Summary
Apresentamos um protocolo para um sistema experimental semihidropônico à base de vidro que suporta o crescimento de uma variedade de plantas filogeneticamente distintas com ou sem micróbios. O sistema é compatível com diferentes meios de crescimento e permite a amostragem não destrutiva de exsudato radicular para análise a jusante.
Abstract
Os exsudatos radiculares moldam a interface planta-solo, estão envolvidos na ciclagem de nutrientes e modulam as interações com os organismos do solo. Os exsudatos radiculares são dinâmicos e moldados por condições biológicas, ambientais e experimentais. Devido à sua grande diversidade e baixas concentrações, perfis precisos de exsudato são difíceis de determinar, ainda mais em ambientes naturais onde outros organismos estão presentes, transformando compostos derivados de plantas e produzindo compostos adicionais. O sistema experimental de frascos de vidro semihidropônicos aqui introduzido permite o controle de fatores biológicos, ambientais e experimentais. Permite o crescimento de várias espécies vegetais filogeneticamente distintas por até vários meses com ou sem micróbios, em uma variedade de diferentes meios de crescimento. O design à base de vidro oferece um fundo de baixo metabólito para alta sensibilidade e baixo impacto ambiental, pois pode ser reutilizado. Exsudatos podem ser amostrados de forma não destrutiva, e as condições podem ser alteradas ao longo de um experimento, se desejado. A configuração é compatível com análise de espectrometria de massa e outros procedimentos analíticos downstream. Em resumo, apresentamos um sistema de crescimento versátil adequado para análise de exsudato radicular sensível em uma variedade de condições.
Introduction
Em solos densamente povoados, a rizosfera apresenta um nicho rico em carbono. É moldado por raízes de plantas via exsudação de até 20% de carbono assimilado e abriga comunidades microbianas distintas do microbioma residente no solo 1,2,3,4,5,6. À medida que os pesquisadores estão explorando as funções benéficas dos micróbios associados às raízes e o potencial para a agricultura sustentável que o acompanha7, essa observação, muitas vezes denominada como efeito rizosfera, tem sido o foco de crescentes esforços científicos. No entanto, até o momento, o diálogo químico entre microrganismos e plantas, que se propõe ser o condutor do efeito rizosfera, permanece pouco compreendido e, portanto, o entendimento mecanicista para o desenvolvimento de soluções microbianas confiáveis na agricultura é limitado8,9,10.
Decifrar exsudatos radiculares em ambientes de solo onde metabólitos são prontamente absorvidos pelas partículas do solo e rapidamente transformados por comunidades microbianas não é simples, especialmente para espécies vegetais com sistemas radiculares finos, como a planta-modelo Arabidopsis thaliana11. É por isso que, na maioria dos estudos, os exsudatos radiculares são amostrados a partir de sistemas hidropônicos. Nesses microcosmos, as partes aéreas das plantas são mantidas no lugar por suportes de plantas personalizados ou materiais mais discretos, como malha, ágar e contas de vidro. Os recipientes utilizados variam desde placas de Petri sobre placas multipoços até diversas caixas personalizadas e comerciais com ou sem filtros de aeração 12,13,14,15,16,17,18,19. Dependendo do sistema, as condições de crescimento das plantas variam muito e refletem as condições naturais em maior ou menor grau.
Aqui, apresentamos um sistema semihidropônico à base de vidro que é experimentalmente passível de produção de resultados altamente reprodutíveis. É simples de montar e usar e é baseado em materiais comumente disponíveis. O sistema é baseado em um frasco de vidro preenchido com contas de vidro, aproveitando a natureza reutilizável e as propriedades de baixa ligação dos utensílios de vidro (Figura 1). As esferas fornecem suporte físico para a planta em crescimento e simulam impedância mecânica, contribuindo para uma arquitetura radicular mais semelhante à do solo quando comparadas aos dispositivos hidropônicos 19,20,21. Se inoculadas com micróbios, as esferas de vidro apresentam superfícies para as bactérias se fixarem.
