Summary
يوفر هذا البروتوكول تحليلات نوعية وكمية لإجمالي siderophores و pyoverdine و pyochelin من Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
تشتهر الزائفة الزنجارية (P. aeruginosa) بإنتاجها لمجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف. إحدى هذه الآليات هي كسح الحديد من خلال إنتاج siderophore. تنتج P. aeruginosa نوعين مختلفين: pyochelin ، الذي لديه تقارب مخلب أقل للحديد ، و pyoverdine ، الذي لديه تقارب مخلب أعلى للحديد. يوضح هذا التقرير أنه يمكن قياس البيوفيردين مباشرة من المواد الطافية البكتيرية ، بينما يحتاج البيوشلين إلى استخلاصه من المواد الطافية قبل القياس الكمي.
الطريقة الأساسية للتحليل النوعي لإنتاج siderophore هي مقايسة لوحة أجار كروم أزورول سلفونات (CAS). في هذا الفحص ، يؤدي إطلاق صبغة CAS من مركب Fe3+-Dye إلى تغيير اللون من الأزرق إلى البرتقالي ، مما يشير إلى إنتاج siderophore. من أجل القياس الكمي للسيدروفورات الكلية ، تم خلط المواد الطافية البكتيرية بنسب متساوية مع صبغة CAS في لوحة عيار ميكروي ، متبوعة بالتحليل الطيفي عند 630 نانومتر. تم قياس Pyoverdine مباشرة من المادة الطافية البكتيرية عن طريق مزجها بنسب متساوية مع 50 mM Tris-HCl ، متبوعا بالتحليل الطيفي. أكدت ذروة عند 380 نانومتر وجود البيوفيردين. أما بالنسبة ل Pyochelin ، فلم يكن القياس الكمي المباشر من الطافية البكتيرية ممكنا ، لذلك كان لا بد من استخراجه أولا. كشف التحليل الطيفي اللاحق عن وجود pyochelin ، مع ذروة عند 313 نانومتر.
Introduction
تحتاج الكائنات الحية إلى الحديد لأداء وظائف حيوية مختلفة ، مثل نقل الإلكترونات وتضاعف الحمض النووي1. من المعروف أن Pseudomonas aeruginosa ، وهو أحد مسببات الأمراض الانتهازية سالبة الجرام ، يمتلك مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف ، من بينها آلية واحدة هي تكوين siderophore2. خلال ظروف استنفاد الحديد ، تطلق P. aeruginosa جزيئات متخصصة تسمى siderophores ، والتي تروي الحديد من البيئة المحيطة. Siderophores يخلب الحديد خارج الخلية ، ويتم نقل مجمع ferric-siderophore الناتج بنشاط إلى الخلية3.
من المعروف أن P. aeruginosa تنتج اثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin. من المعروف أن البيوفيردين لديه تقارب مخلب أعلى للحديد (1: 1) ، بينما من المعروف أن البيوشلين له تقارب مخلب أقل للحديد (2: 1) 4. يطلق على Pyochelin أيضا اسم siderophore الثانوي لأنه يحتوي على تقارب مخلب أقل منالحديد 5. يتم التحكم في إنتاج وتنظيم siderophores بنشاط بواسطة أنظمة استشعار النصاب (QS) في P. aeruginosa6.
