Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de productie van siderofoor van Pseudomonas aeruginosa

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/65980
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

Summary

Dit protocol biedt zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses van totale sideroforen, pyoverdine en pyochelin van Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) staat bekend om zijn productie van een breed scala aan virulentiefactoren om infecties in de gastheer tot stand te brengen. Een voorbeeld van zo'n mechanisme is het opruimen van ijzer door middel van de productie van sideroforen. P. aeruginosa produceert twee verschillende sideroforen: pyocheline, dat een lagere ijzerchelerende affiniteit heeft, en pyoverdine, dat een hogere ijzerchelaatvorming heeft. Dit rapport toont aan dat pyoverdine direct kan worden gekwantificeerd uit bacteriële supernatanten, terwijl pyochelin moet worden geëxtraheerd uit supernatanten voordat het kan worden gekwantificeerd.

De primaire methode voor het kwalitatief analyseren van de productie van siderofoor is de Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agarplaattest. In deze test leidt het vrijkomen van CAS-kleurstof uit het Fe3+-Dye-complex tot een kleurverandering van blauw naar oranje, wat wijst op de productie van sideroforen. Voor de kwantificering van de totale sideroforen werden bacteriële supernatanten in gelijke verhoudingen gemengd met CAS-kleurstof in een microtiterplaat, gevolgd door spectrofotometrische analyse bij 630 nm. Pyoverdine werd direct gekwantificeerd uit het bacteriële supernatans door het in gelijke verhoudingen te mengen met 50 mM Tris-HCl, gevolgd door spectrofotometrische analyse. Een piek bij 380 nm bevestigde de aanwezigheid van pyoverdine. Wat Pyochelin betreft, was directe kwantificering van het bacteriële supernatans niet mogelijk, dus moest het eerst worden geëxtraheerd. Daaropvolgende spectrofotometrische analyse onthulde de aanwezigheid van pyocheline, met een piek bij 313 nm.

Introduction

Organismen hebben ijzer nodig om verschillende vitale functies uit te voeren, zoals elektronentransport en DNA-replicatie1. Van Pseudomonas aeruginosa, een Gram-negatieve opportunistische ziekteverwekker, is bekend dat het een verscheidenheid aan virulentiefactoren bezit om infectie in de gastheer tot stand te brengen, waaronder siderofoor vorming2. Tijdens ijzerafbrekende omstandigheden geeft P. aeruginosa gespecialiseerde moleculen af, sideroforen genaamd, die ijzer uit de omgeving blussen. Sideroforen cheleren ijzer extracellulair en het resulterende ijzer-siderofoor complex wordt actief terug naar de celgetransporteerd 3.

Van P. aeruginosa is bekend dat het twee sideroforen produceert, pyoverdine en pyocheline. Van pyoverdine is bekend dat het een hogere ijzerchelaatstoornis heeft (1:1), terwijl van pyocheline bekend is dat het een lagere ijzerchelaatlaateenheid heeft (2:1)4. Pyochelin wordt ook wel een secundaire siderofoor genoemd omdat het een lagere ijzerchelaatiniteit heeft5. De productie en regulatie van sideroforen worden actief gecontroleerd door Quorum Sensing (QS)-systemen in P. aeruginosa6.

