Summary

Analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de Pseudomonas aeruginosa

Published: March 15, 2024
doi:

Summary

Ce protocole fournit des analyses qualitatives et quantitatives des sidérophores totaux, de la pyoverdine et de la pyochéline de Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est connu pour sa production d’un large éventail de facteurs de virulence pour établir des infections chez l’hôte. L’un de ces mécanismes est le piégeage du fer par la production de sidérophores. P. aeruginosa produit deux sidérophores différents : la pyochéline, qui a une affinité plus faible pour chélateur du fer, et la pyoverdine, qui a une affinité plus élevée pour la chélation du fer. Ce rapport démontre que la pyoverdine peut être directement quantifiée à partir de surnageants bactériens, tandis que la pyochéline doit être extraite des surnageants avant d’être quantifiée.

La principale méthode d’analyse qualitative de la production de sidérophores est le dosage sur plaque de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS). Dans ce test, la libération du colorant CAS du complexe Fe3+-Dye conduit à un changement de couleur du bleu à l’orange, indiquant une production de sidérophore. Pour la quantification des sidérophores totaux, les surnageants bactériens ont été mélangés en proportions égales avec le colorant CAS dans une plaque de microtitration, suivis d’une analyse spectrophotométrique à 630 nm. La pyoverdine a été directement quantifiée à partir du surnageant bactérien en la mélangeant dans des proportions égales avec 50 mM de Tris-HCl, suivie d’une analyse spectrophotométrique. Un pic à 380 nm a confirmé la présence de pyoverdine. En ce qui concerne la pyochéline, la quantification directe à partir du surnageant bactérien n’était pas possible, il a donc fallu d’abord l’extraire. L’analyse spectrophotométrique ultérieure a révélé la présence de pyochéline, avec un pic à 313 nm.

Introduction

Les organismes ont besoin de fer pour remplir diverses fonctions vitales, telles que le transport d’électrons et la réplication de l’ADN1. Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène opportuniste à Gram négatif, est connu pour posséder une variété de facteurs de virulence pour établir l’infection chez l’hôte, dont l’un des mécanismes est la formation de sidérophores2. Dans des conditions d’appauvrissement en fer, P. aeruginosa libère des molécules spécialisées appelées sidérophores, qui éteignent le fer de l’environnement environnant. Les sidérophores chélatent le fer de manière extracellulaire, et le complexe ferric-sidérophore qui en résulte est activement transporté vers la cellule3.

P. aeruginosa est connu pour produire deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline. La pyoverdine est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus élevée (1 :1), tandis que la pyochéline est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus faible (2 :1)4. La pyochéline est également appelée sidérophore secondaire car elle a uneaffinité chélatrice de fer 5 plus faible. La production et la régulation des sidérophores sont activement contrôlées par les systèmes de détection de quorum (QS) chez P. aeruginosa6.

Outre la trempe du fer, les sidérophores sont également impliqués dans la régulation des facteurs de virulence et jouent un rôle actif dans la formation du biofilm7. Les sidérophores jouent d’autres rôles cruciaux, notamment l’implication dans la signalisation cellulaire, la défense contre le stress oxydatif et la facilitation des interactions entre les communautés microbiennes8. Les sidérophores sont généralement classés en fonction des groupes fonctionnels spécifiques à travers lesquels ils chélatent le fer. Les trois principaux ligands bidentates de cette classification sont le catécholate, l’hydroxamate et le α-hydroxycarboxylate3. Les pyoverdines sont des caractéristiques d’espèces fluorescentes de Pseudomonas telles que P. aeruginosa et P. fluorescens5. Ils sont constitués d’un chromophore fluorescent vert mixte couplé à un oligopeptide contenant 6 à 12 acides aminés. Plusieurs peptides synthétases non ribosomales (PNR) sont impliquées dans leur synthèse9. Quatre gènes impliqués dans la production et la régulation de la pyoverdine sont pvdL, pvdI, pvdJ et pvdD10. La pyoverdine est également responsable de l’infection et de la virulence chez les mammifères11. P. aeruginosa est connu pour produire de la pyochéline dans des conditions modérées de limitation du fer, tandis que la pyoverdine est produite dans des environnements sévères limitant le fer12. Deux opérons impliqués dans la production de pyochéline sont pchDCBA et pchEFGHI13. Il est à noter qu’en présence de pyocyanine, la pyochéline (catécholate) induit des dommages oxydatifs et une inflammation et génère des radicaux hydroxyles, qui sont nocifs pour les tissus de l’hôte11.