إلى جانب تبريد الحديد ، تشارك siderophores أيضا في تنظيم عوامل الفوعة وتلعب دورا نشطا في تكوين الأغشية الحيوية7. تخدم Siderophores أدوارا حاسمة إضافية ، بما في ذلك المشاركة في إشارات الخلية ، والدفاع ضد الإجهاد التأكسدي ، وتسهيل التفاعلات بين المجتمعات الميكروبية8. عادة ما يتم تصنيف Siderophores بناء على المجموعات الوظيفية المحددة التي يخلبون من خلالها الحديد. الروابط الثلاثة الأولية في هذا التصنيف هي التصنيف ، والهيدروكسيمات ، و α-هيدروكسي كربوكسيلات3. Pyoverdines هي السمات المميزة لأنواع Pseudomonas الفلورية مثل P. aeruginosa و P. fluorescens5. وهي تتكون من كروموفور فلوري أخضر مختلط مقترن بقليل الببتيد يحتوي على 6-12 من الأحماض الأمينية. تشارك العديد من توليفات الببتيد غير الريبوسومية (NRPs) في تخليقها9. أربعة جينات تشارك في إنتاج وتنظيم البيوفيردين هي pvdL و pvdI و pvdJ و pvdD10. Pyoverdine مسؤول أيضا عن العدوى والفوعة في الثدييات11. يلاحظ أن P. aeruginosa تنتج البيوشلين في ظروف معتدلة تحد من الحديد ، بينما يتم إنتاج البيوفيردين خلال البيئات الشديدة التي تحد من الحديد12. اثنان من الأوبيرونات المشاركة في إنتاج pyochelin هما pchDCBA و pchEFGHI13. تجدر الإشارة إلى أنه في وجود البيوسيانين ، يؤدي البيوشلين (التصنيف) إلى تلف الأكسدة والالتهابات ويولد جذور الهيدروكسيل الضارة بالأنسجة المضيفة11.
تم اعتماد مقايسة كروم أزورول سلفونات (CAS) على نطاق واسع نظرا لشموليتها وحساسيتها العالية وملاءمتها الأكبر مقارنة بالمقايسات الميكروبيولوجية ، والتي ، على الرغم من حساسيتها ، يمكن أن تكون محددة بشكل مفرط14. يمكن إجراء اختبار CAS على أسطح أجار أو في محلول. يعتمد على تغير اللون الذي يحدث عندما ينتقل أيون الحديديك من مركبه الأزرق المكثف إلى اللون البرتقالي. يحدد الفحص اللوني CAS استنفاد الحديد من مركب ثلاثي الفاعل بالسطح Fe-CAS. هذا المركب الخاص ، الذي يتكون من المعدن والصبغة العضوية والسطحي ، له لون أزرق ويظهر ذروة امتصاص عند 630 نانومتر.
يقدم هذا التقرير طريقة للكشف النوعي عن إنتاج siderophore ، حيث يمكن للمرء اكتشاف إنتاج siderophores على لوحة أجار. كما يتم توفير طريقة للتقدير الكمي لإجمالي إنتاج siderophore في لوحة microtiter والكشف والتحليل الكمي لاثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin ، من P. aeruginosa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على جميع العزلات البكتيرية ل P. aeruginosa من مختبرات علم الأحياء الدقيقة الطبية من فادودارا وجايبور ، الهند. تم التعامل مع جميع العزلات السريرية المختارة في خزانة السلامة الحيوية (BSL2) وتم توخي أقصى درجات الحذر أثناء التعامل مع العزلات البكتيرية أثناء التجارب. يتم توفير التفاصيل التجارية لجميع الكواشف / الحلول في جدول المواد.
1. تحضير صبغة كروم أزورول سلفونات (CAS) ووسائط أجار
- تحضير صبغة CAS (100 مل) بالتركيب التالي:
- قم بإذابة 60 مجم من CAS في 50 مل من الماء المقطر (الحل 1).
- قم بإذابة 2.7 مجم من FeCl3 · 6H2O في 10 مل من 10 mM HCl (محلول 2).
- قم بإذابة 73 مجم من بروميد السيتريمونيوم (HDTMA) في 40 مل من الماء المقطر (محلول 3).
- امزج بعناية الحل 1 والحل 2 والحل 3. تخزينها في زجاجة.
- قم بإعداد CAS agar باتباع الخطوات التالية:
- أضف 100 مل من محلول الملح MM9 إلى 750 مل من الماء المقطر.
- قم بإذابة 32.24 جم من حمض بيبيرازين-N، N'-bis (2-إيثان سلفونيك حمض) (PIPES).
- أضف 15 جم من أجار أجار. الأوتوكلاف واتركه ليبرد.
- أضف 30 مل من محلول حمض الكازامينو المعقم و 10 مل من محلول الجلوكوز المعقم بنسبة 20٪ إلى الخليط.
