Summary
Denne protokol giver både kvalitative og kvantitative analyser af samlede siderophorer, pyoverdin og pyochelin fra Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) er kendt for sin produktion af en bred vifte af virulensfaktorer for at etablere infektioner i værten. En sådan mekanisme er rensning af jern gennem siderophorproduktion. P. aeruginosa producerer to forskellige siderophorer: pyochelin, som har lavere jernchelaterende affinitet, og pyoverdin, som har højere jernchelaterende affinitet. Denne rapport viser, at pyoverdin kan kvantificeres direkte fra bakterielle supernatanter, mens pyochelin skal ekstraheres fra supernatanter før kvantificering.
Den primære metode til kvalitativ analyse af siderophorproduktion er Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarpladeanalyse. I dette assay fører frigivelsen af CAS-farvestof fra Fe3+-farvestofkomplekset til en farveændring fra blå til orange, hvilket indikerer sideropforproduktion. Til kvantificering af det samlede antal siderophorer blev bakterielle supernatanter blandet i lige store mængder med CAS-farvestof i en mikrotiterplade efterfulgt af spektrofotometrisk analyse ved 630 nm. Pyoverdin blev kvantificeret direkte fra bakteriesupernatanten ved at blande den i lige store mængder med 50 mM Tris-HCl efterfulgt af spektrofotometrisk analyse. En top ved 380 nm bekræftede tilstedeværelsen af pyoverdin. Hvad angår pyochelin, var direkte kvantificering fra bakteriesupernatanten ikke mulig, så den måtte først ekstraheres. Efterfølgende spektrofotometrisk analyse afslørede tilstedeværelsen af pyochelin med en top ved 313 nm.
Introduction
Organismer kræver jern til at udføre forskellige vitale funktioner, såsom elektrontransport og DNA-replikation1. Pseudomonas aeruginosa, et gramnegativt opportunistisk patogen, er kendt for at have en række virulensfaktorer for at etablere infektion i værten, blandt hvilke en mekanisme er siderophordannelse2. Under jernnedbrydende forhold frigiver P. aeruginosa specialiserede molekyler kaldet siderophorer, som slukker jern fra det omgivende miljø. Siderophorer chelatjern ekstracellulært, og det resulterende ferric-siderophore-kompleks transporteres aktivt tilbage til cellen3.
P. aeruginosa er kendt for at producere to siderophorer, pyoverdin og pyochelin. Pyoverdin er kendt for at have en højere jernchelaterende affinitet (1:1), mens pyochelin er kendt for at have en mindre jernchelaterende affinitet (2:1)4. Pyochelin kaldes også en sekundær siderophor, fordi den har en lavere jernchelaterende affinitet5. Produktion og regulering af siderophorer styres aktivt af Quorum Sensing (QS) systemer i P. aeruginosa6.
Udover jernslukning er siderophorer også involveret i regulering af virulensfaktorer og spiller en aktiv rolle i biofilmdannelse7. Siderophorer tjener yderligere afgørende roller, herunder involvering i cellesignalering, forsvar mod oxidativ stress og facilitering af interaktioner mellem mikrobielle samfund8. Sideroforer kategoriseres typisk baseret på de specifikke funktionelle grupper, hvorigennem de chelerer jern. De tre primære bidentattestander i denne klassifikation er catecholat, hydroxamat og α-hydroxycarboxylat3. Pyoverdiner er kendetegnende for fluorescerende Pseudomonas-arter som P. aeruginosa og P. fluorescens5. De består af en blandet grøn fluorescerende kromofor koblet til et oligopeptid indeholdende 6-12 aminosyrer. Flere ikke-ribosomale peptidsyntetaser (NRP'er) er involveret i deres syntese9. Fire gener involveret i pyoverdin produktion og regulering er pvdL, pvdI, pvdJ og pvdD10. Pyoverdin er også ansvarlig for infektion og virulens hos pattedyr11. P. aeruginosa er kendt for at producere pyochelin i moderate jernbegrænsende betingelser, mens pyoverdin produceres under alvorlige jernbegrænsende miljøer12. To operoner involveret i pyochelinproduktion er pchDCBA og pchEFGHI13. Det bemærkes, at pyochelin (catecholat) i nærvær af pyocyanin inducerer oxidativ skade og betændelse og genererer hydroxylradikaler, som er skadelige for værtsvæv11.