Naast het blussen van ijzer zijn sideroforen ook betrokken bij het reguleren van virulentiefactoren en spelen ze een actieve rol bij de vorming vanbiofilms7. Sideroforen vervullen aanvullende cruciale rollen, waaronder betrokkenheid bij celsignalering, verdediging tegen oxidatieve stress en het vergemakkelijken van interacties tussen microbiële gemeenschappen8. Sideroforen worden meestal gecategoriseerd op basis van de specifieke functionele groepen waardoor ze ijzer cheleren. De drie primaire bidentaatliganden in deze classificatie zijn catecholaat, hydroxamaat en α-hydroxycarboxylaat3. Pyoverdines zijn kenmerken van fluorescerende Pseudomonas-soorten zoals P. aeruginosa en P. fluorescens5. Ze bestaan uit een gemengde groene fluorescerende chromofoor gekoppeld aan een oligopeptide dat 6-12 aminozuren bevat. Verschillende niet-ribosomale peptidesynthetasen (NRP's) zijn betrokken bij hun synthese9. Vier genen die betrokken zijn bij de productie en regulatie van pyoverdine zijn pvdL, pvdI, pvdJ en pvdD10. Pyoverdine is ook verantwoordelijk voor infectie en virulentie bij zoogdieren11. Van P. aeruginosa is bekend dat het pyocheline produceert in matige ijzerbeperkende omstandigheden, terwijl pyoverdine wordt geproduceerd tijdens ernstige ijzerbeperkende omgevingen12. Twee operons die betrokken zijn bij de productie van pyochelin zijn pchDCBA en pchEFGHI13. Opgemerkt wordt dat pyocheline (catecholaat) in aanwezigheid van pyocyanine oxidatieve schade en ontsteking veroorzaakt en hydroxylradicalen genereert, die schadelijk zijn voor gastheerweefsels11.

De chroom-azurolsulfonaat-test (CAS) wordt algemeen gebruikt vanwege de volledigheid, hoge gevoeligheid en het grotere gemak in vergelijking met microbiologische tests, die, hoewel gevoelig, te specifiek kunnen zijn14. De CAS-test kan worden uitgevoerd op agaroppervlakken of in een oplossing. Het is afhankelijk van de kleurverandering die optreedt wanneer het ijzerion overgaat van zijn intens blauwe complex naar oranje. De CAS-colorimetrische test kwantificeert de uitputting van ijzer uit een Fe-CAS-surfactant ternair complex. Dit specifieke complex, bestaande uit metaal, organische kleurstof en oppervlakteactieve stof, heeft een blauwe kleur en vertoont een absorptiepiek bij 630 nm.

Dit rapport presenteert een methode voor de kwalitatieve detectie van de productie van sideroforen, waarbij men de productie van sideroforen op een agarplaat kan detecteren. Er wordt ook een methode gegeven voor de kwantitatieve schatting van de totale productie van sideroforen in een microtiterplaat en de detectie en kwantitatieve analyse van twee sideroforen, pyoverdine en pyocheline, van P. aeruginosa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle bacteriële isolaten van P. aeruginosa zijn afkomstig van medische microbiologische laboratoria in Vadodara en Jaipur, India. Alle geselecteerde klinische isolaten werden behandeld in het Biosafety Cabinet (BSL2) en er werd de grootst mogelijke zorg besteed aan het hanteren van bacteriële isolaten tijdens de experimenten. De commerciële details van alle reagentia/oplossingen zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Bereiding van chroom-azurolsulfonaat (CAS)-kleurstof en agarmedia

  1. Bereid CAS-kleurstof (100 ml) met de volgende samenstelling:
    1. Los 60 mg CAS op in 50 ml gedestilleerd water (oplossing 1).
    2. Los 2,7 mg FeCl3·6H2O op in 10 ml 10 mM HCl (oplossing 2).
    3. Los 73 mg cetrimoniumbromide (HDTMA) op in 40 ml gedestilleerd water (oplossing 3).
    4. Meng Oplossing 1, Oplossing 2 en Oplossing 3 zorgvuldig. Bewaar het in een glazen fles.
  2. Bereid CAS-agar volgens de onderstaande stappen:
    1. Voeg 100 ml MM9-zoutoplossing toe aan 750 ml gedestilleerd water.
    2. Los 32,24 g piperazine-N,N'-bis(2-ethaansulfonzuur) (PIPES) vrij zuur op.
    3. Voeg 15 g Agar-agar toe. Autoclaaf en laat afkoelen.
    4. Voeg 30 ml steriele Casaminozuuroplossing en 10 ml steriele 20% glucoseoplossing toe aan het mengsel.
    5. Voeg 100 ml CAS-kleurstof toe, meng en giet het in aseptische omstandigheden.
      OPMERKING: Bereiding van MM9-media, Casaminozuuroplossing en 8-Hydroxyquinoline zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. PIPES-buffer is pH-gevoelig. Het lost pas op als de pH 5,6 is bereikt. Zorg ervoor dat de pH constant wordt gecontroleerd, want wanneer PIPES begint op te lossen in water, zal dit de pH verder verlagen. Extract Casaminozuur met hetzelfde volume van 3% 8-hydroxyquinoline opgelost in chloroform. Laat de niet-mengbare oplossing ongeveer 20 minuten op 4 °C staan en vang voorzichtig de bovenste fase van de oplossing op zonder de onderste fase te verstoren.