- أضف 100 مل من صبغة CAS واخلطها واسكبها في ظروف معقمة.
ملاحظة: يتم توفير تحضير وسائط MM9 ومحلول حمض الكازامينو و8-هيدروكسيكينولين في الملف التكميلي 1. المخزن المؤقت PIPES حساس لدرجة الحموضة. لن يذوب حتى يتم تحقيق الرقم الهيدروجيني 5.6. تأكد من مراقبة الرقم الهيدروجيني باستمرار لأنه عندما تبدأ الأنابيب في الذوبان في الماء ، فإنها ستزيد من خفض درجة الحموضة. استخراج حمض Casamino مع نفس الحجم من 3 ٪ 8-هيدروكسي كينولين المذاب في الكلوروفورم. اترك المحلول غير القابل للامتزاج عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا واجمع المرحلة العليا من المحلول بعناية دون الإخلال بالمرحلة السفلية.
2. التحليل النوعي لإنتاج siderophores
- اضبط OD600 نانومتر على 0.2 لمزارع P . aeruginosa المزروعة لمدة 24 ساعة.
- باستخدام حلقة سلكية معقمة ، قم بخط الثقافة البكتيرية على لوحة أجار CAS.
- احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن استخدام وسائط مياه الببتون أو محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.8٪ لتخفيف الثقافة البكتيرية. إذا لم يلاحظ نمو البكتيريا في 24 ساعة ، احتضان لوحات CAS لمدة 48 إلى 72 ساعة.
3. التقدير الكمي لإجمالي siderophores
- إعادة تلقيح المستنبتات المزروعة لمدة 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط مياه Peptone بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- بعد 48 ساعة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بزراعة البكتيريا عند 4650 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار ميكرو 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من صبغة CAS إليها.
- غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- بعد الحضانة ، خذ قراءات طيفية عند 630 نانومتر.
- احسب النتائج التي تم الحصول عليها لتحديد كمية إجمالي siderophores كنسبة مئوية لوحدة siderophore (PSU).
ملاحظة: يمكن حساب PSU على النحو التالي: [(Ar - As) / Ar] × 100
حيث ، Ar = امتصاص المرجع عند 630 نانومتر ، As = امتصاص الطافي الخالي من الخلايا للعينة. كمرجع ، يجب إضافة صبغة CAS إلى وسائط مياه الببتون غير الملقحة. املأ جميع الأواني الزجاجية ، مثل أنابيب الاختبار والقوارير وما إلى ذلك ، ب 6 M HCl لمدة 2 ساعة واشطفها مرتين بالماء المقطر لإزالة أي أثر للحديد عليها.
4. التقدير الكمي للبيوفردين
- إعادة تلقيح المستنبتات المزروعة على مدار 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط مياه Peptone بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- بعد 48 ساعة ، قم بقياس OD600 نانومتر من نمو البكتيريا قبل المضي قدما.
- أجهزة الطرد المركزي الثقافة البكتيرية في 4650 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار ميكرو ذات 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من 50 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) إليها.
- خذ قراءات طيفية عند OD405 نانومتر.
5. استخراج Pyochelin وقياس الطيف الضوئي
- إعادة تلقيح المستزرعات المزروعة لمدة 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط King's B (الملف التكميلي 1) بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة ، خذ 100 مل من الثقافة وأجهزة الطرد المركزي عند 4650 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي ، أضف 5 مل من 1 M حامض الستريك إلى المادة الطافية. استخراج مرتين مع 50 مل من خلات الإيثيل.
- تصفية المرحلة العضوية مع كبريتات المغنيسيوم من خلال مرشح حقنة. قم بتخزين المرحلة العضوية المفلترة عند -20 درجة مئوية.
- خذ قراءات طيفية عند 320 نانومتر.
ملاحظة: نظرا لأن البيوشلين مركب غير مستقر للغاية في درجة حرارة الغرفة ، فقم بإجراء عملية الاستخراج على الجليد. استخدم حقنة معقمة سعة 50 مل لفصل الفلتر. ضع القطن على طرف المحقنة وأضف 1 جم من كبريتات المغنيسيوم عليه. ثبت مرشح حقنة معقم عند طرف المحقنة واجمع المرشح في أنبوب معقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل القياس الكمي للسيدروفورات من العزلات السريرية ، تم إجراء فحص نوعي لإنتاج siderophore لضمان إنتاج siderophores. لوحظ الكشف النوعي عن siderophores من العزلات السريرية عن طريق خطوط البكتيريا على ألواح أجار CAS. تم اختيار ثلاث عزلات سريرية ، وهي MR1 و TL7 و J3 ، جنبا إلى جنب مع PAO1 (السلالة المرجعية) ، للدراسة. أظهرت جميع العزلات السريرية الثلاثة و PAO1 نتائج إيجابية لإنتاج siderophore ، حيث أشارت هالة برتقالية صافية حول النمو البكتيري على سطح أجار الأزرق إلى إنتاج siderophore إيجابي (الشكل 1). أعطى تكوين الهالة على أجار CAS (الشكل 1) تقديرا تقريبيا لإنتاج siderophore بواسطة العزلات السريرية. ومن ثم ، تم إجراء تقدير كمي لإنتاج siderophore باستخدام كاشف CAS والوسائط السائلة.
تم إجراء القياس الكمي الكلي siderophore مباشرة من طاف الخلية الحرة. بعد الحضانة ، لوحظ تغير في اللون حيث أشار اللون الأصفر إلى إزالة صبغة CAS من مجمع Fe. هنا ، تم استخدام صبغة CAS مع وسائط النمو غير الملقحة كعنصر تحكم ، والذي تم أخذه لحساب siderophores. لم يكن هناك فرق كبير في إجمالي إنتاج siderophore في العزلات MR1 و TL7 ، في حين كان هناك إنتاج إجمالي كبير من siderophore في J3 مقارنة ب PAO1 (الشكل 2).
بعد ذلك ، تم إجراء القياس الكمي pyoverdine مباشرة من المواد الطافية الخالية من الخلايا. يتم إطلاق البيوفردين في بيئات الخلايا ، لذلك تم استخدام الطافي الخالي من الخلايا لتحديد كمية البيوفيردين. كما تم إجراء مسح لنطاق الأشعة فوق البنفسجية بواسطة مقياس الطيف الضوئي ، حيث أكدت الذروة عند 380 نانومتر وجود pyoverdine (الشكل 3A). تم أخذ القراءات الطيفية عند 405 نانومتر ، وتم تفسير النتائج على أنها OD405 / OD600 نانومتر. أظهرت جميع العزلات إنتاج البيوفيردين ، حيث أظهرت العزلات MR1 و J3 انخفاض البيوفدين بشكل ملحوظ مقارنة ب PAO1 ، بينما لم يلاحظ فرق كبير في TL7 (الشكل 3 ب).
لا يمكن قياس Pyochelin مباشرة من المادة الطافية الخالية من الخلايا. لم يكن من الممكن استخراج البيوشلين من 1 مل من المادة الطافية الخالية من الخلايا ، لذلك تم استخراجها من 100 مل من المادة الطافية الخالية من الخلايا. تم تحمضه بحمض الستريك 1 M. نظرا لأن البيوشلين مركب غير مستقر للغاية ، فقد تم إجراء عملية الاستخراج على الجليد. تم إجراء اكتشاف Pyochelin عن طريق إجراء مسح نطاق الأشعة فوق البنفسجية من نطاق 300 إلى 600 نانومتر ، حيث أكدت الذروة عند OD320 نانومتر وجود pyochelin (الشكل 4A). تم إجراء القياس الكمي Pyochelin عن طريق أخذ قراءات طيفية ضوئية عند OD320 نانومتر. تم إجراء الحسابات بقسمة التوجيه التنفيذي320 / التوجيه التنفيذي600. أظهرت العزلات MR1 و TL7 و J3 إنتاجا أعلى بكثير من البيوشلين مقارنة بالعزلة المرجعية PAO1 (الشكل 4 ب).
تم إجراء إنتاج siderophore المقارن في وسائط النمو البكتيرية المختلفة للتحقق من كمية siderophores الكلية المنتجة في وسائط النمو المختلفة. تم اختيار أربع وسائط مختلفة ، حيث تم استخراج مرق لوريا ، ووسائط King's B ، وماء البيبتون بنسبة 3٪ 8-هيدروكسيكينولين ، وتم اختيار مرق لوريا غير المستخرج للدراسة. لم يكن هناك فرق كبير بين إنتاج siderophore في مرق لوريا المستخرج ، ووسائط King's B ، ووسط مياه Peptone ، في حين لوحظ اختلاف كبير في إنتاج siderophore في مرق لوريا غير المستخرج.
الشكل 1: إنتاج Siderophore على أجار CAS. تم رصد نمو P. aeruginosa على ألواح أجار CAS من المستنبتات المزروعة على مدار 24 ساعة على ألواح أجار CAS وتم تحضينها عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. يشار إلى وجود Siderophore بهالة برتقالية حول المستعمرة البكتيرية (PAO1 و MR1 و TL7 و J3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجمالي إنتاج siderophores. تم تقييم إجمالي إنتاج siderophore ل PAO1 وثلاث عزلات سريرية (MR1 و TL7 و J3). تمت إضافة 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا (من PAO1 و MR1 و TL7 و J3 المزروعة لمدة 24 ساعة في مرق ماء الببتون) إلى صفيحة عيار ميكرو 96 بئرا ، وبعد ذلك تمت إضافة 100 ميكرولتر من صبغة CAS إليها. تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه للدلالة الإحصائية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD) ± بين ثلاث نسخ متماثلة بيولوجية. * يتوافق مع p < 0.05 ؛ NS يتوافق مع p > 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إنتاج البيوفيردين. تم تقييم إنتاج البيوفيردين لسلالة P. aeruginosa PAO1 والعزلات السريرية (MR1 و TL7 و J3) بعد 24 ساعة من النمو في وسط مياه الببتون. تم طرد الثقافات البكتيرية بالطرد المركزي ، وأضيف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار 96 بئرا. بعد ذلك ، تمت إضافة 100 ميكرولتر من 50 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) إليها. تم الكشف عن Pyoverdine عن طريق قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية مع نطاق من 350 نانومتر إلى 600 نانومتر. التحليل الطيفي عند 380 نانومتر من إنتاج البيوفيردين (A). القياس الكمي لإنتاج البيوفيردين (ب). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي على متوسط التجارب الثلاثية. تمثل أشرطة الخطأ ± SD بين ثلاث نسخ مكررة بيولوجية. يتوافق مع p < 0.0001 ، ** يتوافق مع p < 0.01 ، و ns يتوافق مع p > 0.05 بناء على اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إنتاج البيوشيلين. إنتاج Pyochelin من PAO1 (يستخدم كمرجع) والعزلات السريرية (MR1 و TL7 و J3) باستخدام الاستخراج مع أسيتات الإيثيل وكبريتات المغنيسيوم. التحليل الطيفي بمدى من 230 نانومتر إلى 400 نانومتر (A). القياس الكمي للبيوتيشلين (ب). تم إجراء ثلاث تجارب مستقلة لكل عزلة. تمثل أشرطة الخطأ ± SD بين ثلاث نسخ مكررة بيولوجية. يتوافق مع p < 0.001 بناء على اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: إنتاج siderophores المقارن في وسائط نمو البكتيريا المختلفة. إجمالي إنتاج siderophores في أربعة وسائط نمو مختلفة حيث تم استخراج وسائط King's B ووسائط مياه Peptone ومرق Luria بنسبة 3٪ 8-hydroxyquinoline لإزالة أي حديد نادر منه ، وتم اختيار مرق Luria (غير المستخرج). تم إجراء الاستخراج بنسبة 3٪ 8-هيدروكسي كينولين عن طريق إضافة حجم متساو من 3٪ 8-هيدروكسي كينولين إلى الوسائط. تمثل أشرطة الخطأ ± SD بين ثلاث نسخ مكررة بيولوجية. ** يتوافق مع p < 0.001 ، و ns يتوافق مع p > 0.5 بناء على اختبار ANOVA أحادي الاتجاه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: وصفات الوسائط المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لعرض الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن هذا البروتوكول الباحثين من تحديد إجمالي siderophores واثنين من siderophores مختلفة من P. aeruginosa ، وهما pyoverdine و pyochelin ، من طاف الخلايا البكتيرية الحرة. في مقايسة ألواح أجار CAS ، تشكل صبغة CAS وأيونات Fe3+ معقدا. عندما تنتج البكتيريا siderophores ، فإنها تطفئ أيونات Fe3+ من مركب CAS-Fe3+ ، مما يؤدي إلى تغيير اللون حول نمو البكتيريا. ينتج عن هذا التغيير هالة برتقالية صافية حول نمو البكتيريا14,15. في حين أن البكتيريا يمكن أن تكون مخططة مباشرة على لوحات أجار CAS ، قد تتأثر النتائج الإجمالية. قد يؤدي وضع عدد كبير من الخلايا البكتيرية إلى خلق هالة برتقالية عريضة حول نمو البكتيريا ، في حين أن استخدام عدد أقل من الخلايا البكتيرية قد يؤدي إلى منطقة واضحة ضيقة. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بخط عدد موحد من الخلايا البكتيرية عن طريق ضبط OD600. قد تظهر البكتيريا شديدة الحساسية نتائج في غضون 24 ساعة ، بينما قد تستغرق البكتيريا بطيئة النمو أكثر من 72 ساعة لإثبات إنتاج siderophore.
من أجل التحديد الكمي لل siderophores الكلي ، تم استخدام التحليل الطيفي الكلاسيكي في البداية ، مما يستلزم حجما كبيرا من المواد الطافية للكشف عن siderophore ، مما يجعله غير عملي. يتم الآن إجراء القياس الكمي لإجمالي siderophores باستخدام لوحة 96 بئرا مع مقايسة CAS معدلة. وقد أدى هذا النهج إلى تقليل استخدام الكواشف ، والطافية البكتيرية ، والوقت ، وزيادة الدقة مقارنة بالطرق الطيفية التقليدية16. أبلغت دراسات أخرى أيضا عن استخدام ألواح العيار الدقيق كطريقة موفرة للوقت وأكثر كفاءة17. أثبت القياس الكمي للسيدروفورات الكلية باستخدام لوحة العيار الدقيق أنه نهج فعال. في هذه الدراسة ، تم اختيار مزارع بكتيرية عمرها 48 ساعة نمت في وسائط خالية من الحديد للفحص. كما أجريت دراسة مقارنة لتقييم إنتاج siderophore في وسائط نمو مختلفة ، مثل مرق لوريا ، مرق لوريا (مستخرج مع 3٪ 8-هيدروكسي كينولين) ، وسائط King's B (مستخرجة مع 3٪ 8-هيدروكسي كينولين) ، ووسائط مياه بيبتون (مستخرجة مع 3٪ 8-هيدروكسيكينولين). لوحظ أن وسائط المياه Peptone أظهرت أعلى قدر من إنتاج siderophore ، وبالتالي ، تم اختيارها لمزيد من التجارب. يتم تضمين رسم بياني يصور إنتاج siderophore في وسائط نمو مختلفة في الشكل التكميلي 1.
يمكن الكشف عن Pyoverdine وقياسه باستخدام قراءات القياس الطيفي ، ولكن من المعروف أن pyoverdine فقط هو الذي يظهر مضان. Pyoverdine في مجمع مع أيونات Fe3+ لا يظهر مضان18,19. للكشف عن البيوفيردين والقياس الكمي ، تم اختيار الثقافات البكتيرية التي يبلغ عمرها 48 ساعة للدراسة. من المعروف أن P. aeruginosa تنتج البيوشلين في ظل ظروف الجوع الأولية للحديد وتتحول إلى إنتاج البيوفيردين بعد التعرض لظروف الإجهاد الحديدي الشديدة. لقد ثبت أن البيوفيردين يمكن أن يخلب الكاتيونات المعدنية الأخرى ، مثل الألومنيوم والغاليوم والمنغنيز والكروم ، ولكن يتم نقل الحديد فقط بنجاح إلى غشاء الخلية19.
على غرار siderophores الكلي و pyoverdine ، لا يمكن قياس كمية البيوشلين مباشرة من طاف خال من الخلايا ويجب استخلاصه باستخدام ثنائي كلورو الميثان20. ثنائي كلورو الميثان غير قابل للامتزاج مع المادة الطافية الخالية من الخلايا ويشكل طبقة منفصلة في الأسفل. في هذه الدراسة ، تم اختبار العديد من الوسائط الغذائية ، بما في ذلك مرق لوريا وماء البيبتون ووسائط حمض الكازامينو ، ولكن تم الحصول على كمية كبيرة من البيوشلين من وسائط King's B. بينما استخدم Hoegy et al. وسائط CAA في بروتوكولهم ، قمنا بتعديلها باستخدام وسائط King's B ، حيث لم تدعم وسائط CAA نمو البكتيريا21. تم تعديل الطريقة بشكل أكبر عن طريق استخراج وسائط المغذيات باستخدام 8-هيدروكسي كينولين لإزالة أي بقايا حديد من الوسائط ، مما أدى إلى إنشاء وسط يعاني من نقص الحديد. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن وقت الحضانة يؤثر بشكل كبير على إنتاج البيوشيلين. أظهر Dumas et al. أن P. aeruginosa يتحول من إنتاج البيوشلين إلى البيوفيردين في ظل ظروف شديدة تحد من الحديد12. في هذه الدراسة ، تم إجراء استخراج البيوشلين واكتشافه من مزارع بكتيرية عمرها 24 ساعة ، حيث لم يتم اكتشاف البيوشلين في مزارع 48 ساعة. يؤثر حجم المادة الطافية أيضا على اكتشاف البيوشلين ، وبالتالي ، تم استخدام 100 مل من المادة الطافية الخالية من الخلايا للاستخراج. علاوة على ذلك ، كان إنتاج البيوشلين أعلى بكثير في عزلات MR1 و TL7 و J3 ، ربما بسبب السلالات البكتيرية غير القادرة على إنتاج البيوفيردين على الرغم من وجود مخلبات الحديد القوية22.
قدم Ji et al. نهجا جديدا وحساسا لقياس كمية البيوشلين ، والتحقق من صحته باستخدام LC / MS / MS. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تنطبق فقط على عزلات P. aeruginosa من البلغم لمرضى التليف الكيسي. LC / MS / MS ، كونه إعدادا مكلفا ، قد لا يكون في متناول معظم المختبرات23. طور Visaggio et al. مستشعرا حيويا قائما على خلية كاملة ذات إضاءة حيوية ، مما يتيح القياس الكمي السريع والحساس وأحادي الخطوة للبيوشيلين. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه الطريقة توفير تقدير كمي لمجموع siderophores و pyoverdine24.
يمكن أن يكون لأنظمة امتصاص الحديد Siderophore تطبيق مضاد للميكروبات في توصيل الأدوية للبكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة ، لأنها تلعب دورا حاسما في بقاء البكتيريا وضراوتها. قد يوفر هذا النهج طريقة جديدة لمكافحة البكتيريا المقاومة للأدويةالمتعددة 25. يمكن ربط الأدوية التي لا يمكنها اختراق غشاء الخلية البكتيرية ب siderophore ، ويمكن نقل مركب Fe-siderophore الناتج داخل الغشاء البكتيري26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالتمويل من DBT - برنامج تدريس التكنولوجيا الحيوية ، DBT - برنامج BUILDER و FIST. السيد شكرا الزمالة الواردة من SHODH. HP تشكر الزمالة التي تلقتها من CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K.
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J.
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