O frasco de vidro pode ser fechado para manter a esterilidade e o sistema é projetado para permitir espaço livre suficiente e circulação de ar, evitando um ambiente saturado de umidade. Os frascos são adequados para o crescimento prolongado de diferentes espécies de plantas e podem ser escalados para cima e para baixo usando frascos de tamanhos diferentes. Aqui, são apresentadas aplicações para seis espécies vegetais, abrangendo gramíneas C3 e C4, dicotiledôneas e leguminosas. Entre elas estão as espécies-modelo A. thaliana (dicotiledônea), Brachypodium distachyon (monocotiledônea C3), Medicago truncatula (leguminosa), além de espécies vegetais como Solanum lycopersicum (tomate, dicotiledônea), Triticum aestivum (trigo, monocotiledônea C3) e Sorghum bicolor (sorgo, monocotiledônea C4). O protocolo apresentado inclui o arranjo experimental do sistema, esterilização e germinação de sementes de seis espécies vegetais, transplante de plântulas para frascos, diferentes meios de crescimento, inoculação de micróbios, amostragem de exsudato radicular e processamento de exsudato para análise.
Protocol
1. Preparo das mudas: Esterilização superficial das sementes
NOTA: A esterilização superficial das sementes e todas as etapas seguintes devem ser feitas em condições estéreis, salvo indicação em contrário. As etapas 1.1 a 1.4 são específicas para esterilização superficial de sementes de A. thaliana . Outras espécies de plantas apresentam variações alternativas no tamanho do tubo (dependendo do número de sementes e do tamanho das sementes), tempo em soluções e soluções de esterilização (Tabela 1).
- Adicionar as sementes a um tubo de microcentrífuga (máximo de 20 mg de sementes) e cobrir as sementes com etanol a 70%.
ATENÇÃO: O etanol é inflamável. Não use perto da chama aberta. - Mova os tubos de microcentrífuga fechados para um agitador por 15 min e ajuste a rotação de modo que as sementes sejam levemente agitadas.
- Retire cuidadosamente o etanol 70% com uma pipeta e substitua-o por etanol 100%. Repita a etapa 1.2.
- Retire o etanol 100% e seque as sementes deixando as tampas dos tubos da microcentrífuga abertas em um fluxo de ar estéril.
- Depois de secas, espalhe-as uniformemente em meio Murashige e Skoog (MS) 0,5x com 0,7% de ágar fito, agitando o tubo ou usando pinça estéril. Feche as placas de ágar e sela-as com fita de micropore de 1,25 cm.
- Colocar as placas horizontalmente em uma prateleira na câmara de crescimento (16 h claro/8 h escuro, 22 °C dia/18 °C noite, 150-160 μmol m-2 s-1).
2. Preparo das mudas: Transferência das sementes germinadas para placas frescas
NOTA: As etapas a seguir são específicas para A. thaliana e não são necessárias para outras espécies.
- Após a germinação, transferir de 5 a 6 plântulas para novas placas de ágar fito 0,7% com meio MS 0,5x, colocando-as linearmente, a aproximadamente 3 cm do topo (veja a posição da roseta na Figura 2D).
- Selar placas de ágar com fita micropore de 1,25 cm e crescer verticalmente na câmara de crescimento (Figura 2D) até que as plântulas estejam prontas para serem transferidas para potes aos 15-18 dias após a germinação (Tabela 2).
3. Preparação do sistema hidropônico: Configuração do frasco
- Adicionar 150 mL de esferas de vidro limpas de 5 mm a cada frasco limpo e fechar com a tampa (Figura 1A).
NOTA: Neste protocolo, as esferas de vidro de 5 mm são adequadas para a maioria das espécies22, mas o tamanho das contas pode ser ajustado se desejado. - Coloque papel alumínio suficiente sobre os frascos fechados para cobrir a junção tampa-jarra e a autoclave (121 °C por 20 min) (Figura 1B).
- Manter os frascos preparados cobertos até que as plantas estejam prontas para serem transferidas (Tabela 2).
4. Preparo do sistema hidropônico: Adição de mudas
- Quando as mudas estiverem prontas para serem transferidas para os frascos (Tabela 2), retirar o papel alumínio e as tampas dos frascos na bancada estéril.
- Se os frascos forem inoculados com bactérias, execute os seguintes passos antes de passar para o passo 4.3; caso contrário, ignore a etapa 4.2.