Le test du sulfonate de chrome-azurol (CAS) est largement adopté en raison de son exhaustivité, de sa grande sensibilité et de sa plus grande commodité par rapport aux tests microbiologiques, qui, bien que sensibles, peuvent être trop spécifiques14. Le test CAS peut être effectué sur des surfaces gélosées ou dans une solution. Il s’appuie sur le changement de couleur qui se produit lorsque l’ion ferrique passe de son complexe bleu intense à l’orange. Le test colorimétrique CAS quantifie l’épuisement du fer d’un complexe ternaire tensioactif Fe-CAS. Ce complexe particulier, composé de métal, de colorant organique et de tensioactif, a une couleur bleue et présente un pic d’absorption à 630 nm.

Ce rapport présente une méthode de détection qualitative de la production de sidérophores, où l’on peut détecter la production de sidérophores sur une plaque de gélose. Une méthode d’estimation quantitative de la production totale de sidérophores dans une plaque de microtitration et la détection et l’analyse quantitative de deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline, de P. aeruginosa, sont également fournies.

Protocol

Tous les isolats bactériens de P. aeruginosa ont été obtenus dans des laboratoires de microbiologie médicale de Vadodara et de Jaipur, en Inde. Tous les isolats cliniques sélectionnés ont été manipulés dans une enceinte de biosécurité (BSL2) et le plus grand soin a été apporté lors de la manipulation des isolats bactériens pendant les expériences. Les détails commerciaux de tous les réactifs/solutions sont fournis dans le tableau des matériaux. 1. Pr?…

Representative Results

Avant la quantification des sidérophores à partir d’isolats cliniques, un criblage qualitatif de la production de sidérophores a été effectué pour assurer la production de sidérophores. La détection qualitative des sidérophores à partir d’isolats cliniques a été observée en striant des bactéries sur des plaques de gélose CAS. Trois isolats cliniques, à savoir MR1, TL7, J3, ainsi que PAO1 (la souche de référence), ont été sélectionnés pour l’étude. Les trois is…

Discussion

Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier les sidérophores totaux et deux sidérophores différents de P. aeruginosa, à savoir la pyoverdine et la pyochéline, à partir du surnageant bactérien acellulaire. Dans le test des plaques de gélose CAS, le colorant CAS et les ions Fe3+ forment un complexe. Lorsque les bactéries produisent des sidérophores, elles éteignent les ions Fe3+ du complexe CAS-Fe3+, ce qui entraîne un changement de couleur autour de la croissance …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent le financement du programme d’enseignement de la biotechnologie (TCD), du programme BUILDER (TCD) et du programme FIST. MR remercie la bourse reçue de SHODH. HP remercie la bourse reçue du CSIR.

Materials

Agar Agar, Type I HIMEDIA GRM666
8-Hydroxyquinoline Loba Chemie 4151
Casamino Acid SRL Chemicals 68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) HIMEDIA RM4867-100G
Chloroform Merck 1070242521
Chrome azurol sulfonate HIMEDIA RM336-10G
Citric acid Merck 100241
Dextrose monohydrate Merck 108342
Dichloromethane Merck 107020
Ferric chloride hexahydrate HIMEDIA GRM6353
Glass Flasks Borosil 5100021
Glass Test-tubes Borosil 9820U05
Hydrochloric acid SDFCL 20125
King's medium B base HIMEDIA M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts HIMEDIA G013-500G
Magnesium Sulphate  Qualigens 10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer Thermo Scientific 51119200
Peptone Type I, Bacteriological HIMEDIA RM667-500G
PIPES free acid MP Biomedicals 190257
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
Proteose peptone HIMEDIA RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer Shimadzu 2072310058
Sigma Laborzentrifuge Sigma-Aldrich 3-18K
Sodium chloride Qualigens 15915

References

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Rathod, M., Patel, H., Gajjar, D. Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (205), e65980, doi:10.3791/65980 (2024).

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