Summary
פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ידוע בייצור מגוון רחב של גורמי אלימות כדי לבסס זיהומים בפונדקאי. מנגנון אחד כזה הוא ניקוי ברזל באמצעות ייצור סידרופור. P. aeruginosa מייצר שני סידרופורים שונים: פיוכלין, שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל, ופיוברדין, שיש לו זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל. דו"ח זה מדגים כי ניתן לכמת פיוברדין ישירות מסופרנאטנטים חיידקיים, בעוד שפיוכלין צריך להיות מופק מסופרנאטנטים לפני הכימות.
השיטה העיקרית לניתוח איכותי של ייצור סידרופור היא בדיקת צלחת אגר כרום אזורול סולפונט (CAS). בבדיקה זו, שחרור צבע CAS מקומפלקס Fe3+-Dye מוביל לשינוי צבע מכחול לכתום, מה שמצביע על ייצור סידרופור. לצורך כימות הסידרופורים הכולל, סופרנאטנטים חיידקיים עורבבו בפרופורציות שוות עם צבע CAS בלוח מיקרוטיטר, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי ב-630 ננומטר. פיוברדין כומת ישירות מהסופרנאטנט החיידקי על ידי ערבובו בפרופורציות שוות עם 50 מילימטר Tris-HCl, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי. שיא של 380 ננומטר אישר את נוכחותו של pyoverdine. באשר לפיוכלין, כימות ישיר מהסופרנאטנט החיידקי לא היה אפשרי, ולכן היה צורך לחלץ אותו תחילה. ניתוח ספקטרופוטומטרי שנערך לאחר מכן גילה נוכחות של פיוכלין, עם שיא של 313 ננומטר.
Introduction
אורגניזמים זקוקים לברזל כדי לבצע פונקציות חיוניות שונות, כגון הובלת אלקטרונים ושכפול דנ"א1. Pseudomonas aeruginosa, פתוגן אופורטוניסטי גראם-שלילי, ידוע כבעל מגוון גורמים אלימים לביסוס זיהום בפונדקאי, ביניהם מנגנון אחד הוא היווצרות סידרופור2. בתנאים של דלדול ברזל, P. aeruginosa משחרר מולקולות מיוחדות שנקראות סידרופורים, אשר מרווה ברזל מהסביבה. Siderophores chelate ברזל extracellularly, ואת קומפלקס ferric-siderophore וכתוצאה מכך מועבר באופן פעיל בחזרה לתא3.
P. aeruginosa ידוע לייצר שני siderophores, pyoverdine ו pyochelin. ידוע שפיוברדין הוא בעל זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל (1:1), ואילו פיוכלין ידוע כבעל זיקה פחותה לתצבית ברזל (2:1)4. פיוכלין נקרא גם סידרופור משני מכיוון שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל5. הייצור והרגולציה של סידרופורים נשלטים באופן פעיל על ידי מערכות חישת מניין (QS) ב- P. aeruginosa6.
מלבד מרווה ברזל, סידרופורים מעורבים גם בוויסות גורמי אלימות וממלאים תפקיד פעיל בהיווצרות ביופילם7. סידרופורים ממלאים תפקידים חיוניים נוספים, כולל מעורבות באיתות תאי, הגנה מפני עקה חמצונית והקלה על אינטראקציות בין קהילות מיקרוביאליות8. סידרופורים מסווגים בדרך כלל על בסיס הקבוצות הפונקציונליות הספציפיות שדרכן הם מכלכים ברזל. שלושת הליגנדים הדו-שינטיים העיקריים בסיווג זה הם קטכולאט, הידרוקסאמט ו-α-הידרוקסי-קרבוקסילט3. Pyoverdines הם סימני היכר של מיני Pseudomonas פלואורסצנטיים כגון P. aeruginosa ו P. fluorescens5. הם מורכבים מכרומופור פלואורסצנטי ירוק מעורב המחובר לאוליגופפטיד המכיל 6-12 חומצות אמינו. מספר סינתזות פפטידיות לא ריבוזומליות (NRPs) מעורבות בסינתזה שלהן9. ארבעה גנים המעורבים בייצור ובוויסות של פיוברדין הם pvdL, pvdI, pvdJ ו-pvdD10. פיברדין אחראי גם לזיהום ולאלימות ביונקים11. P. aeruginosa ידוע לייצר pyochelin בתנאים מתונים הגבלת ברזל, בעוד pyoverdine מיוצר בסביבות חמורות הגבלת ברזל12. שני אופרונים המעורבים בייצור פיוכלין הם pchDCBA ו-pchEFGHI13. יצוין כי בנוכחות pyocyanin, pyochelin (catecholate) גורם נזק חמצוני ודלקת ומייצר רדיקלים hydroxyl, אשר מזיקים לרקמות המארח11.
