Summary
Detta protokoll ger både kvalitativa och kvantitativa analyser av totala sideroforer, pyoverdin och pyochelin från Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) är känd för sin produktion av ett brett spektrum av virulensfaktorer för att etablera infektioner i värden. En sådan mekanism är rensning av järn genom sideroforproduktion. P. aeruginosa producerar två olika sideroforer: pyochelin, som har lägre järnkelaterande affinitet, och pyoverdin, som har högre järnkelaterande affinitet. Denna rapport visar att pyoverdin kan kvantifieras direkt från bakteriella supernatanter, medan pyochelin måste extraheras från supernatanter före kvantifiering.
Den primära metoden för kvalitativ analys av sideroforproduktion är agarplattanalysen med kromazurolsulfonat (CAS). I denna analys leder frisättningen av CAS-färgämne från Fe3+-Dye-komplexet till en färgförändring från blått till orange, vilket indikerar sideroforproduktion. För kvantifiering av totala sideroforer blandades bakteriella supernatanter i lika stora proportioner med CAS-färgämne i en mikrotiterplatta, följt av spektrofotometrisk analys vid 630 nm. Pyoverdin kvantifierades direkt från den bakteriella supernatanten genom att blanda den i lika stora proportioner med 50 mM Tris-HCl, följt av spektrofotometrisk analys. En topp vid 380 nm bekräftade förekomsten av pyoverdin. När det gäller pyokelin var det inte möjligt att direkt kvantifiera det från den bakteriella supernatanten, så det måste extraheras först. Efterföljande spektrofotometrisk analys avslöjade närvaron av pyochelin, med en topp vid 313 nm.
Introduction
Organismer behöver järn för att utföra olika vitala funktioner, såsom elektrontransport och DNA-replikation1. Pseudomonas aeruginosa, en gramnegativ opportunistisk patogen, är känd för att ha en mängd olika virulensfaktorer för att etablera infektion i värden, bland vilka en mekanism är sideroforbildning2. Under järnutarmande förhållanden frigör P. aeruginosa specialiserade molekyler som kallas sideroforer, som släcker järn från den omgivande miljön. Sideroforer kelerar järn extracellulärt, och det resulterande järn-sideroforkomplexet transporteras aktivt tillbaka till cell3.
P. aeruginosa är känd för att producera två sideroforer, pyoverdin och pyochelin. Pyoverdin är känt för att ha en högre järnkelaterande affinitet (1:1), medan pyochelin är känt för att ha en mindre järnkelaterande affinitet (2:1)4. Pyochelin kallas också en sekundär siderofore eftersom den har en lägre järnkelaterande affinitet5. Produktionen och regleringen av sideroforer styrs aktivt av kvorumavkänningssystem (QS) i P. aeruginosa6.
Förutom järnsläckning är sideroforer också involverade i regleringen av virulensfaktorer och spelar en aktiv roll i biofilmbildning7. Sideroforer har ytterligare viktiga roller, inklusive involvering i cellsignalering, försvar mot oxidativ stress och underlättande av interaktioner mellan mikrobiella samhällen8. Sideroforer kategoriseras vanligtvis baserat på de specifika funktionella grupper genom vilka de kelerar järn. De tre primära bidentatliganderna i denna klassificering är katekolat, hydroxamat och α-hydroxikarboxylat3. Pyoverdiner är kännetecken för fluorescerande Pseudomonas-arter som P. aeruginosa och P. fluorescens5. De består av en blandad grön fluorescerande kromofor kopplad till en oligopeptid innehållande 6-12 aminosyror. Flera icke-ribosomala peptidsyntetaser (NRP) är involverade i deras syntes9. Fyra gener som är involverade i pyoverdinproduktion och reglering är pvdL, pvdI, pvdJ och pvdD10. Pyoverdin är också ansvarig för infektion och virulens hos däggdjur11. P. aeruginosa har noterats producera pyochelin under måttliga järnbegränsande förhållanden, medan pyoverdin produceras under svåra järnbegränsande miljöer12. Två operoner som är involverade i pyochelinproduktion är pchDCBA och pchEFGHI13. Det noteras att i närvaro av pyocyanin inducerar pyochelin (katekolat) oxidativ skada och inflammation och genererar hydroxylradikaler, som är skadliga för värdvävnader11.