2. Kwalitatieve analyse van de productie van sideroforen

  1. Stel de OD600 nm in op 0,2 voor 24 uur gekweekte culturen van P. aeruginosa.
  2. Gebruik een steriele draadlus om de bacteriecultuur op een CAS-agarplaat te strepen.
  3. Incubeer bij 30 °C gedurende 24 uur.
    OPMERKING: Peptonwatermedia of 0,8% normale zoutoplossing kunnen worden gebruikt om de bacteriecultuur te verdunnen. Als er na 24 uur geen bacteriegroei wordt waargenomen, incubeer dan CAS-platen gedurende 48 tot 72 uur.

3. Kwantitatieve schatting van het totale aantal sideroforen

  1. Inoculeer 24-uurs gekweekte culturen van P. aeruginosa opnieuw in Peptone-watermedia na aanpassing van de OD600 nm tot 0,25 nm en incubeer gedurende 48 uur bij 30 °C.
  2. Centrifugeer na 48 uur de bacteriecultuur bij 4650 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg na het centrifugeren 100 μL celvrij supernatans toe aan een microtiterplaat met 96 putjes en voeg er 100 μL CAS-kleurstof aan toe.
  4. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Voer na incubatie spectrofotometrische metingen uit bij 630 nm.
  6. Bereken de resultaten die zijn verkregen voor de kwantificering van de totale sideroforen als Percent Siderophore Unit (PSU).
    OPMERKING: PSU kan worden berekend als: [(Ar - As)/Ar] x 100
    waarbij: Ar = extinctie van de referentie bij 630 nm, As = extinctie van het celvrije supernatans van het monster. Ter referentie moet CAS-kleurstof worden toegevoegd aan niet-geïnoculeerde peptonwatermedia. Vul al het glaswerk, zoals reageerbuisjes, kolven, enz., gedurende 2 uur met 6 M HCl en spoel het tweemaal af met gedestilleerd water om eventuele sporen van ijzer te verwijderen.

4. Kwantitatieve schatting van pyoverdine

  1. Inoculeer 24-uurs gekweekte culturen van P. aeruginosa opnieuw in Peptone-watermedia na aanpassing van de OD600 nm tot 0,25 en incubeer gedurende 48 uur bij 30 °C.
  2. Meet na 48 uur de OD600 nm van de bacteriegroei voordat u verder gaat.
  3. Centrifugeer de bacteriecultuur bij 4650 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Voeg na het centrifugeren 100 μL celvrij supernatans toe aan een microtiterplaat met 96 putjes en voeg er 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) aan toe.
  5. Voer spectrofotometrische metingen uit bij OD405 nm.