Chrome Azurol Sulfonate (CAS) assay er bredt vedtaget på grund af dets omfattende, høje følsomhed og større bekvemmelighed sammenlignet med mikrobiologiske assays, som, selvom de er følsomme, kan være alt for specifikke14. CAS-analysen kan udføres på agaroverflader eller i en opløsning. Det er afhængig af den farveændring, der opstår, når jernionen overgår fra sit intense blå kompleks til orange. CAS-kolorimetriet assay kvantificerer udtømningen af jern fra et Fe-CAS-overfladeaktivt ternært kompleks. Dette særlige kompleks, der består af metal, organisk farvestof og overfladeaktivt middel, har en blå farve og udviser en absorptionstop ved 630 nm.
Denne rapport præsenterer en metode til kvalitativ påvisning af siderophorproduktion, hvor man kan detektere produktionen af siderophorer på en agarplade. Der er også tilvejebragt en metode til kvantitativ estimering af den samlede siderophorproduktion i en mikrotiterplade og påvisning og kvantitativ analyse af to siderophorer, pyoverdin og pyochelin, fra P. aeruginosa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle bakterieisolater af P. aeruginosa blev opnået fra medicinske mikrobiologiske laboratorier fra Vadodara og Jaipur, Indien. Alle udvalgte kliniske isolater blev håndteret i Biosafety Cabinet (BSL2), og der blev udvist yderste forsigtighed under håndtering af bakterieisolater under forsøgene. De kommercielle detaljer for alle reagenser/opløsninger findes i materialetabellen.
1. Fremstilling af Chrome Azurol Sulfonate (CAS) farvestof og agarmedier
- Forbered CAS-farvestof (100 ml) med følgende sammensætning:
- 60 mg CAS opløses i 50 ml destilleret vand (opløsning 1).
- 2,7 mgFeCl3·6H2Oopløses i 10 ml 10 mM HCl (opløsning 2).
- 73 mg cetrimoniumbromid (HDTMA) opløses i 40 ml destilleret vand (opløsning 3).
- Bland forsigtigt Løsning 1, Løsning 2 og Løsning 3. Opbevar det i en glasflaske.
- Forbered CAS-agar ved at følge nedenstående trin:
- Tilsæt 100 ml MM9 saltopløsning til 750 ml destilleret vand.
- 32,24 g piperazin-N,N'-bis(2-ethanesulfonsyre) (PIPES) fri syre opløses.
- Tilsæt 15 g agaragar. Autoklave og lad det køle af.
- Tilsæt 30 ml steril Casaminosyreopløsning og 10 ml steril 20% glucoseopløsning til blandingen.
- Tilsæt 100 ml CAS-farvestof, bland og hæld det under aseptiske forhold.
BEMÆRK: Fremstilling af MM9-medier, Casaminosyreopløsning og 8-hydroxyquinolin findes i supplerende fil 1. PIPES buffer er pH-følsom. Det opløses ikke, før pH 5,6 er opnået. Sørg for, at pH-værdien konstant overvåges, for når PIPES begynder at opløses i vand, vil det sænke pH-værdien yderligere. Uddrag Casaminosyre med samme volumen af 3% 8-hydroxyquinolin opløst i chloroform. Den ublandbare opløsning henstår ved 4 °C i ca. 20 minutter og opsamler forsigtigt den øverste fase af opløsningen uden at forstyrre den nedre fase.
2. Kvalitativ analyse af siderophorer produktion
- Indstil OD600 nm til 0,2 for 24 timers dyrkede kulturer af P. aeruginosa.
- Brug en steril trådsløjfe til at stribe bakteriekulturen på en CAS-agarplade.
- Der inkuberes ved 30 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Peptonvandmedier eller 0,8% normalt saltvand kan bruges til at fortynde bakteriekulturen. Hvis der ikke observeres bakterievækst ved 24 timer, inkuberes CAS-plader i 48 til 72 timer.