Analysen av kromazurolsulfonat (CAS) används i stor utsträckning på grund av dess omfattning, höga känslighet och större bekvämlighet jämfört med mikrobiologiska analyser, som, även om de är känsliga, kan vara alltför specifika14. CAS-analysen kan utföras på agarytor eller i en lösning. Den förlitar sig på den färgförändring som uppstår när järnjonen övergår från sitt intensiva blå komplex till orange. CAS-kolorimetrisk analys kvantifierar utarmningen av järn från ett Fe-CAS-ytaktivt ternära komplex. Detta speciella komplex, som består av metall, organiskt färgämne och ytaktivt ämne, har en blå färg och uppvisar en absorptionstopp vid 630 nm.
Denna rapport presenterar en metod för kvalitativ detektion av sideroforproduktion, där man kan detektera produktionen av sideroforer på en agarplatta. En metod för kvantitativ uppskattning av den totala sideroforproduktionen i en mikrotiterplatta och detektion och kvantitativ analys av två sideroforer, pyoverdin och pyochelin, från P. aeruginosa, tillhandahålls också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla bakterieisolat av P. aeruginosa erhölls från medicinska mikrobiologiska laboratorier i Vadodara och Jaipur i Indien. Alla utvalda kliniska isolat hanterades i biosäkerhetsskåp (BSL2) och största försiktighet iakttogs vid hantering av bakterieisolat under experimenten. De kommersiella detaljerna för alla reagenser/lösningar finns i materialförteckningen.
1. Beredning av färgämne och agarmedia med kromazurolsulfonat (CAS)
- Förbered CAS-färgämne (100 ml) med följande sammansättning:
- Lös 60 mg CAS i 50 ml destillerat vatten (lösning 1).
- Lös upp 2,7 mg FeCl3·6H2O i 10 ml 10 mM HCl (lösning 2).
- Lös 73 mg Cetrimoniumbromid (HDTMA) i 40 ml destillerat vatten (lösning 3).
- Blanda försiktigt lösning 1, lösning 2 och lösning 3. Förvara den i en glasflaska.
- Förbered CAS-agar genom att följa stegen nedan:
- Tillsätt 100 ml MM9 saltlösning till 750 ml destillerat vatten.
- Lös upp 32,24 g piperazin-N,N'-bis(2-etansulfonsyra) (PIPES) fri syra.
- Tillsätt 15 g agar-agar. Autoklav och låt den svalna.
- Tillsätt 30 ml steril kasaminosyralösning och 10 ml steril 20 % glukoslösning till blandningen.
- Tillsätt 100 ml CAS-färgämne, blanda och häll det under aseptiska förhållanden.
OBS: Beredning av MM9-media, kasaminosyralösning och 8-hydroxikinolin finns i kompletterande file 1. PIPES-bufferten är pH-känslig. Det kommer inte att lösas upp förrän pH 5,6 uppnås. Se till att pH-värdet övervakas hela tiden, för när PIPES börjar lösas upp i vatten kommer det att sänka pH-värdet ytterligare. Extrahera kasaminosyra med samma volym 3% 8-hydroxikinolin upplöst i kloroform. Låt den oblandbara lösningen stå vid 4 °C i cirka 20 minuter och samla försiktigt upp den övre fasen av lösningen utan att störa den nedre fasen.
2. Kvalitativ analys av produktionen av sideroforer
- Ställ in OD600 nm på 0,2 för 24-timmarsodlade kulturer av P. aeruginosa.
- Använd en steril trådögla och stryk bakteriekulturen på en CAS-agarplatta.
- Inkubera vid 30 °C i 24 timmar.