5. Pyochelin-extractie en spectrofotometrie

  1. Inoculeer 24-uurs gekweekte culturen van P. aeruginosa opnieuw in King's B-media (aanvullend bestand 1) na aanpassing van de OD600 nm tot 0,25 en incubeer gedurende 24 uur bij 30 °C.
  2. Neem na 24 uur 100 ml cultuur en centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 4650 x g .
  3. Voeg na het centrifugeren 5 ml citroenzuur van 1 M toe aan het supernatant. Extraheer tweemaal met 50 ml ethylacetaat.
  4. Filtreer de organische fase met magnesiumsulfaat door een spuitfilter. Bewaar de gefilterde organische fase bij -20 °C.
  5. Voer spectrofotometrische metingen uit bij 320 nm.
    OPMERKING: Aangezien pyochelin bij kamertemperatuur een zeer onstabiele verbinding is, voert u het extractieproces uit op ijs. Gebruik een steriele spuit van 50 ml voor het scheiden van het filter. Leg het wattenstaafje aan de punt van de spuit en voeg er 1 g magnesiumsulfaat aan toe. Bevestig een steriel spuitfilter aan de punt van de spuit en vang het filtraat op in een steriele buis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vóór de kwantificering van sideroforen uit klinische isolaten werd een kwalitatieve screening van de productie van sideroforen uitgevoerd om de productie van sideroforen te garanderen. Kwalitatieve detectie van sideroforen uit klinische isolaten werd waargenomen door strepen van bacteriën op CAS-agarplaten. Drie klinische isolaten, namelijk MR1, TL7, J3, samen met PAO1 (de referentiestam), werden geselecteerd voor de studie. Alle drie de klinische isolaten en PAO1 lieten positieve resultaten zien voor de productie van sideroforen, waarbij een duidelijke oranje halo rond de bacteriegroei op het blauwe agaroppervlak duidde op een positieve productie van siderofoor (Figuur 1). De halovorming op de CAS-agar (figuur 1) gaf een ruwe schatting van de productie van sideroforen door klinische isolaten. Daarom werd een kwantitatieve schatting van de productie van sideroforen uitgevoerd met behulp van CAS-reagens en vloeibare media.

Totale siderophore-kwantificering werd rechtstreeks uitgevoerd vanuit de celvrije supernatant. Na de incubatie werd een kleurverandering waargenomen waarbij de gele kleur duidde op de verwijdering van CAS-kleurstof uit het Fe-complex. Hier werd CAS-kleurstof met niet-geïnoculeerde groeimedia gebruikt als controle, die werd gebruikt voor de berekening van sideroforen. Er was geen significant verschil in de totale siderofoor productie in isolaten MR1 en TL7, terwijl er een significante totale siderofoor productie was in J3 in vergelijking met PAO1 (Figuur 2).

Vervolgens werd pyoverdine-kwantificering rechtstreeks uitgevoerd met celvrije supernatanten. Pyoverdines komen vrij in celomgevingen, dus het celvrije supernatans werd gebruikt voor de kwantificering van pyoverdine. Er werd ook een UV-scan uitgevoerd met de spectrofotometer, waarbij de piek bij 380 nm de aanwezigheid van pyoverdine bevestigde (Figuur 3A). Spectrofotometrische metingen werden uitgevoerd bij 405 nm en de resultaten werden geïnterpreteerd als OD405/OD600 nm. Alle isolaten vertoonden pyoverdineproductie, waarbij isolaten MR1 en J3 significant lagere pyoverdine vertoonden in vergelijking met PAO1, terwijl er geen significant verschil werd waargenomen voor TL7 (Figuur 3B).

Pyochelin kan niet direct worden gekwantificeerd uit het celvrije supernatant. Het was niet mogelijk om pyochelin te extraheren uit 1 ml celvrij supernatant, dus werd het geëxtraheerd uit 100 ml celvrij supernatant. Het werd aangezuurd met 1 M citroenzuur. Omdat pyochelin een zeer onstabiele verbinding is, werd het extractieproces uitgevoerd op ijs. Pyochelinedetectie werd uitgevoerd door een UV-scan uit te voeren van een bereik van 300 tot 600 nm, waarbij de piek bij OD320 nm de aanwezigheid van pyochelin bevestigde (Figuur 4A). De kwantificering van pyochéline werd uitgevoerd door spectrofotometrische metingen uit te voeren bij OD320 nm. De berekeningen werden gemaakt door OD320/OD600 te delen. Isolaten MR1, TL7 en J3 vertoonden een significant hogere productie van pyochelin in vergelijking met het referentie-isolaat PAO1 (Figuur 4B).