3. Kvantitativt skøn over det samlede antal siderophorer
- 24 timers dyrkede kulturer af P. aeruginosa podes igen i peptonvandmedier efter justering af OD600 nm til 0,25, og der inkuberes ved 30 °C i 48 timer.
- Efter 48 timer centrifugeres bakteriekulturen ved 4650 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter centrifugeringen tilsættes 100 μL cellefri supernatant til en mikrotiterplade med 96 huller, og der tilsættes 100 μL CAS-farvestof.
- Dæk pladen med aluminiumsfolie og inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
- Efter inkubation tages spektrofotometriske aflæsninger ved 630 nm.
- Beregn de opnåede resultater til kvantificering af samlede siderophorer som procent siderophorenhed (PSU).
BEMÆRK: PSU kan beregnes som: [(Ar - As)/Ar] x 100
hvor, Ar = referencens absorbans ved 630 nm, As = absorbans af prøvens cellefrie supernatant. Til reference skal CAS-farvestof tilsættes til ikke-inokulerede peptonvandmedier. Fyld alle glasvarer, såsom reagensglas, kolber osv., med 6 M HCI i 2 timer og skyl dem to gange med destilleret vand for at fjerne eventuelle spor af jern på dem.
4. Kvantitativt skøn over pyoverdin
- 24 timers dyrkede kulturer af P. aeruginosa podes igen i peptonvandmedier efter justering af OD600 nm til 0,25 og inkuberes ved 30 °C i 48 timer.
- Efter 48 timer måles OD600 nm af bakterievæksten, inden du fortsætter.
- Centrifuger bakteriekulturen ved 4650 x g i 10 min ved stuetemperatur.
- Efter centrifugeringen tilsættes 100 μL cellefri supernatant til en mikrotiterplade med 96 huller, og der tilsættes 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8,0).
- Tag spektrofotometriske aflæsninger ved OD405 nm.
5. Pyochelinekstraktion og spektrofotometri
- 24 timers dyrkede kulturer af P. aeruginosa geninokuleres i King's B-medier (supplerende fil 1) efter justering af OD600 nm til 0,25 og inkuberes ved 30 °C i 24 timer.
- Efter 24 timer tages 100 ml kultur og centrifugeres ved 4650 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter centrifugeringen tilsættes 5 ml 1 M citronsyre til supernatanten. Der ekstraheres to gange med 50 ml ethylacetat.
- Filtrer den organiske fase med magnesiumsulfat gennem et sprøjtefilter. Den filtrerede organiske fase opbevares ved -20 °C.
- Tag spektrofotometriske aflæsninger ved 320 nm.
BEMÆRK: Da pyochelin er en meget ustabil forbindelse ved stuetemperatur, skal du udføre ekstraktionsprocessen på is. Brug en 50 ml steril sprøjte til filterseparation. Placer bomuld på spidsen af sprøjten og tilsæt 1 g magnesiumsulfat på den. Fastgør et sterilt sprøjtefilter ved spidsen af sprøjten, og opsaml filtratet i et sterilt rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før kvantificering af siderophorer fra kliniske isolater blev der udført en kvalitativ screening for siderophorproduktion for at sikre siderophoreproduktion. Kvalitativ påvisning af siderophorer fra kliniske isolater blev observeret ved stribede bakterier på CAS-agarplader. Tre kliniske isolater, nemlig MR1, TL7, J3, sammen med PAO1 (referencestammen), blev udvalgt til undersøgelsen. Alle tre kliniske isolater og PAO1 viste positive resultater for siderophorproduktion, hvor en klar orange halo omkring bakterievæksten på den blå agaroverflade indikerede positiv siderophorproduktion (figur 1). Halodannelsen på CAS-agaren (figur 1) gav et groft skøn over siderophorproduktionen af kliniske isolater. Derfor blev der foretaget kvantitativ estimering af siderophorproduktion ved anvendelse af CAS-reagens og flydende medier.