OBS: Peptone vattenmedia eller 0,8 % normal saltlösning kan användas för att späda ut bakteriekulturen. Om ingen bakterietillväxt observeras efter 24 timmar, inkubera CAS-plattorna i 48 till 72 timmar.
3. Kvantitativ uppskattning av det totala antalet sideroforer
- Inokulera 24-timmarsodlade kulturer av P. aeruginosa på nytt i Peptone-vattenmedia efter justering av OD600 nm till 0,25 och inkubera vid 30 °C i 48 timmar.
- Efter 48 timmar centrifugeras bakteriekulturen vid 4650 x g i 10 minuter i rumstemperatur.
- Efter centrifugeringen tillsätts 100 μl cellfri supernatant till en 96-håls mikrotiterplatta och 100 μL CAS-färgämne.
- Täck plattan med aluminiumfolie och inkubera i rumstemperatur i 20 min.
- Efter inkubationen skall spektrofotometriska avläsningar göras vid 630 nm.
- Beräkna de erhållna resultaten för kvantifiering av totalt antal sideroforer som procentuell sideroforenhet (PSU).
PSU kan beräknas som: [(Ar - As)/Ar] x 100
där Ar = referensens absorbans vid 630 nm, As = absorbansen hos provets cellfria supernatant. Som referens bör CAS-färgämne tillsättas till oinokulerade peptonvattenmedier. Fyll alla glas, såsom provrör, kolvar etc., med 6 M HCl i 2 timmar och skölj dem två gånger med destillerat vatten för att ta bort eventuella spår av järn på dem.
4. Kvantitativ skattning av pyoverdin
- Inokulera 24-timmarsodlade kulturer av P. aeruginosa på nytt i Pepton-vattensubstrat efter justering av OD600 nm till 0,25 och inkubera vid 30 °C i 48 timmar.
- Efter 48 timmar, mät OD600 nm av bakterietillväxten innan du fortsätter.
- Centrifugera bakteriekulturen vid 4650 x g i 10 minuter i rumstemperatur.
- Efter centrifugeringen tillsätts 100 μl cellfri supernatant till en 96-håls mikrotiterplatta och 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) till den.
- Utför spektrofotometriska avläsningar vid OD405 nm.
5. Pyokhelinextraktion och spektrofotometri
- Inokulera på nytt 24-timmarsodlade kulturer av P. aeruginosa i King's B-media (tilläggsfil 1) efter justering av OD600 nm till 0,25 och inkubera vid 30 °C i 24 timmar.
- Efter 24 timmar tar du 100 ml kultur och centrifugerar vid 4650 x g i 10 minuter i rumstemperatur.
- Efter centrifugering, tillsätt 5 ml 1 M citronsyra till supernatanten. Extrahera två gånger med 50 ml etylacetat.
- Filtrera den organiska fasen med magnesiumsulfat genom ett sprutfilter. Förvara den filtrerade organiska fasen vid -20 °C.
- Gör spektrofotometriska avläsningar vid 320 nm.
OBS: Eftersom pyochelin är en mycket instabil förening vid rumstemperatur, utför extraktionsprocessen på is. Använd en 50 ml steril spruta för filterseparering. Lägg bomull vid spetsen av sprutan och tillsätt 1 g magnesiumsulfat på den. Fäst ett sterilt sprutfilter vid spetsen av sprutan och samla upp filtratet i ett sterilt rör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan kvantifiering av sideroforer från kliniska isolat genomfördes en kvalitativ screening för sideroforproduktion för att säkerställa sideroforproduktion. Kvalitativ detektion av sideroforer från kliniska isolat observerades genom strimmiga bakterier på CAS-agarplattor. Tre kliniska isolat, nämligen MR1, TL7, J3, tillsammans med PAO1 (referensstammen), valdes ut för studien. Alla tre kliniska isolat och PAO1 visade positiva resultat för sideroforproduktion, där en tydlig orange halo runt bakterietillväxten på den blå agarytan indikerade positiv sideroforproduktion (Figur 1). Halobildningen på CAS-agarn (Figur 1) gav en grov uppskattning av sideroforproduktionen i kliniska isolat. Därför utfördes kvantitativ uppskattning av sideroforproduktion med CAS-reagens och flytande media.