בדיקת Chrome Azurol Sulfonate (CAS) מאומצת באופן נרחב בשל מקיפותה, רגישותה הגבוהה ונוחותה הרבה יותר בהשוואה לבדיקות מיקרוביולוגיות, אשר, למרות רגישותן, יכולות להיות ספציפיות מדי14. בדיקת CAS יכולה להתבצע על משטחי אגר או בתמיסה. הוא מסתמך על שינוי הצבע המתרחש כאשר יון הברזל עובר מהקומפלקס הכחול העז שלו לכתום. בדיקת CAS colorimetric מכמתת את דלדול הברזל מקומפלקס טרינרי Fe-CAS-surfactant. קומפלקס מסוים זה, המורכב ממתכת, צבע אורגני וחומרים פעילי שטח, הוא בעל צבע כחול ומציג שיא ספיגה של 630 ננומטר.
דו"ח זה מציג שיטה לזיהוי איכותי של ייצור סידרופורים, שבה ניתן לזהות ייצור של סידרופורים על צלחת אגר. שיטה להערכה כמותית של סך ייצור הסידרופורים בצלחת מיקרוטיטר וזיהוי וניתוח כמותי של שני סידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין, מ- P. aeruginosa, מסופקת גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המבודדים החיידקיים של P. aeruginosa התקבלו ממעבדות מיקרוביולוגיה רפואית מוואדודרה וג'איפור, הודו. כל המבודדים הקליניים שנבחרו טופלו בארון הבטיחות הביולוגית (BSL2) וננקטה זהירות מרבית בעת הטיפול במבודדים חיידקיים במהלך הניסויים. הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים/פתרונות מופיעים בטבלת החומרים.
1. הכנת צבע כרום אזורול סולפונט (CAS) ומדיה אגר
- הכן צבע CAS (100 מ"ל) עם הרכב הבא:
- יש להמיס 60 מ"ג CAS ב-50 מ"ל מים מזוקקים (תמיסה 1).
- יש להמיס 2.7 מ"ג של FeCl3·6H2O ב-10 מ"ל של 10 mM HCl (תמיסה 2).
- להמיס 73 מ"ג של Cetrimonium bromide (HDTMA) ב 40 מ"ל של מים מזוקקים (תמיסה 3).
- ערבב בזהירות את פתרון 1, פתרון 2 ופתרון 3. אחסנו אותו בבקבוק זכוכית.
- הכינו אגר CAS לפי השלבים הבאים:
- הוסף 100 מ"ל של תמיסת מלח MM9 ל 750 מ"ל של מים מזוקקים.
- ממיסים 32.24 גרם של חומצה חופשית פיפרזין-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES).
- מוסיפים 15 גרם אגר אגר. Autoclave ולאפשר לו להתקרר.
- הוסף 30 מ"ל של תמיסת חומצות קאמינו סטריליות ו -10 מ"ל של תמיסת גלוקוז סטרילית 20% לתערובת.
- מוסיפים 100 מ"ל צבע CAS, מערבבים ויוצקים בתנאים אספטיים.
הערה: הכנת מדיה MM9, תמיסת חומצות קאמינו ו- 8-הידרוקסיקינולין מסופקים בקובץ משלים 1. מאגר PIPES רגיש ל- pH. זה לא יתמוסס עד pH 5.6 מושגת. ודא כי ה- pH מנוטר כל הזמן מכיוון שכאשר PIPES מתחיל להתמוסס במים, זה יוריד עוד יותר את ה- pH. לחלץ חומצת קאמינו באותו נפח של 3% 8-hydroxyquinoline מומס כלורופורם. השאירו את התמיסה הבלתי ניתנת להפרכה על 4°C למשך כ-20 דקות ואספו בזהירות את השלב העליון של התמיסה מבלי להפריע לשלב התחתון.
2. ניתוח איכותי של ייצור סידרופורים
- הגדר את OD600 ננומטר ל- 0.2 עבור תרביות שגדלו ב- 24 שעות של P. aeruginosa.
- בעזרת לולאת תיל סטרילית, פזרו את תרבית החיידקים על צלחת אגר CAS.