Total siderophorkvantificering blev udført direkte fra den cellefrie supernatant. Efter inkubation blev der observeret en farveændring, hvor gul farve indikerede fjernelse af CAS-farvestof fra Fe-komplekset. Her blev CAS-farvestof med uinokulerede vækstmedier anvendt som kontrol, hvilket blev taget til siderophores beregning. Der var ingen signifikant forskel i den totale siderophorproduktion i isolaterne MR1 og TL7, mens der var en signifikant total siderophorproduktion i J3 sammenlignet med PAO1 (figur 2).
Dernæst blev pyoverdinkvantificering udført direkte fra cellefrie supernatanter. Pyoverdiner frigives i cellemiljøer, så den cellefrie supernatant blev brugt til kvantificering af pyoverdin. Der blev også udført en UV-områdescanning med spektrofotometeret, hvor toppen ved 380 nm bekræftede tilstedeværelsen af pyoverdin (figur 3A). Spektrofotometriske aflæsninger blev taget ved 405 nm, og resultaterne blev fortolket som OD405/OD600 nm. Alle isolater viste pyoverdinproduktion, hvor isolaterne MR1 og J3 viste signifikant lavere pyoverdin sammenlignet med PAO1, mens der ikke blev observeret nogen signifikant forskel for TL7 (figur 3B).
Pyochelin kan ikke kvantificeres direkte fra den cellefrie supernatant. Det var ikke muligt at ekstrahere pyochelin fra 1 ml cellefri supernatant, så det blev ekstraheret fra 100 ml cellefri supernatant. Det blev syrnet med 1 M citronsyre. Da pyochelin er en meget ustabil forbindelse, blev ekstraktionsprocessen udført på is. Pyochelindetektion blev udført ved at køre en UV-områdescanning fra et område på 300 til 600 nm, hvor toppen ved OD320 nm bekræftede tilstedeværelsen af pyochelin (figur 4A). Pyochelinkvantificering blev udført ved at tage spektrofotometriske aflæsninger ved OD320 nm. Beregningerne blev foretaget ved at dividere OD320/OD600. Isolaterne MR1, TL7 og J3 viste signifikant højere produktion af pyochelin sammenlignet med referenceisolatet PAO1 (figur 4B).
Sammenlignende siderophorproduktion i forskellige bakterielle vækstmedier blev udført for at kontrollere mængden af samlede siderophorer produceret i forskellige vækstmedier. Fire forskellige medier blev udvalgt, hvor Luria bouillon, King's B media og Peptone vand blev ekstraheret med 3% 8-hydroxyquinolin, og uekstraheret Luria bouillon blev udvalgt til undersøgelsen. Der var ingen signifikant forskel mellem siderophorproduktion i ekstraheret Luria-bouillon, King's B-medier og Peptone-vandmedier, mens der blev observeret en signifikant forskel for siderophorproduktion i uekstraheret Luria-bouillon.
Figur 1: Sideroforproduktion på CAS-agar. Vækst af P. aeruginosa på CAS-agarplader af 24-timers dyrkede kulturer blev spottet på CAS-agarplader og inkuberet ved 30 °C i 24 timer. Siderophore tilstedeværelse er indikeret af en orange halo omkring bakteriekolonien (PAO1, MR1, TL7 og J3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Samlet sideroforproduktion. Den samlede siderophorproduktion blev vurderet for PAO1 og tre kliniske isolater (MR1, TL7 og J3). 100 μL cellefri supernatant (af PAO1, MR1, TL7 og J3 dyrket i 24 timer i peptonvandsbouillon) blev tilsat til en mikrotiterplade med 96 huller, hvorefter der blev tilsat 100 μL CAS-farvestof. Envejs ANOVA test blev udført for statistisk signifikans. Fejlbjælker repræsenterer ± standardafvigelse (SD) mellem tre biologiske replikater. *svarer til p < 0,05; ns svarer til p > 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Produktion af pyoverdin. Pyoverdinproduktion af P. aeruginosa-stamme PAO1 og kliniske isolater (MR1, TL7 og J3) vurderet efter 24 timers vækst i peptonvandmedier. Bakteriekulturerne blev centrifugeret, og 100 μL cellefri supernatant blev tilsat til en 96-brønds mikrotiterplade. Derefter blev der tilsat 100 μL 50 mM Tris-HCI (pH 8,0). Pyoverdindetektion blev udført ved UV-spektrofotometri med et område på 350 nm til 600 nm. Spektrometrisk analyse ved 380 nm pyoverdinproduktion (A). Kvantificering af pyoverdinproduktion (B). Fejlbjælker