Total sideroforkvantifiering utfördes direkt från den cellfria supernatanten. Efter inkubationen observerades en färgförändring där gul färg indikerade avlägsnande av CAS-färgämne från Fe-komplexet. Här användes CAS-färgämne med oinokulerade odlingssubstrat som kontroll, vilket togs för sideroforberäkning. Det fanns ingen signifikant skillnad i total sideroforproduktion i isolaten MR1 och TL7, medan det fanns en signifikant total sideroforproduktion i J3 jämfört med PAO1 (Figur 2).
Därefter utfördes pyoverdinkvantifiering direkt från cellfria supernatanter. Pyoverdiner frisätts i cellmiljöer, så den cellfria supernatanten användes för pyoverdinkvantifiering. En UV-områdesskanning med spektrofotometern utfördes också, där toppen vid 380 nm bekräftade förekomsten av pyoverdin (figur 3A). Spektrofotometriska avläsningar gjordes vid 405 nm och resultaten tolkades som OD405/OD600 nm. Samtliga isolat uppvisade pyoverdinproduktion, där isolaten MR1 och J3 uppvisade signifikant lägre pyoverdin jämfört med PAO1, medan ingen signifikant skillnad observerades för TL7 (Figur 3B).
Pyochelin kan inte kvantifieras direkt från den cellfria supernatanten. Det var inte möjligt att extrahera pyochelin från 1 ml cellfri supernatant, så det extraherades från 100 ml cellfri supernatant. Den surgjordes med 1 M citronsyra. Eftersom pyochelin är en mycket instabil förening utfördes extraktionsprocessen på is. Pyokletektion utfördes genom att köra en UV-skanning från ett intervall på 300 till 600 nm, där toppen vid OD320 nm bekräftade närvaron av pyochelin (figur 4A). Pyokhelinkvantifiering utfördes genom att ta spektrofotometriska avläsningar vid OD320 nm. Beräkningarna gjordes genom att dividera OD320/OD600. Isolaten MR1, TL7 och J3 uppvisade signifikant högre produktion av pyochelin jämfört med referensisolatet PAO1 (Figur 4B).
Jämförande sideroforproduktion i olika bakteriella odlingssubstrat utfördes för att kontrollera mängden totala sideroforer som producerades i olika odlingsmedier. Fyra olika medier valdes ut, där Luria-buljong, King's B-media och Peptonvatten extraherades med 3% 8-hydroxikinolin, och oextraherad Luria-buljong valdes ut för studien. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan produktionen av sideroforer i extraherad Luriabuljong, King's B-media och Pepton-vattenmedia, medan en signifikant skillnad observerades för sideroforproduktion i oextraherad Luria-buljong.