- לדגור ב 30 ° C במשך 24 שעות.
הערה: ניתן להשתמש במי פפטון או במי מלח רגילים של 0.8% כדי לדלל את תרבית החיידקים. אם לא נצפתה צמיחת חיידקים במשך 24 שעות, דגרו על לוחות CAS במשך 48 עד 72 שעות.
3. אומדן כמותי של סך הסידרופורים
- יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במצע המים של פפטון לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25, ולדגור ב-30°C למשך 48 שעות.
- לאחר 48 שעות, צנטריפוגו את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של צבע CAS אליו.
- מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
- לאחר הדגירה, בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- 630 ננומטר.
- חשב את התוצאות המתקבלות לכימות של סך כל הסידרופורים כיחידת סיידרופור אחוז (PSU).
הערה: ניתן לחשב ספק כוח כ: [(Ar - As)/Ar] x 100
כאשר,A r = ספיגה של הייחוס ב 630 ננומטר, As = ספיגה של supernatant ללא תאים של הדגימה. לשם השוואה, יש להוסיף צבע CAS למצע מי פפטון לא מחוסנים. מלאו את כל כלי הזכוכית, כגון מבחנות, צלוחיות וכו', ב-6 M HCl למשך שעתיים ושטפו אותם פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר כל זכר ברזל עליהם.
4. הערכה כמותית של pyoverdine
- יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגודלו ב-24 שעות במדיית המים של פפטון לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C במשך 48 שעות.
- לאחר 48 שעות, מדדו את OD600 ננומטר של צמיחת החיידקים לפני שתמשיכו הלאה.
- צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) אליו.
- בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- OD405 nm.
5. מיצוי פיוכלין וספקטרופוטומטריה
- יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במדיה של King's B (קובץ משלים 1) לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C למשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, קח 100 מ"ל של תרבית וצנטריפוגה ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הצנטריפוגה, להוסיף 5 מ"ל של 1 M חומצת לימון supernatant. לחלץ פעמיים עם 50 מ"ל של אתיל אצטט.
- מסננים את השלב האורגני עם מגנזיום גופרתי דרך מסנן מזרק. אחסנו את הפאזה האורגנית המסוננת בטמפרטורה של -20°C.
- בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ברזולוציה של 320 ננומטר.
הערה: מכיוון שפיוכלין היא תרכובת מאוד לא יציבה בטמפרטורת החדר, בצע את תהליך המיצוי על קרח. השתמש מזרק סטרילי 50 מ"ל להפרדת המסנן. מניחים כותנה בקצה המזרק ומוסיפים עליו 1 גרם מגנזיום גופרתי. מקבעים מסנן מזרק סטרילי בקצה המזרק ואוספים את התסנין בצינור סטרילי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני כימות של סידרופורים ממבודדים קליניים, בוצע סינון איכותי לייצור סידרופורים כדי להבטיח ייצור סידרופורים. זיהוי איכותי של סידרופורים ממבודדים קליניים נצפה על ידי חיידקים מפוספסים על לוחות אגר CAS. שלושה מבודדים קליניים, כלומר MR1, TL7, J3, יחד עם PAO1 (זן הייחוס), נבחרו למחקר. כל שלושת המבודדים הקליניים ו-PAO1 הראו תוצאות חיוביות לייצור סידרופורים, כאשר הילה כתומה ברורה סביב צמיחת החיידקים על משטח האגר הכחול הצביעה על ייצור סידרופור חיובי (איור 1). היווצרות ההילה על אגר CAS (איור 1) נתנה הערכה גסה של ייצור סידרופור על-ידי מבודדים קליניים. לפיכך, בוצעה הערכה כמותית של ייצור סידרופור באמצעות מגיב CAS ומדיה נוזלית.
כימות סידרופור כולל בוצע ישירות מהסופרנטנט נטול התא. לאחר הדגירה, נצפה שינוי צבע שבו צבע צהוב הצביע על הסרת צבע CAS מקומפלקס Fe. כאן, צבע CAS עם מדיה גידול לא מחוסנת שימש כבקרה, אשר נלקח לחישוב siderophores. לא היה הבדל משמעותי בייצור הסידרופור הכולל ב-MR1 וב-TL7 מבודדים, בעוד שהיה ייצור סידרופור כולל משמעותי ב-J3 בהשוואה ל-PAO1 (איור 2).
