संयोजन में एक्सयूडेशन को इकट्ठा करने और अध्ययन करने के लिए एक सुलभ, कम लागत वाला तरीका प्रस्तुत करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम सीधे इंजेक्शन के साथ रूट एक्सयूडेशन प्रोफाइल का निर्धारण करने के लिए ईटीएच ज्यूरिख, स्विट्जरलैंड से प्रो डॉ निकोला ज़ाम्बोनी और प्रो डॉ उवे सॉयर और ए थालियाना कमेंसल बैक्टीरिया के लिए बेसल विश्वविद्यालय से प्रो डॉ क्लॉस श्लाप्पी को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (जेएस को PR00P3_185831, एस.एम., एस.एस., ईएमएस का समर्थन करते हुए) और पीएससी-सिंजेंटा फैलोशिप कार्यक्रम (प्रोफेसर डॉ. क्लाउस श्लाप्पी और जे.एस. को दिया गया, सीजे का समर्थन करते हुए) को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar powder for bacteriology VWR 20767.298
Aluminum foil FORA GmbH
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301-1KG ACS reagent, Eur >- 98%
Autoclave VX-150 Systec 1150
Balance Sartorius QUINTIX64-1S
Centrifuge Hermle Labortechnik GmbH 305.00 V05
Cuvettes Greiner Bio-One 613101
Difco LB Broth, Lennox BD 240210
Ethanol Reuss-Chemie AG RC-A15-A-005L
Filtered deionized water Merck Millipore Milli-Q IQ7000
Glass beads Carl Roth HH56.1 5 mm
Hydrochloric acid Merk 1.00317.1000
Inoculation loop Karl Hammacher GmbH HWO_070-21
Jars Weck 105741 850 mL
Lyophilizer Christ Alpha 2-4 LSCplus
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 2189.1
Matrix Orbital thermoshaker IKA 10006248
Microcentrifuge tube Sarstedt AG & Co. KG 72.695.500 SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP
Micropore tape  3M 1530-0 1.25 cm x 9.1 m
Micropore tape  3M 1530-1 2.5 cm x 9.1 m
Murashige & Skoog Medium (MS) Duchefa Biochemie M0221.0050
Growth chamber Percival SE41-TLCU4 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night
Phyto agar Duchefa Biochemie P1003.1000
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 8.14353.0100
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl Carl Roth 9062.4
Square petri dish Greiner Bio-One 688102 120x120x17 mm, with vents
Stericup Quick release Millipore S2GPU05RE 0.22 µm PES, 500 mL
Sterile bench FASTER S.r.l. FlowFast H 18