- Usando uma alça de inoculação estéril, pegue colônias únicas de culturas bacterianas puras em placas de ágar e suspenda-as em 750 μL de 10 mM MgCl2 estéril. Repita até que a solução esteja turva.
- Opcional: Lavar a suspensão 3x com 750 μL de 10 mM MgCl2 por 5 min de centrifugação estéril a 1.000 × g e temperatura ambiente seguida da remoção do sobrenadante e ressuspensão do pellet em 750 μL de 10 mM MgCl2.
- Opcional: Se inocular várias espécies bacterianas diferentes, misturar as suspensões de estirpes individuais preparadas nas etapas 4.2.1-4.2.2 em proporções iguais antes de prosseguir.
- Ajustar a densidade óptica no comprimento de onda de 600 nm (OD600) para 0,2-0,4 em meio MS de 0,5x (pH 5,7 a 5,9, ajustado com KOH) ou outro meio de crescimento de escolha (ver passo 4.3). Meça o OD600 novamente para verificar se a solução foi diluída corretamente.
CUIDADO: KOH é corrosivo; usar luvas e jaleco. - Diluir a suspensão até OD600 0,002-0,004 no mesmo meio (diluição 1:100).
NOTA: A densidade celular final dependerá da cepa bacteriana utilizada, mas em nossa experiência, este inóculo corresponde a aproximadamente 3-6 ×10,5 células mL-1. - Adicionar 35 mL da diluição final por frasco. Adicionar 35 mL de meio de cultura estéril para controlar os frascos. Mexa as contas para revestir uniformemente com 0,5x MS antes da transferência da planta para que as raízes não sequem. Prossiga para a etapa 4.4.
- Adicionar 35 mL de meio MS 0,5x a cada frasco (pH 5,7 a 5,9, ajustar com KOH). Mexa as contas para revestir uniformemente com 0,5x MS antes da transferência da planta para que as raízes não sequem.
NOTA: O meio de cultura pode ser modificado, por exemplo, pela remoção de nutrientes, a adição de osmólitos para induzir estresse salino, ou o uso de diferentes valores de pH ou meios de crescimento. CUIDADO: KOH é corrosivo; usar luvas e jaleco. - Coloque 3-5 plantas de A. thaliana em um jarro, colocando os sistemas radiculares entre as contas de vidro.
NOTA: O número de plantas por jarro é diferente para as outras espécies (Tabela 2). - Movimente as contas com pinças ou colheres estéreis para cobrir as raízes e retirar as folhas do meio (Figura 1C).
OBS: Movimente cuidadosamente as plantas e miçangas para evitar quebrar as raízes e estressar as plantas. - Adicione 2 tiras de fita de micropore de 1,25 cm na parte superior dos frascos e coloque suavemente a tampa por cima (Figura 1D-F).
NOTA: Não empurre a tampa para baixo para evitar obstruir a troca de ar. - Cubra o espaço entre a tampa e o frasco com fita micropore de 2,5 cm para manter a esterilidade e permitir a troca de ar e coloque os frascos em uma câmara de crescimento (Figura 1G,H).
- Montar de 4 a 8 frascos por condição experimental, dependendo da questão biológica e da variabilidade esperada.
- Certifique-se de incluir controles negativos biológicos (por exemplo, frascos sem plantas) para explicar o fundo do metabólito do sistema experimental. Estabelecer o mesmo número de repetições para controles negativos que para tratamentos experimentais (por exemplo, quadruplicatas).
- Para períodos de crescimento prolongados, substitua o meio de crescimento semanalmente: retire o restante do meio de crescimento com uma pipeta volumétrica de 25 mL e adicione 35 mL de meio fresco.
5. Coleta de exsudatos radiculares
- Quando as plantas atingirem a idade desejada, retirar a fita de micropore de 2,5 cm e tampa na bancada estéril.
NOTA: Para A. thaliana em nossas condições de crescimento, 21 dias após a germinação representa um estágio vegetativo maduro antes do início da floração. O estágio de desenvolvimento vegetativo é específico para a espécie vegetal, e o momento do período de crescimento muda com a espécie vegetal; Esse tempo pode ser modificado dependendo da pergunta de pesquisa. - Para o teste de esterilidade, alíquota de 20 μL de meio de crescimento e pipeta em placas de ágar LB.