לאחר מכן, כימות פיוברדין בוצע ישירות מסופרנאטנטים נטולי תאים. פירוברדינים משתחררים בסביבות תאיות, ולכן הסופרנאטנט נטול התאים שימש לכימות פיוברדין. בוצעה גם סריקת טווח UV על-ידי הספקטרופוטומטר, שבה השיא של 380 ננומטר אישר את נוכחותו של פיוברדין (איור 3A). קריאות ספקטרופוטומטריות נלקחו ב-405 ננומטר, והתוצאות פורשו כ-OD405/OD600 ננומטר. כל המבודדים הראו ייצור פיוברדין, כאשר מבודדים MR1 ו-J3 הראו פיוברדין נמוך משמעותית בהשוואה ל-PAO1, בעוד שלא נצפה הבדל משמעותי עבור TL7 (איור 3B).
לא ניתן לכמת את הפיוכלין ישירות מהסופרנטנט נטול התא. לא ניתן היה לחלץ פיוכלין מ-1 מ"ל של סופרנטנט נטול תאים, ולכן הוא הופק מ-100 מ"ל של סופרנטנט נטול תאים. זה היה acidified עם 1 M חומצת לימון. מכיוון שפיוכלין היא תרכובת מאוד לא יציבה, תהליך המיצוי בוצע על קרח. זיהוי פיוכלין בוצע על-ידי הפעלת סריקת טווח UV מטווח של 300 עד 600 ננומטר, כאשר השיא ב-OD320 ננומטר אישר את נוכחותו של פיוכלין (איור 4A). כימות פיוכלין בוצע על ידי לקיחת קריאות ספקטרופוטומטריות ב-OD320 ננומטר. החישובים נעשו על ידי חלוקת OD320/OD600. מבודדים MR1, TL7 ו-J3 הראו ייצור גבוה משמעותית של פיוכלין בהשוואה למבודד הייחוס PAO1 (איור 4B).
בוצע ייצור סידרופור השוואתי במצעי גידול חיידקים שונים כדי לבדוק את כמות הסידרופורים הכוללת המיוצרת במצעי גידול שונים. נבחרו ארבעה מדיות שונות, כאשר מרק לוריא, מדיה של המלך B ומי פפטון הופקו עם 3% 8-הידרוקסיקווינולין, ומרק לוריא שלא עבר מיצוי נבחר למחקר. לא היה הבדל משמעותי בין ייצור סידרופור במרק לוריא מופק, מדיה של המלך B ומצע המים של פפטון, בעוד שהבדל משמעותי נצפה בייצור סידרופור במרק לוריא שלא חולץ.
איור 1: ייצור סידרופור על אגר CAS. צמיחה של P. aeruginosa על צלחות אגר CAS של תרביות 24-h נצפתה על לוחות אגר CAS והודגרה ב 30 ° C במשך 24 שעות. נוכחות סידרופור מסומנת על ידי הילה כתומה סביב מושבת החיידקים (PAO1, MR1, TL7 ו-J3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סך כל ייצור הסיידרופורים. סך הייצור הסידרופור הוערך עבור PAO1 ושלושה מבודדים קליניים (MR1, TL7 ו-J3). 100 μL של סופרנאטנט נטול תאים (של PAO1, MR1, TL7 ו-J3 שגודלו במשך 24 שעות בציר מי פפטון) נוסף לצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות, ולאחר מכן 100 מיקרוליטר של צבע CAS נוסף אליו. בדיקת ANOVA חד-כיוונית בוצעה למובהקות סטטיסטית. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן ± (SD) בין שלושה משכפלים ביולוגיים. *מתאים ל-P < 0.05; NS מתאים ל - P > 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצור פיוברדין. ייצור פיוברדין של זן P. aeruginosa PAO1 ומבודדים קליניים (MR1, TL7 ו-J3) הוערך לאחר 24 שעות של גידול במצע מי הפפטון. תרביות החיידקים עברו צנטריפוגה, ו-100 מיקרוליטר של סופרנאטנט נטול תאים נוסף לצלחת מיקרוטיטר בת 96 בארות. לאחר מכן, 100 μL של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) נוסף אליו. זיהוי פירוברדין נעשה על ידי ספקטרופוטומטריה UV עם טווח של 350 ננומטר עד 600 ננומטר. ניתוח ספקטרומטרי ב 380 ננומטר של ייצור pyoverdine (A). כימות ייצור פיוברדין (B). קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן מעל הממוצע של ניסויים משולשים. קווי שגיאה מייצגים ± SD בין שלושה עותקים ביולוגיים. מתאים ל-p < 0.0001, **מתאים ל-p < 0.01, ו-ns מתאים ל-p > 0.05 בהתבסס על מבחן ANOVA חד-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ייצור פיוכלין. ייצור פיוכלין של PAO1 (משמש כנקודת התייחסות) ומבודד קליני (MR1, TL7 ו-J3) באמצעות מיצוי עם אתיל אצטט ומגנזיום גופרתי. אנליזה ספקטרופוטומטרית בטווח שבין 230 ננומטר ל-400 ננומטר (A). כימות של פיוכלין (B). שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו עבור כל מבודד. קווי שגיאה מייצגים ± SD בין שלושה עותקים ביולוגיים. מתאים p < 0.001 מבוסס על מבחן ANOVA בכיוון אחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: ייצור סידרופורים השוואתיים במצעי גדילה שונים של חיידקים. סך כל ייצור הסידרופורים בארבעה מצעי גידול שונים, כאשר מדיית קינג B, מצע המים פפטון ומרק לוריא הופקו עם 3% 8-הידרוקסי-קינולין כדי להסיר ברזל קורט ממנו, ומרק לוריא (שלא חולץ). מיצוי של 3% 8-hydroxyquinoline בוצע על ידי הוספת נפח שווה של 3% 8-hydroxyquinoline למדיה. קווי שגיאה מייצגים ± SD בין שלושה עותקים ביולוגיים. **מתאים ל-p < 0.001, ו-ns מתאים ל-p > 0.5 בהתבסס על מבחן ANOVA חד-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: מתכוני מדיה ששימשו למחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן לצפייה בקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את סך כל הסידרופורים ושני סידרופורים שונים של P. aeruginosa, כלומר פיוברדין ופיוצ'לין, מהסופרנטנט נטול התאים של החיידקים. במבחן צלחות אגר CAS, צבע CAS ויוני Fe3+ יוצרים קומפלקס. כאשר חיידקים מייצרים סידרופורים, הם מרווים יוני Fe3+ מקומפלקס CAS-Fe3+, מה שמוביל לשינוי צבע סביב צמיחת החיידקים. שינוי זה גורם להילה כתומה ברורה סביב צמיחת החיידקים14,15. בעוד חיידקים יכולים להיות מפוזרים ישירות על לוחות אגר CAS, התוצאות הכלליות עשויות להיות מושפעות. פסיעה של מספר גבוה של תאי חיידקים עשויה ליצור הילה כתומה רחבה סביב צמיחת החיידקים, בעוד ששימוש בפחות תאי חיידקים עלול לגרום לאזור צר וברור. כדי לטפל בכך, יצרנו מספר אחיד של תאי חיידקים על-ידי התאמת OD600. חיידקים מהירים עשויים להראות תוצאות תוך 24 שעות, בעוד שלחיידקים הגדלים לאט עשויות לקחת יותר מ-72 שעות כדי להדגים ייצור סידרופור.
לצורך הקביעה הכמותית של סך הסידרופורים, נעשה שימוש בתחילה בספקטרוסקופיה קלאסית, המחייבת נפח משמעותי של סופרנאטנט לגילוי סידרופור, מה שהופך אותה ללא מעשית. הכימות של סך כל הסידרופורים מתבצע כעת באמצעות לוח 96 בארות עם בדיקת CAS שונה. גישה זו הביאה להפחתה בשימוש בריאגנטים, סופרנטנט חיידקי, זמן, ודיוק מוגבר בהשוואה לשיטות ספקטרוסקופיות מסורתיות16. מחקרים אחרים דיווחו גם על שימוש בלוחות מיקרוטיטר כשיטה חסכונית בזמן ויעילה יותר17. כימות הסידרופורים הכולל באמצעות צלחת מיקרוטיטר הוכח כגישה יעילה. במחקר זה נבחרו לבדיקה תרביות חיידקים בנות 48 שעות שגדלו במצע נטול ברזל. מחקר השוואתי נערך גם כדי להעריך את ייצור הסידרופורים במצעי גידול שונים, כגון ציר לוריא, מרק לוריא (מופק עם 3% 8-הידרוקסיקווינולין), מדיה B של המלך (מופק עם 3% 8-הידרוקסיקווינולין) ומצע מים פפטון (מופק עם 3% 8-הידרוקסיקינולין). נצפה כי מדיית המים של פפטון הציגה את הכמות הגבוהה ביותר של ייצור סידרופור, ולכן היא נבחרה לניסויים נוספים. גרף המתאר ייצור סידרופורים במצעי גידול שונים כלול באיור משלים 1.
ניתן לזהות ולכמת פיוברדין באמצעות קריאות ספקטרופלואורימטריות, אך רק פירוברדין ידוע כבעל פלואורסצנטיות. Pyoverdine בקומפלקס עם Fe3+ יוני אינו מציג פלואורסצנטיות18,19. לצורך זיהוי וכימות, נבחרו תרביות חיידקים בנות 48 שעות למחקר. P. aeruginosa ידוע כמייצר פיוכלין בתנאים התחלתיים של הרעבת ברזל ועובר לייצור פירוברדין לאחר חשיפה לתנאי עקה חמורים של ברזל. הוכח כי פיוברדין יכול לכלאט קטיונים מתכתיים אחרים, כגון אלומיניום, גליום, מנגן וכרום, אך רק ברזל מועבר בהצלחה לקרום התא19.
בדומה לסידרופורים ולפירוברדין, לא ניתן לכמת את הפיוכלין ישירות מסופרנאטנט נטול תאים ויש לחלץ אותו באמצעות דיכלורומתאן20. Dichloromethane הוא בלתי ניתן לערבוב עם supernatant ללא תאים ויוצר שכבה נפרדת בתחתית. במחקר זה נבדקו מצעי תזונה שונים, כולל ציר לוריא, מי פפטון ומצע חומצות קמינו, אך כמות משמעותית של פיוכלין התקבלה ממדיה B של קינג'ס. בעוד Hoegy ואחרים השתמשו במדיה CAA בפרוטוקול שלהם, שינינו אותו עם המדיה של King's B, מכיוון שהמדיה של CAA לא תמכה בצמיחת חיידקים21. השיטה שונתה עוד יותר על ידי מיצוי מדיה תזונתית עם 8-hydroxyquinoline כדי להסיר שאריות ברזל מן התקשורת, יצירת מדיום חסר ברזל. בנוסף, זמן הדגירה נמצא כמשפיע באופן משמעותי על ייצור הפיוכלין. Dumas et al. הדגימו כי P. aeruginosa עובר מייצור פיוכלין לייצור פיוברדין בתנאים חמורים המגבילים ברזל12. במחקר זה, מיצוי וגילוי פיוכלין בוצעו מתרביות חיידקים בנות 24 שעות, שכן פיוכלין לא זוהה בתרביות של 48 שעות. נפח הסופרנאטנט משפיע גם על זיהוי פיוכלין, ולכן נעשה שימוש ב-100 מ"ל של סופרנאטנט נטול תאים לצורך מיצוי. יתר על כן, ייצור הפיוכלין היה גבוה משמעותית במבודדי MR1, TL7 ו-J3, אולי בגלל זני חיידקים שאינם מסוגלים לייצר פיוברדין למרות שיש להם כלטורי ברזל חזקים22.
ג'י ועמיתיו הציגו גישה חדשנית ורגישה לכימות פיוכלין, ואימתו אותה באמצעות LC/MS/MS. עם זאת, שיטה זו מיושמת רק על P. aeruginosa מבודד מן הכיח של חולי סיסטיק פיברוזיס. LC/MS/MS, בהיותה התקנה יקרה, עשויה שלא להיות משתלמת עבור רוב המעבדות23. Visaggio et al. פיתחו ביו-חיישן ביו-לומינסנטי מבוסס תאים שלמים, המאפשר כימות מהיר, רגיש וחד-שלבי של פיוכלין. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה לספק כימות עבור סך כל siderophores ו pyoverdine24.
מערכות ספיגת ברזל סידרופור יכולות להיות בעלות יישום אנטי-מיקרוביאלי בהעברת תרופות עבור חיידקים עמידים לתרופות רבות, שכן הן ממלאות תפקיד מכריע בהישרדות חיידקים ובאלימות. גישה זו עשויה להציע דרך חדשה להילחם בחיידקים עמידים לתרופות25. תרופות שאינן יכולות לחדור את קרום התא החיידקי יכולות להיות מקושרות לסידרופור, וקומפלקס Fe-siderophore שנוצר יכול להיות מועבר בתוך קרום החיידק26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים על מימון DBT - תוכנית הוראת ביוטכנולוגיה, DBT - תוכנית BUILDER ו- FIST. מר תודה מלגת שו"ד. מלגת תודה של HP שהתקבלה מ-CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K.
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J.
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