angiver standardfejlen i forhold til gennemsnittet af tredobbelte eksperimenter. Fejlbjælker repræsenterer ± SD mellem tre biologiske replikater. svarer til p < 0,0001, **svarer til p < 0,01, og ns svarer til p > 0,05 baseret på envejs ANOVA test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Produktion af pyochelin. Pyochelinproduktion af PAO1 (anvendt som reference) og kliniske isolater (MR1, TL7 og J3) ved anvendelse af ekstraktion med ethylacetat og magnesiumsulfat. Spektrofotometrisk analyse med et interval fra 230 nm til 400 nm (A). Kvantificering af pyochelin (B). Tre uafhængige forsøg blev udført for hvert isolat. Fejlbjælker repræsenterer ± SD mellem tre biologiske replikater. svarer til p < 0,001 baseret på envejs ANOVA test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Sammenlignende siderophorproduktion i forskellige bakterielle vækstmedier. Samlet siderophorproduktion i fire forskellige vækstmedier, hvor King's B-medier, Peptone-vandmedier og Luria-bouillon blev ekstraheret med 3% 8-hydroxyquinolin for at fjerne spor af jern fra det, og Luria-bouillon (uekstraheret) blev valgt. Ekstraktion med 3% 8-hydroxyquinolin blev udført ved at tilsætte et lige volumen af 3% 8-hydroxyquinolin til mediet. Fejlbjælker repræsenterer ± SD mellem tre biologiske replikater. **svarer til p < 0,001, og ns svarer til p > 0,5 baseret på envejs ANOVA test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Medieopskrifter anvendt til nærværende undersøgelse. Klik her for at se filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol gør det muligt for forskere at kvantificere det samlede antal siderophorer og to forskellige siderophorer af P. aeruginosa, nemlig pyoverdin og pyochelin, fra den bakteriecellefrie supernatant. I CAS-agarpladeanalysen danner CAS-farvestof og Fe3+-ioner et kompleks. Når bakterier producerer siderophorer, slukker de Fe3 + ioner fra CAS-Fe3 + komplekset, hvilket fører til en farveændring omkring bakterievæksten. Denne ændring resulterer i en klar orange glorie omkring bakterievæksten14,15. Mens bakterier kan stribe direkte på CAS-agarplader, kan de samlede resultater blive påvirket. Striber af et stort antal bakterieceller kan skabe en bred orange glorie omkring bakterievæksten, mens brug af færre bakterieceller kan resultere i en smal klar zone. For at løse dette streaked vi et ensartet antal bakterieceller ved at justere OD600. Hurtige bakterier kan vise resultater i 24 timer, mens langsomt voksende bakterier kan tage mere end 72 timer at demonstrere siderophorproduktion.
Til kvantitativ bestemmelse af det samlede antal siderophorer blev der oprindeligt anvendt klassisk spektroskopi, hvilket nødvendiggør en betydelig mængde supernatant til siderofordetektion, hvilket gør det upraktisk. Kvantificeringen af det samlede antal siderophorer udføres nu ved hjælp af en 96-brønds plade med et modificeret CAS-assay. Denne fremgangsmåde har resulteret i en reduktion i brugen af reagenser, bakteriel supernatant, tid og øget nøjagtighed sammenlignet med traditionelle spektroskopiske metoder16. Andre undersøgelser har også rapporteret brugen af mikrotiterplader som en tidsbesparende og mere effektiv metode17. Kvantificering af samlede siderophorer ved hjælp af en mikrotiterplade har vist sig at være en effektiv tilgang. I denne undersøgelse blev 48 timer gamle bakteriekulturer dyrket i jernfrie medier udvalgt til undersøgelse. En sammenlignende undersøgelse blev også udført for at vurdere siderophorproduktion i forskellige vækstmedier, såsom Luria Broth, Luria Broth (ekstraheret med 3% 8-hydroxyquinolin), King's B-medier (ekstraheret med 3% 8-hydroxyquinolin) og Peptone vandmedier (ekstraheret med 3% 8-hydroxyquinolin). Det blev observeret, at Peptone vandmedier udviste den højeste mængde siderophorproduktion, og det blev således udvalgt til yderligere eksperimenter. En graf, der viser sideroforproduktionen i forskellige vækstmedier, er medtaget i supplerende figur 1.
Pyoverdin kan påvises og kvantificeres ved hjælp af spektrofluorimetriske aflæsninger, men kun pyoverdin vides at udvise fluorescens. Pyoverdin i kompleks med Fe3+ ioner udviser ikke fluorescens18,19. Til påvisning og kvantificering af pyoverdin blev 48 timer gamle bakteriekulturer udvalgt til undersøgelse. P. aeruginosa er kendt for at producere pyochelin under indledende jern-sultende betingelser og skifter til pyoverdin produktion efter udsættelse for alvorlige jern-stress betingelser. Det er blevet påvist, at pyoverdin kan chelere andre metalliske kationer, såsom aluminium, gallium, mangan og krom, men kun jern transporteres med succes til cellemembranen19.
I lighed med det samlede antal siderophorer og pyoverdin kan pyochelin ikke kvantificeres direkte fra cellefri supernatant og skal ekstraheres ved hjælp af dichlormethan20. Dichlormethan er ublandbar med den cellefrie supernatant og danner et separat lag i bunden. I denne undersøgelse blev forskellige næringsmedier testet, herunder Luria bouillon, Peptonvand og Casaminosyremedier, men en betydelig mængde pyochelin blev opnået fra Kings B-medier. Mens Hoegy et al. havde brugt CAA-medier i deres protokol, ændrede vi det med King's B-medier, da CAA-medier ikke understøttede bakterievækst21. Metoden blev yderligere modificeret ved at ekstrahere næringsmedier med 8-hydroxyquinolin for at fjerne eventuelle jernrester fra medierne, hvilket skabte et jernmangelmedium. Derudover viste inkubationstiden sig at påvirke pyochelinproduktionen betydeligt. Dumas et al. påviste, at P. aeruginosa skifter fra pyochelin til pyoverdinproduktion under svære jernbegrænsende forhold12. I denne undersøgelse blev pyochelinekstraktion og påvisning udført fra 24-timers gamle bakteriekulturer, da pyochelin ikke blev påvist i 48-timers kulturer. Supernatantens volumen påvirker også pyochelindetektionen, og der blev således anvendt 100 ml cellefri supernatant til ekstraktion. Desuden var pyochelinproduktionen signifikant højere i MR1-, TL7- og J3-isolater, muligvis på grund af bakteriestammer, der ikke er i stand til at producere pyoverdin på trods af at de har potente jernkelatorer22.
Ji et al. introducerede en ny og følsom tilgang til pyochelinkvantificering og validerede den ved hjælp af LC / MS / MS. Denne metode blev dog kun anvendt på P. aeruginosa-isolater fra sputum hos patienter med cystisk fibrose. LC/MS/MS, der er en dyr opsætning, er muligvis ikke overkommelig for de fleste laboratorier23. Visaggio et al. udviklede en bioluminescerende helcellebaseret biosensor, som muliggør hurtig, følsom og ettrins pyochelinkvantificering. Denne metode kan imidlertid ikke give kvantificering for det samlede antal siderophorer og pyoverdin24.
Siderophore jernoptagelsessystemer kan have en antimikrobiel anvendelse i lægemiddelafgivelse til multiresistente bakterier, da de spiller en afgørende rolle i bakteriel overlevelse og virulens. Denne fremgangsmåde kan være en ny måde at bekæmpe multiresistente bakterierpå 25. Lægemidler, der ikke kan trænge ind i bakteriecellemembranen, kan forbindes med en siderophore, og det resulterende Fe-siderophore-kompleks kan transporteres inde i bakteriemembranen26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfattere anerkender finansiering fra DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program og FIST. MR tak stipendium modtaget fra SHODH. HP takker stipendium modtaget fra CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K.
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J.
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