Vergelijkende sideroforenproductie in verschillende bacteriële groeimedia werd uitgevoerd om de hoeveelheid totale sideroforen geproduceerd in verschillende groeimedia te controleren. Er werden vier verschillende media geselecteerd, waarbij Luria-bouillon, King's B-media en Peptone-water werden geëxtraheerd met 3% 8-hydroxychinoline, en niet-geëxtraheerde Luria-bouillon werd geselecteerd voor het onderzoek. Er was geen significant verschil tussen de productie van siderofoor in geëxtraheerde Luria-bouillon, King's B-media en Pepton-watermedia, terwijl een significant verschil werd waargenomen voor de productie van siderofoor in niet-geëxtraheerde Luria-bouillon.

Figure 1
Figuur 1: Productie van siderofoor op CAS-agar. Groei van P. aeruginosa op CAS-agarplaten van 24-uurs gekweekte culturen werd gespot op CAS-agarplaten en gedurende 24 uur bij 30 °C geïncubeerd. De aanwezigheid van siderofoor wordt aangegeven door een oranje halo rond de bacteriekolonie (PAO1, MR1, TL7 en J3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Totale productie van sideroforen. De totale productie van siderofoor werd beoordeeld voor PAO1 en drie klinische isolaten (MR1, TL7 en J3). 100 μL celvrij supernatans (van PAO1, MR1, TL7 en J3 gekweekt gedurende 24 uur in peptonwaterbouillon) werd toegevoegd aan een microtiterplaat met 96 putjes, waarna er 100 μL CAS-kleurstof aan werd toegevoegd. Er werd een eenrichtings-ANOVA-test uitgevoerd voor statistische significantie. Foutbalken vertegenwoordigen ± standaarddeviatie (SD) tussen drie biologische replicaten. *komt overeen met p < 0,05; ns komt overeen met p > 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Pyoverdine productie. Pyoverdineproductie van P. aeruginosa stam PAO1 en klinische isolaten (MR1, TL7 en J3) beoordeeld na 24 uur groei in peptonwatermedia. De bacterieculturen werden gecentrifugeerd en 100 μL celvrij supernatans werd toegevoegd aan een microtiterplaat met 96 putjes. Daarna werd er 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) aan toegevoegd. Pyoverdine-detectie werd gedaan door UV-spectrofotometrie met een bereik van 350 nm tot 600 nm. Spectrometrische analyse bij 380 nm pyoverdineproductie (A). Kwantificering van de pyoverdineproduktie (B). Foutbalken geven de standaardfout aan ten opzichte van het gemiddelde van drievoudige experimenten. Foutbalken vertegenwoordigen ± SD tussen drie biologische replicaten. komt overeen met p < 0,0001, **komt overeen met p < 0,01 en ns komt overeen met p > 0,05 op basis van de ANOVA-test in één richting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Pyochelin productie. Pyochelineproductie van PAO1 (gebruikt als referentie) en klinische isolaten (MR1, TL7 en J3) met behulp van extractie met ethylacetaat en magnesiumsulfaat. Spectrofotometrische analyse met een bereik van 230 nm tot 400 nm (A). Kwantificering van pyocheline (B). Voor elk isolaat werden drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Foutbalken vertegenwoordigen ± SD tussen drie biologische replicaten. komt overeen met p < 0,001 op basis van de eenrichtings-ANOVA-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Vergelijkende productie van sideroforen in verschillende bacteriële groeimedia. Totale productie van sideroforen in vier verschillende groeimedia waarbij King's B-media, Peptone-watermedia en Luria-bouillon werden geëxtraheerd met 3% 8-hydroxychinoline om er sporen van ijzer uit te verwijderen, en Luria-bouillon (niet-geëxtraheerd) werden geselecteerd. Extractie met 3% 8-hydroxyquinoline werd uitgevoerd door een gelijk volume van 3% 8-hydroxyquinoline aan de media toe te voegen. Foutbalken vertegenwoordigen ± SD tussen drie biologische replicaten. **komt overeen met p < 0,001 en ns komt overeen met p > 0,5 op basis van de eenrichtings-ANOVA-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Mediarecepten die voor deze studie zijn gebruikt. Klik hier om het bestand te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de totale sideroforen en twee verschillende sideroforen van P. aeruginosa, namelijk pyoverdine en pyochelin, te kwantificeren uit het bacteriële celvrije supernatant. In de CAS-agarplatentest vormen CAS-kleurstof en Fe3+-ionen een complex. Wanneer bacteriën sideroforen produceren, doven ze Fe3+-ionen van het CAS-Fe3+-complex, wat leidt tot een kleurverandering rond de bacteriegroei. Deze verandering resulteert in een duidelijke oranje halo rond de bacteriegroei14,15. Hoewel bacteriën direct op CAS-agarplaten kunnen worden gestreept, kunnen de algehele resultaten worden beïnvloed. Het strepen van een groot aantal bacteriële cellen kan een brede oranje halo rond de bacteriegroei creëren, terwijl het gebruik van minder bacteriële cellen kan resulteren in een smalle vrije zone. Om dit aan te pakken, hebben we een uniform aantal bacteriële cellen gestreept door de OD600 aan te passen. Kieskeurige bacteriën kunnen binnen 24 uur resultaten laten zien, terwijl langzaam groeiende bacteriën meer dan 72 uur nodig hebben om de productie van siderofoor aan te tonen.