Figur 1: Produktion av sideroforer på CAS-agar. Tillväxt av P. aeruginosa på CAS-agarplattor av 24-timmarsodlade kulturer upptäcktes på CAS-agarplattor och inkuberades vid 30 °C i 24 timmar. Sideroforförekomst indikeras av en orange halo runt bakteriekolonin (PAO1, MR1, TL7 och J3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Total produktion av sideroforer. Total sideroforproduktion utvärderades för PAO1 och tre kliniska isolat (MR1, TL7 och J3). 100 μL cellfri supernatant (av PAO1, MR1, TL7 och J3 odlad i 24 timmar i peptonvattenbuljong) tillsattes till en 96-håls mikrotiterplatta, därefter tillsattes 100 μL CAS-färgämne. Envägs ANOVA-test utfördes för statistisk signifikans. Felstaplar representerar ± standardavvikelse (SD) mellan tre biologiska replikat. *motsvarar p < 0,05; ns motsvarar p > 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Pyoverdinproduktion. Pyoverdinproduktion av P. aeruginosa stam PAO1 och kliniska isolat (MR1, TL7 och J3) bedömd efter 24 timmars tillväxt i peptonvattenmedia. Bakteriekulturerna centrifugerades och 100 μL cellfri supernatant tillsattes till en 96-håls mikrotiterplatta. Därefter tillsattes 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Pyoverdindetektion gjordes med UV-spektrofotometri med ett intervall på 350 nm till 600 nm. Spektrometrisk analys vid 380 nm pyoverdinproduktion (A). Kvantifiering av pyoverdinproduktion (B). Felstaplar anger standardfelet över medelvärdet av tredubbla experiment. Felstaplar representerar ± SD mellan tre biologiska replikat. motsvarar p < 0,0001, **motsvarar p < 0,01 och ns motsvarar p > 0,05 baserat på envägs ANOVA-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Produktion av pyochelin. Pyokelinutproduktion av PAO1 (används som referens) och kliniska isolat (MR1, TL7 och J3) med extraktion med etylacetat och magnesiumsulfat. Spektrofotometrisk analys med ett intervall från 230 nm till 400 nm (A). Kvantifiering av pyochelin (B). Tre oberoende experiment utfördes för varje isolat. Felstaplar representerar ± SD mellan tre biologiska replikat. motsvarar p < 0,001 baserat på envägs ANOVA-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur 1: Jämförande sideroforproduktion i olika bakteriella odlingsmedier. Total sideroforproduktion i fyra olika odlingssubstrat där King's B-media, Peptone-vattenmedia och Luria-buljong extraherades med 3% 8-hydroxikinolin för att avlägsna eventuellt spårjärn från den, och Luria-buljong (oextraherad) valdes. Extraktion med 3 % 8-hydroxikinolin utfördes genom att tillsätta en lika stor volym 3 % 8-hydroxikinolin till mediet. Felstaplar representerar ± SD mellan tre biologiska replikat. **motsvarar p < 0,001 och ns motsvarar p > 0,5 baserat på envägs ANOVA-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Medierecept som använts för denna studie. Klicka här för att se filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt för forskare att kvantifiera totala sideroforer och två olika sideroforer av P. aeruginosa, nämligen pyoverdin och pyochelin, från den bakteriecellfria supernatanten. I analysen av CAS-agarplattorna bildar CAS-färgämne och Fe3+-joner ett komplex. När bakterier producerar sideroforer släcker de Fe3+-joner från CAS-Fe3+-komplexet, vilket leder till en färgförändring runt bakterietillväxten. Denna förändring resulterar i en tydlig orange halo runt bakterietillväxten14,15. Även om bakterier kan strykas direkt på CAS-agarplattor, kan de övergripande resultaten påverkas. Att stryka ett stort antal bakterieceller kan skapa en bred orange gloria runt bakterietillväxten, medan användning av färre bakterieceller kan resultera i en smal klar zon. För att ta itu med detta strök vi ett enhetligt antal bakterieceller genom att justera OD600. Noggranna bakterier kan visa resultat inom 24 timmar, medan långsamt växande bakterier kan ta mer än 72 timmar att visa sideroforproduktion.
För kvantitativ bestämning av totala sideroforer användes initialt klassisk spektroskopi, vilket kräver en betydande volym supernatant för siderofordetektion, vilket gör det opraktiskt. Kvantifieringen av totala sideroforer utförs nu med hjälp av en 96-hålsplatta med en modifierad CAS-analys. Detta tillvägagångssätt har resulterat i en minskning av användningen av reagenser, bakteriell supernatant, tid och ökad noggrannhet jämfört med traditionella spektroskopiska metoder16. Andra studier har också rapporterat användningen av mikrotiterplattor som en tidsbesparande och mer effektiv metod17. Kvantifiering av totala sideroforer med hjälp av en mikrotiterplatta har visat sig vara ett effektivt tillvägagångssätt. I denna studie valdes 48 timmar gamla bakteriekulturer odlade i järnfria medier ut för undersökning. En jämförande studie genomfördes också för att bedöma sideroforproduktion i olika odlingsmedier, såsom Luria buljong, Luria buljong (extraherad med 3 % 8-hydroxikinolin), King's B-media (extraherad med 3 % 8-hydroxikinolin) och Peptone vattenmedia (extraherad med 3 % 8-hydroxikinolin). Det observerades att Peptone vattenmedia uppvisade den högsta mängden sideroforproduktion, och därför valdes det ut för ytterligare experiment. En graf som visar sideroforproduktion i olika odlingssubstrat ingår i tilläggsfigur 1.