- Para frascos inoculados, alíquota de 100 μL de meio de crescimento para uso na contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) (por exemplo, em uma série de diluição23).
NOTA: Em nossa experiência, as densidades bacterianas variam dentro de 105-10 8 células vivas mL-1 de meio de crescimento.
- Para frascos inoculados, alíquota de 100 μL de meio de crescimento para uso na contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) (por exemplo, em uma série de diluição23).
- Remover o máximo possível de meio de crescimento com uma pipeta volumétrica de 25 mL, evitando danos às raízes.
- Adicionar 50 mL de meio de coleta (por exemplo, acetato de amônio 20 mM; pH 5,7-5,9 ajustado com HCl) pipetando ao longo das paredes do frasco para evitar molhar as folhas. Feche os frascos com tampas e incube-os em condições estéreis pelo tempo desejado de coleta do exsudato. Para experimentos sensíveis ao tempo, 2 h é uma boa janela de coleta.
CUIDADO: HCl é corrosivo; usar luvas e jaleco. Para tempos mais longos de coleta de exsudato radicular, envolva as tampas novamente com fita adesiva e mova os frascos para a câmara de crescimento. - Após 2 h, remova a quantidade desejada de meio de coleta em tubos (por exemplo, 50 mL para ensaios ou análises usando exsudatos concentrados ou 2 mL para uso direto). Conservar os exsudatos radiculares recolhidos a -80 °C até novo processamento ou análise.
- Ao trabalhar com frascos inoculados, centrifugar os exsudatos coletados por 10 min a 5.000 × g e 4 °C e usar apenas sobrenadantes para a análise. Alternativamente, filtrar-esterilizar os exsudatos com um filtro de 0,22 μm ou 0,45 μm.
- Se o experimento fizer parte de uma série temporal, remova todo o meio de coleta restante dos frascos e adicione 35 mL de meio MS 0,5x. Substitua a tampa e a fita adesiva de 2,5 cm antes de devolver os frascos à câmara de crescimento.
- Meça a massa fresca da raiz e da parte aérea de todas as plantas em um frasco para depois normalizar os exsudatos radiculares pelo peso da planta.
NOTA: Os tecidos vegetais podem ser amostrados adicionalmente, se desejado.
6. Processamento de exsudatos radiculares para espectrometria de massas
- Dependendo do método analítico, liofilizar os exsudatos radiculares para concentrar e remover o meio de coleta (-80 °C a 0,37 mbar até que não haja líquido). Conservar a -80 °C até estar pronto a analisar.
NOTA: Os dados aqui apresentados foram gerados com análise TOF-MS por injeção em fluxo em um instrumento de tempo de voo quadrupolo de massa precisa. - Antes da injecção no instrumento analítico, reconstituir os exsudatos liofilizados ou diluir os exsudatos radiculares não transformados com meio de colheita de acordo com a massa fresca da raiz.
OBS: O meio de coleta foi escolhido por ser compatível com o espectrômetro de massas. No entanto, dependendo do método analítico, podem ser necessárias etapas de dessalinização antes da injeção.
Representative Results
O sistema experimental aqui introduzido permite o controle de fatores experimentais e ambientais que alteram o perfil de exsudação radicular. Comparamos o crescimento de A. thaliana sob diferentes condições de iluminação, idade e densidade de plantas em dois laboratórios diferentes (Figura 3). As plantas pareciam saudáveis em todos os laboratórios (Figura 3A,B). Condições de dias curtos (luzes de 10 h vs. luz de 16 h, Figura 3) resultaram em maior massa radicular em comparação com condições de dias longos (Figura 3C,D). Da mesma forma, a massa radicular total de todas as plantas cultivadas em dias longos foi menor do que em dias curtos (Figura 3C). No geral, a variabilidade de crescimento dentro e entre frascos foi baixa entre os laboratórios.
O sistema de frascos de vidro é compatível com uma variedade de espécies vegetais e estágios de desenvolvimento. O desfecho para a análise do exsudato radicular é tipicamente de 21 dias, pois em nossas condições experimentais, muitas espécies de plantas estão em um estágio vegetativo maduro antes da transição para o estágio reprodutivo (Figura 4A-E). As plantas podem ser facilmente removidas do sistema experimental sem danos visíveis ao sistema radicular. Assim, a determinação do peso dos tecidos ou o uso de tecidos para análise a jusante é simples. Os maiores pesos da parte aérea foram encontrados para o trigo, seguido pelo sorgo e tomate. Os maiores pesos radiculares foram encontrados para sorgo, seguido por trigo e M. truncatula. A relação raiz:parte aérea difere entre as espécies. No geral, os pesos dos tecidos variaram entre 100 mg e 800 mg.
Um aspecto central dos sistemas experimentais que permitem a coleta de exsudato radicular é a inoculação controlada com micróbios para estudar interações planta-micróbio em um ambiente definido. O sistema experimental apresentado pode ser mantido estéril mesmo com manipulação repetida (ver condição "controle" na Figura 5), e as bactérias podem ser adicionadas e mantidas por longos períodos. Quando plantas de A. thaliana com 33 dias de idade foram inoculadas com uma mistura de bactérias comensais a OD600 0,004, as bactérias persistiram por 12 dias, que foi a duração total do experimento (Figura 5). As unidades formadoras de colônias aumentaram 100 vezes no meio de crescimento e também colonizaram as raízes (Figura 5C). Os fenótipos das plantas inoculadas foram indistinguíveis daqueles das plantas estéreis (Figura 5A,B).
O sistema experimental apresentado permite a coleta de exsudato em diversas condições experimentais. Neste trabalho, apresentamos consecutivamente perfis de exsudação de A. thaliana Col-0 coletados em acetato de amônio ou em água das mesmas plantas consecutivamente (Figura 6A). Os exsudatos foram armazenados a -80 °C até a análise, normalizados pelo peso da raiz e analisados por espectrometria de massas. Amostras de frascos contendo plantas foram filtradas contra controles experimentais (frascos sem plantas). Dos 2.163 metabólitos, 436 apresentaram sinal acima do fundo (20,16%) e foram retidos para análise. Destes, 416 ou 95% dos compostos apresentaram abundância distinta entre as condições experimentais. No entanto, 26 metabólitos não puderam ser atribuídos a nenhum tipo de composto, não sendo, portanto, definidos. A maioria dos metabólitos (406 ou 98%) foi mais abundante nos exsudatos coletados em água. A coleta consecutiva de exsudatos primeiro em acetato de amônio e depois em água pode afetar o perfil de exsudação, pois os sinais metabólicos podem se diluir com o tempo. No entanto, o sinal de exsudação quase exclusivamente mais alto em água coletada como um segundo ponto de tempo não suporta essa hipótese: a coleta de exsudato em água pura provavelmente cria um choque osmótico para as plantas, o que causa o aumento da abundância de metabólitos em comparação com um solvente de coleta equimolar à solução de crescimento (acetato de amônio 20 mM é equimolar a meio MS 0,5x). A investigação das classes químicas dos compostos identificados em ambas as condições de crescimento mostrou que a maioria dos compostos são ácidos orgânicos e derivados (28,6%), seguidos por compostos orgânicos de oxigênio (18%), compostos organoheterocíclicos (14,2%) e lipídios (13,2%). Apenas um pequeno subconjunto de metabólitos pertence a fenilpropanóides e poliquetídeos (8,7%) e benzenóides (6%). Compostos orgânicos nitrogenados, nucleosídeos, compostos organosulfurados, alcaloides, lignanas e compostos relacionados representam entre 2% e 0,5% dos compostos classificados (Figura 6B). A distribuição dos metabólitos aqui representados corresponde a dados já publicados utilizando outros tipos de sistemas de coleta de exsudatos radiculares24.
Figura 1: Configuração do frasco de vidro. (A) Frasco com contas de vidro. (B) Frasco com contas de vidro pronto para ser autoclavado. (C) Mudas em frascos (vista superior). (D) Mudas em jarra (vista superior) com fita micropore de 1,25 cm. (E) Mudas em frascos (vista lateral) com fita micropore de 1,25 cm. (F) Mudas em frascos (vista lateral) com fita micropore de 1,25 cm e tampa. (G) Montagem completa dos frascos com as mudas em frascos (vista lateral) com fita de micropore de 1,25 cm, tampa e fita de micropore de 2,5 cm. (H) Configuração completa do jar (vista superior). (I) Plantas com 21 dias de idade e prontas para a colheita (vista superior). Tamanho do frasco 147 mm altura x 100 mm diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mudas esterilizadas superficialmente em placas de ágar médio Murashige 0,5x e Skoog em câmara de crescimento. (A) Arabidopsis thaliana (6 dias de idade), (B) Brachypodium distachyon (6 dias de idade), (C) Medicago truncatula (6 dias de idade), (D) A. thaliana (18 dias de idade). Tamanho da placa de ágar 120 mm x 120 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Plantas de Arabidopsis thaliana Col-0 cultivadas em frascos sob condições de luz de dias curtos e longos. (A) Jarra com três plantas de 33 dias de idade cultivadas em condições de dias curtos (10 h claro/14 h escuro, intensidade luminosa de 220 μmol m-2 s-1 , 21 °C dia/18 °C noite) e (B) jarra com cinco plantas de 21 dias de idade cultivadas em condições de dias longos (16 h claro/8 h escuro, 150-160 μmol m-2 s-1 intensidade luminosa, 22 °C dia/18 °C noite). Peso radicular de (C) de todas as plantas de um frasco e (D) de plantas isoladas. ** representam valores de significância do teste t (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cinco espécies filogeneticamente distintas no 21º dia na montagem do sistema de frascos de vidro estéreis. (A) Modelo monocotiledônea Brachypodium distachyon, (B) leguminosa modelo Medicago truncatula, (C) dicotiledônea Solanum lycopersicum (tomate), (D) dicotiledônea Sorghum bicolor, (E) monocotiledônea Triticum aestivum (trigo). (F) Massa fresca das raízes e brotos das espécies cultivadas em frascos de vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 dias de idade) cultivada em condições de dias curtos. (A) Em arranjo estéril ou (B) inoculado por 12 dias com um consórcio de bactérias comensais. (C) Unidades formadoras de colônias para frascos estéreis (controle) e inoculados do substrato de crescimento (esquerda) e da raiz (direita). N = 4 frascos para a condição controle estéril e n = 8 frascos para a condição inoculada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Perfis distintos de exsudato radicular para A. thaliana Col-0 aos 21 dias de idade. Exsudatos foram coletados por 2 h em acetato de amônio 20 mM estéril (pH 5,7) seguido de coleta de 2 h em água deionizada filtrada estéril. Metabólitos foram detectados por espectrometria de massa usando injeção direta. (A) Análise de componentes principais de 436 metabólitos detectados acima do nível de fundo (comparação de frascos com plantas contra frascos sem plantas). CP: componente principal com a quantidade de variância explicada. Azul: exsudatos coletados em água, amarelo: exsudatos coletados com acetato de amônio. (B) Gráfico de pizza de 416 metabólitos significativamente diferentes entre as condições experimentais (teste de Tukey) colorido de acordo com a superclasse (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécie | Preparo de sementes | Tempo em etanol 70% (min) | Concentração de hipoclorito de sódio (NaClO) (v/v % água sanitária) | Tempo em água sanitária (min) | ||
| Arabidopsis thaliana | | 15 | Nenhum; 100% etanol | 15 | |||
| Desdestacamento de Brachypodium* | Descasca | 0.5 | 6 | 5 | ||
| Medicago truncatula*a | 30 | 6 | 30 | |||
| Solanum lycopersicum* | 0.5 | 6 | 5 | |||
| Sorgo bicolor* | Descasca | 0.5 | 6 | 30 | ||
| Triticum aestivum* | Descasca | 0.5 | 12 | 20 | ||
Tabela 1: Métodos de esterilização de sementes superficiais para múltiplas espécies. *Lavado 4-5x com água deionizada filtrada entre etanol e água sanitária e no final; umaincubação por 3-6 h após a água sanitária, substituindo por água deionizada filtrada a cada 30 min.
| Espécie | Dia para os frascos | Número de plantas |
| Brachypodium desprendimento | 4 a 5 anos | 3 |
| Sorgo bicolor | 4 a 5 anos | 3 |
| Triticum aestivum | | 4 a 5 anos | 2 |
| Medicago truncatula | | 5 a 6 anos | 3 |
| Solanum lycopersicum | 7 a 8 anos | 3 |
| Arabidopsis thaliana | | 17 | 3 a 5 anos |
Tabela 2: Idade das plântulas em dias para transferência para os vasos e número de plantas por vaso para as diversas espécies vegetais.
Discussion
O sistema experimental aqui apresentado é baseado em frascos de vidro e esferas de vidro e, portanto, fornece um sistema semihidropônico simples, de baixa manutenção e versátil para estudar a exsudação radicular em vários contextos. Tem sido utilizado em estudos que investigaram o perfil de exsudação de diferentes espécies vegetais25, as respostas da exsudação a diferentes condições de crescimento25, bem como a influência das propriedades físico-químicas do solo na exsudação22. O sistema é adequado para todas as espécies de plantas testadas aqui por longos períodos de crescimento, variando de semanas a meses. A manutenção das condições estéreis é simples, assim como a inoculação com bactérias, que persistem durante o período de crescimento de 2 semanas analisado. Assim, o sistema experimental não só permite uma coleta controlada de exsudatos radiculares em condições estéreis, mas também pode ser usado para estudar interações planta-micróbio. Além disso, os meios de crescimento das plantas podem ser variados para estudar as respostas metabólicas a diferentes níveis de nutrientes, e os períodos de crescimento podem ser ajustados adaptando-se as condições de luz ou usando frascos de tamanhos diferentes.
O estudo de exsudatos radiculares em condições hidropônicas ou semihidropônicas permanece padrão no campo, principalmente devido à resolução aprimorada de metabólitos de baixa concentração11. Muitas abordagens hidropônicas dependem de placas de Petri, placas de poços múltiplos ou outros recipientes pequenos que permitem esterilidade e alto rendimento, mas restringem a experimentação a pequenas plantas ou mudas cultivadas em ambientes de alta umidade 17,18,26,27. Na configuração do frasco de vidro apresentado, espaço suficiente na cabeça é fornecido pelos frascos comparativamente grandes, permitindo períodos de crescimento prolongados. As fitas de micropore garantem a troca de ar, mantendo a esterilidade. Assim, mesmo monocotiledôneas altas, como cevada e milho, podem ser cultivadas na configuração do frasco de vidro por várias semanas. Plantas pequenas como A. thaliana e trevo podem ser estudadas por 4-5 semanas após a germinação, incluindo os estágios vegetativo e reprodutivo.
Configurações hidropônicas alternativas também estão disponíveis para plantas maiores, mas muitas vezes requerem caixas e entradas feitas sob medida de malha, placas de espuma e cestos de enxertia para suporte de plantas 15,28,29,30. Além disso, esses dispositivos geralmente não são configurados para serem estéreis ou requerem procedimentos desafiadores de configuração e manutenção para mantê-los livres de contaminações microbianas e/ou químicas. A instalação e a manutenção da esterilidade no sistema experimental apresentado são simples. Além disso, o uso de vidro para frascos e miçangas reduz a presença de contaminantes lixiviantes dos plásticos e economiza recursos, pois pode ser facilmente lavado e reutilizado.
Contas de vidro foram aplicadas previamente para mimetizar partículas de solo. Induzem o desenvolvimento natural radicular em dispositivos de amostragem de exsudação radicular, como armadilhas de exsudação31 ou outros sistemas semihidropônicos19. A configuração do frasco de vidro aproveita esse desenvolvimento e introduz as contas como uma superfície de colonização para micróbios. No solo, o microbioma em torno das raízes das plantas evolui em um ambiente semissólido, com partículas compactas e espaços preenchidos com ar ou água. Embora a configuração do frasco de vidro não inclua a aeração ativa do meio de crescimento, devido à qual a fase líquida inferior provavelmente não contém níveis ideais de oxigênio, a combinação de um volume de contas maior com um volume de meio de crescimento menor cria uma fase superior úmida, mas aerada, onde os micróbios podem crescer sob condições óxicas. Outros propuseram agitar recipientes de crescimento26,28 ou usar tubulações acopladas a bombas de ar19,29 para manter o suprimento de ar em sistemas de crescimento hidropônico. No entanto, esses sistemas ou são configurados para não serem estéreis, ou requerem material especializado e vigilância constante para manter a esterilidade. Além disso, no caso de tremores, muito cuidado para evitar a submersão dos brotos em soluções de crescimento e danos aos sistemas radiculares. No entanto, se desejado, o arranjo experimental apresentado poderá ser adaptado com material adicional para aeração.
Um aspecto crucial a ser considerado em todos os estudos de interação planta-micróbio que investigam o metabolismo é que os micróbios degradam compostos derivados de plantas e produzem metabólitos por conta própria. Sem uma instalação experimental estéril especializada, não é possível distinguir entre metabólitos derivados de plantas e micróbios. Para inibir a atividade microbiana e enriquecer compostos derivados de plantas, Oburger e col. propuseram esterilizar quimicamente a solução de amostragem de exsudato radicular para inibir a degradação bacteriana32. O efeito dos inibidores químicos pôde ser estudado no sistema experimental apresentado, comparando-se perfis de exsudação de plantas estéreis e não estéreis tratadas com ou sem o inibidor.
Uma das principais limitações da configuração dos frascos de vidro apresentados é que as condições de crescimento permanecem muito artificiais em comparação com o solo. Exsudatos de plantas cultivadas no solo são frequentemente coletados de sistemas de percolação13, onde fluxos de solventes são coletados na base de recipientes de crescimento, ou de sistemas híbridos solo-hidropônico, onde as plantas são inicialmente cultivadas no solo e depois transferidas para condições hidropônicas 16,33. Em contraste com a configuração do frasco de vidro, esses procedimentos geralmente são destrutivos, não permitindo várias coletas ao longo do tempo em ambientes de crescimento em mudança. Além disso, enquanto em sistemas de percolação, o fundo do solo é amostrado juntamente com os exsudatos, em sistemas híbridos solo-hidropônicos o problema do alto fundo metabólico do solo é contornado com a transferência para condições hidropônicas para coleta de exsudato. Embora os tempos de recuperação tenham sido implementados para reduzir o vazamento de metabólitos através de raízes feridas11, a transferência de plantas é muito perturbadora e as feridas provavelmente persistirão, e o metabolismo das plantas pode mudar em resposta à transferência para condições hidropônicas. Além disso, em muitos casos, um choque osmótico é induzido pela transferência de plantas para água em vez de uma solução de crescimento adequada16,33. No protocolo apresentado, a solução de crescimento é trocada por uma solução equimolar para manter o equilíbrio osmótico, permitindo ainda captar a exsudação dentro de uma janela de tempo curta e definida. A troca da solução de crescimento é prática comum em muitos estudos publicados e pode ser facilmente obtida em montagens hidropônicas sem ferimento radicular 12,16,26,34. Devido à sua versatilidade, o sistema experimental apresentado pode ser facilmente adaptado para mimetizar condições mais naturais, por exemplo, utilizando extrato de solo estéril ou não estéril como solução de crescimento com ou sem a presença de partículas sólidas do solo. A mudança gradual para condições naturais permite o estudo do impacto das diferentes propriedades físico-químicas do solo e da presença microbiana sobre o metabolismo e a fisiologia das plantas. Antes que a comunidade científica tenha um bom entendimento da exsudação em vários ambientes, é desejável empregar sistemas baseados no solo e hidropônicos em paralelo, pois ambos os dispositivos têm suas vantagens e limitações13.
Em conclusão, o arranjo experimental semihidropônico à base de vidro apresentado destaca-se pela simplicidade aliada à alta versatilidade de aplicações. Apresenta-se como uma maneira acessível e de baixo custo de coletar e estudar exsudação em condições estéreis, ou em combinação com micróbios e interações planta-micróbio.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Prof. Dr. Nicola Zamboni e ao Prof. Dr. Uwe Sauer da ETH Zürich, Suíça, pela determinação dos perfis de exsudação radicular com injeção direta e ao Prof. Dr. Klaus Schläppi da Universidade de Basileia pela bactéria comensal A. thaliana . Além disso, agradecemos à Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 a J.S., apoiando S.M., A.S., E.M.S.) e ao programa PSC-Syngenta Fellowship (concedido ao Prof. Dr. Klaus Schläppi e J.S., apoiando C.J.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
| Aluminum foil | FORA GmbH | ||
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
| Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
| Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
| Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
| Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
| Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
| Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
| Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
| Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
| Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
| Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
| Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
| Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
| Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
| Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
| Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
| Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
| Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
| Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
| Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |
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