Voor de kwantitatieve bepaling van het totale aantal sideroforen werd aanvankelijk klassieke spectroscopie gebruikt, waarvoor een aanzienlijk volume supernatans nodig is voor de detectie van sideroforen, waardoor het onpraktisch wordt. De kwantificering van de totale sideroforen wordt nu uitgevoerd met behulp van een plaat met 96 putjes en een gemodificeerde CAS-assay. Deze aanpak heeft geresulteerd in een vermindering van het gebruik van reagentia, bacteriële supernatant, tijd en een grotere nauwkeurigheid in vergelijking met traditionele spectroscopische methoden16. Andere studies hebben ook melding gemaakt van het gebruik van microtiterplaten als een tijdbesparende en efficiëntere methode17. De kwantificering van totale sideroforen met behulp van een microtiterplaat is een efficiënte aanpak gebleken. In deze studie werden 48 uur oude bacterieculturen gekweekt in ijzervrije media geselecteerd voor onderzoek. Er werd ook een vergelijkende studie uitgevoerd om de productie van siderofoor in verschillende groeimedia te beoordelen, zoals Luria-bouillon, Luria-bouillon (geëxtraheerd met 3% 8-hydroxyquinoline), King's B-media (geëxtraheerd met 3% 8-hydroxyquinoline) en Pepton-watermedia (geëxtraheerd met 3% 8-hydroxyquinoline). Er werd waargenomen dat Peptone-watermedia de hoogste hoeveelheid sideroforenproductie vertoonden en daarom werd het geselecteerd voor verdere experimenten. Een grafiek die de productie van sideroforen in verschillende groeimedia weergeeft, is opgenomen in aanvullende figuur 1.

Pyoverdine kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van spectrofluorimetrische metingen, maar alleen van pyoverdine is bekend dat het fluorescentie vertoont. Pyoverdine in complex met Fe3+-ionen vertoont geen fluorescentie18,19. Voor de detectie en kwantificering van pyoverdine werden 48 uur oude bacterieculturen geselecteerd voor studie. Van P. aeruginosa is bekend dat het pyochelin produceert onder aanvankelijke ijzerarme omstandigheden en overschakelt op de productie van pyoverdine na blootstelling aan ernstige ijzerstress. Het is aangetoond dat pyoverdine andere metaalkationen, zoals aluminium, gallium, mangaan en chroom, kan cheleren, maar alleen ijzer wordt met succes naar het celmembraan getransporteerd19.