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References

  1. Sasse, J., Martinoia, E., Northen, T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome. Trends in Plant Science. 23 (1), 25-41 (2018).
  2. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
  3. Lopez, J. L., et al. Growth rate is a dominant factor predicting the rhizosphere effect. The ISME Journal. 17 (9), 1396-1405 (2023).
  4. Hu, L., et al. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota. Nature Communications. 9 (1), 2738 (2018).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (8), 911-920 (2015).
  6. Bulgarelli, D., et al. Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley. Cell Host Microbe. 17 (3), 392-403 (2015).
  7. Li, J., Wang, J., Liu, H., Macdonald, C. A., Singh, B. K. Application of microbial inoculants significantly enhances crop productivity: A meta-analysis of studies from 2010 to 2020. Journal of Sustainable Agriculture and Environment. 1 (3), 216-225 (2022).
  8. Escudero-Martinez, C., Bulgarelli, D. Engineering the crop microbiota through host genetics. Annual Review of Phytopathology. 61, 257-277 (2023).
  9. Poppeliers, S. W., Sanchez-Gil, J. J., de Jonge, R. Microbes to support plant health: understanding bioinoculant success in complex conditions. Current Opinion in Microbiology. 73, 102286 (2023).
  10. O'Callaghan, M., Ballard, R. A., Wright, D. Soil microbial inoculants for sustainable agriculture: Limitations and opportunities. Soil Use and Management. 38 (3), 1340-1369 (2022).
  11. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates - Mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  12. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
  13. Vismans, G., et al. Coumarin biosynthesis genes are required after foliar pathogen infection for the creation of a microbial soil-borne legacy that primes plants for SA-dependent defenses. Scientific Reports. 12 (1), 22473 (2022).
  14. Strehmel, N., Böttcher, C., Schmidt, S., Scheel, D. Profiling of secondary metabolites in root exudates of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 108, 35-46 (2014).
  15. Song, Y., Pieterse, C. M. J., Bakker, P., Berendsen, R. L. Collection of sterile root exudates from foliar pathogen-inoculated plants. Methods in Molecular Biology. 2232, 305-317 (2021).
  16. Oburger, E., et al. A quick and simple spectrophotometric method to determine total carbon concentrations in root exudate samples of grass species. Plant Soil. 478 (1-2), 273-281 (2022).
  17. Koprivova, A., et al. Root-specific camalexin biosynthesis controls the plant growth-promoting effects of multiple bacterial strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (31), 15735-15744 (2019).
  18. Gao, J., et al. Ecosystem fabrication (EcoFAB) protocols for the construction of laboratory ecosystems designed to study plant-microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. (134), e57170 (2018).
  19. Lopez-Guerrero, M. G., et al. A glass bead semi-hydroponic system for intact maize root exudate analysis and phenotyping. Plant Methods. 18 (1), 25 (2022).
  20. Boeuf-Tremblay, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of mechanical impedance on root exudation of maize seedlings at two development stages. Plant and Soil. 172, 279-287 (1995).
  21. Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Influence of plant morphology on root exudation of maize subjected to mechanical impedance in hydroponic conditions. Plant and Soil. 201, 231-239 (1998).
  22. Sasse, J., et al. Root morphology and exudate availability are shaped by particle size and chemistry in Brachypodium distachyon. Plant Direct. 4 (7), 00207 (2020).
  23. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
  24. Monchgesang, S., et al. Natural variation of root exudates in Arabidopsis thaliana-linking metabolomic and genomic data. Scientific Reports. 6, 29033 (2016).
  25. McLaughlin, S., Zhalnina, K., Kosina, S., Northen, T. R., Sasse, J. The core metabolome and root exudation dynamics of three phylogenetically distinct plant species. Nature Communications. 14 (1), 1649 (2023).
  26. Badri, D. V., Chaparro, J. M., Zhang, R., Shen, Q., Vivanco, J. M. Application of natural blends of phytochemicals derived from the root exudates of Arabidopsis to the soil reveal that phenolic-related compounds predominantly modulate the soil microbiome. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4502-4512 (2013).
  27. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  28. Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling. Journal of Visualized Experiments. (125), e55955 (2017).
  29. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cozatl, D. G. Hydroponics: a versatile system to study nutrient allocation and plant responses to nutrient availability and exposure to toxic elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  30. Yi, Y., Li, Z., Kuipers, O. P. Plant-microbe interaction: transcriptional response of Bacillus Mycoides to potato root exudates. Journal of Visualized Experiments. (137), e57606 (2018).
  31. Phillips, R. P., Erlitz, Y., Bier, R., Bernhardt, E. S. New approach for capturing soluble root exudates in forest soils. Functional Ecology. 22 (6), 990-999 (2008).
  32. Oburger, E., et al. Root exudation of phytosiderophores from soil-grown wheat. New Phytologist. 203 (4), 1161-1174 (2014).
  33. Neal, A. L., Ahmad, S., Gordon-Weeks, R., Ton, J. Benzoxazinoids in root exudates of maize attract Pseudomonas putida to the rhizosphere. PLoS One. 7 (4), e35498 (2012).
  34. Miao, Y., et al. Exogenous salicylic acid alleviates salt stress by improving leaf photosynthesis and root system architecture in cucumber seedlings. Scientia Horticulturae. 272, 109577 (2020).

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जीवविज्ञान अंक 201
सेमीहाइड्रोपोनिक रूट एक्सयूडेट प्रोफाइलिंग के लिए एक बहुमुखी ग्लास जार सिस्टम
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McLaughlin, S., Joller, C., Siffert, … More

McLaughlin, S., Joller, C., Siffert, A., Stirnemann, E. M., Sasse, J. A Versatile Glass Jar System for Semihydroponic Root Exudate Profiling. J. Vis. Exp. (201), e66070, doi:10.3791/66070 (2023).

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