Pyoverdin kan detekteras och kvantifieras med hjälp av spektrofluorimetriska avläsningar, men endast pyoverdin är känt för att uppvisa fluorescens. Pyoverdin i komplex med Fe3+ joner uppvisar inte fluorescens18,19. För pyoverdindetektion och kvantifiering valdes 48 timmar gamla bakteriekulturer ut för studier. P. aeruginosa är känd för att producera pyochelin under initiala järnsvältförhållanden och övergår till pyoverdinproduktion efter exponering för svåra järnstressförhållanden. Det har visats att pyoverdin kan kelera andra metallkatjoner, såsom aluminium, gallium, mangan och krom, men endast järn transporteras framgångsrikt till cellmembranet19.
I likhet med total sideroforer och pyoverdin kan pyochelin inte kvantifieras direkt från cellfri supernatant och måste extraheras med diklormetan20. Diklormetan är oblandbart med den cellfria supernatanten och bildar ett separat lager i botten. I denna studie testades olika näringsmedier, inklusive Luria-buljong, Peptonvatten och Casaminosyramedia, men en betydande mängd pyochelin erhölls från King's B-media. Medan Hoegy et al. hade använt CAA-media i sitt protokoll, modifierade vi det med King's B-media, eftersom CAA-media inte stödde bakterietillväxt21. Metoden modifierades ytterligare genom att extrahera näringsmedier med 8-hydroxikinolin för att avlägsna eventuella järnrester från mediet, vilket skapade ett järnfattigt medium. Dessutom visade sig inkubationstiden ha en signifikant inverkan på pyochelinproduktionen. Dumas et al. visade att P. aeruginosa växlar från pyochelin- till pyoverdinproduktion under svåra järnbegränsande förhållanden12. I denna studie utfördes pyochelinextraktion och detektion från 24-timmars bakteriekulturer, eftersom pyochelin inte detekterades i 48-timmarskulturer. Supernatantens volym påverkar också pyochelindetektionen, och därför användes 100 ml cellfri supernatant för extraktion. Dessutom var pyochelinproduktionen signifikant högre i MR1-, TL7- och J3-isolat, möjligen på grund av bakteriestammar som inte kan producera pyoverdin trots att de har potenta järnkelatbildare22.
Ji et al. introducerade en ny och känslig metod för pyochelinkvantifiering och validerade den med hjälp av LC/MS/MS. Denna metod tillämpades dock endast på P. aeruginosa-isolat från sputum hos patienter med cystisk fibros. LC/MS/MS, som är en kostsam installation, kanske inte är överkomlig för de flesta laboratorier23. Visaggio et al. utvecklade en bioluminescerande helcellsbaserad biosensor, som möjliggör snabb, känslig och enstegs pyochelinkvantifiering. Denna metod kan dock inte ge kvantifiering för totala sideroforer och pyoverdin24.
Sideroforjärnupptagssystem kan ha en antimikrobiell tillämpning vid läkemedelstillförsel för multiresistenta bakterier, eftersom de spelar en avgörande roll för bakteriers överlevnad och virulens. Detta tillvägagångssätt kan erbjuda ett nytt sätt att bekämpa multiresistenta bakterier25. Läkemedel som inte kan tränga igenom bakteriens cellmembran kan kopplas till en siderofor, och det resulterande Fe-sideroforkomplexet kan transporteras inuti bakteriemembranet26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering från DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program och FIST. MR tackstipendium mottaget från SHODH. HP tackar stipendium mottaget från CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K.
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J.
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