Net als bij totale sideroforen en pyoverdine kan pyocheline niet rechtstreeks worden gekwantificeerd uit celvrij supernatans en moet het worden geëxtraheerd met behulp van dichloormethaan20. Dichloormethaan is niet mengbaar met het celvrije supernatans en vormt een aparte laag aan de onderkant. In deze studie werden verschillende voedingsmedia getest, waaronder Luria-bouillon, Pepton-water en Casaminozuur-media, maar een aanzienlijke hoeveelheid pyocheline werd verkregen uit King's B-media. Terwijl Hoegy et al. CAA-media in hun protocol hadden gebruikt, hebben we het aangepast met King's B-media, omdat CAA-media geen bacteriegroeiondersteunden 21. De methode werd verder aangepast door voedingsmedia te extraheren met 8-hydroxychinoline om eventuele ijzerresten uit de media te verwijderen, waardoor een ijzerarm medium ontstond. Bovendien bleek de incubatietijd de productie van pyochelin aanzienlijk te beïnvloeden. Dumas et al. toonden aan dat P. aeruginosa overschakelt van pyochelin naar pyoverdine productie onder ernstige ijzerbeperkende omstandigheden12. In deze studie werden pyochelin-extractie en -detectie uitgevoerd uit 24-uurs oude bacterieculturen, aangezien pyochelin niet werd gedetecteerd in 48-uurs culturen. Het volume van het supernatans heeft ook invloed op de detectie van pyochelin, en daarom werd 100 ml celvrij supernatans gebruikt voor extractie. Bovendien was de productie van pyocheline significant hoger in MR1-, TL7- en J3-isolaten, mogelijk als gevolg van bacteriestammen die niet in staat zijn om pyoverdine te produceren ondanks het feit dat ze krachtige ijzerchelatoren hebben22.

Ji et al. introduceerden een nieuwe en gevoelige benadering voor pyochelin-kwantificering, die werd gevalideerd met behulp van LC/MS/MS. Deze methode was echter alleen van toepassing op P. aeruginosa-isolaten uit het sputum van patiënten met cystische fibrose. LC/MS/MS, omdat het een dure opstelling is, is het voor de meeste laboratoria misschien niet betaalbaar23. Visaggio et al. ontwikkelden een bioluminescente biosensor op basis van hele cellen, die snelle, gevoelige en eenstaps pyochelin-kwantificering mogelijk maakt. Deze methode kan echter geen kwantificering opleveren voor de totale hoeveelheid sideroforen en pyoverdine24.

Siderophore-ijzeropnamesystemen zouden een antimicrobiële toepassing kunnen hebben bij de toediening van geneesmiddelen voor multiresistente bacteriën, omdat ze een cruciale rol spelen bij de overleving en virulentie van bacteriën. Deze aanpak kan een nieuwe manier bieden om multiresistente bacteriën te bestrijden25. Geneesmiddelen die niet door het bacteriële celmembraan kunnen dringen, kunnen worden gekoppeld aan een siderofoor en het resulterende Fe-siderophore-complex kan binnen het bacteriële membraan worden getransporteerd26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Auteurs erkennen financiering van DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program en FIST. MR bedankt fellowship ontvangen van SHODH. HP bedankt fellowship ontvangen van CSIR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Agar, Type I HIMEDIA GRM666
8-Hydroxyquinoline Loba Chemie 4151
Casamino Acid SRL Chemicals 68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) HIMEDIA RM4867-100G
Chloroform Merck 1070242521
Chrome azurol sulfonate HIMEDIA RM336-10G
Citric acid Merck 100241
Dextrose monohydrate Merck 108342
Dichloromethane Merck 107020
Ferric chloride hexahydrate HIMEDIA GRM6353
Glass Flasks Borosil 5100021
Glass Test-tubes Borosil 9820U05
Hydrochloric acid SDFCL 20125
King's medium B base HIMEDIA M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts HIMEDIA G013-500G
Magnesium Sulphate  Qualigens 10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer Thermo Scientific 51119200
Peptone Type I, Bacteriological HIMEDIA RM667-500G
PIPES free acid MP Biomedicals 190257
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
Proteose peptone HIMEDIA RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer Shimadzu 2072310058
Sigma Laborzentrifuge Sigma-Aldrich 3-18K
Sodium chloride Qualigens 15915

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 205
Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de productie van siderofoor van <em>Pseudomonas aeruginosa</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathod, M., Patel, H., Gajjar, D.… More

Rathod, M., Patel, H., Gajjar, D. Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (205), e65980, doi:10.3791/65980 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter