Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Pseudomonas aeruginosa से Siderophore उत्पादन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण

Published: March 15, 2024 doi: 10.3791/65980
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

Summary

इस प्रोटोकॉल कुल siderophores के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों प्रदान करता है, pyoverdine, और Pseudomonas aeruginosa से pyochelin.

Abstract

स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (पी. एरुगिनोसा) मेजबान में संक्रमण स्थापित करने के लिए विषाणु कारकों की एक विविध श्रेणी के उत्पादन के लिए जाना जाता है। ऐसा ही एक तंत्र साइडरोफोर उत्पादन के माध्यम से लोहे की सफाई है। एरुगिनोसा दो अलग-अलग साइडरोफोरस पैदा करता है: पायोचेलिन, जिसमें कम लौह-चेलेटिंग आत्मीयता होती है, और पाइओवरडाइन, जिसमें उच्च लौह-चेलेटिंग आत्मीयता होती है। यह रिपोर्ट दर्शाती है कि पाइवरडाइन को सीधे बैक्टीरियल सुपरनेटेंट से मात्रा निर्धारित की जा सकती है, जबकि मात्रा का ठहराव से पहले पाइओकेलिन को सुपरनेटेंट से निकालने की आवश्यकता होती है।

गुणात्मक siderophore उत्पादन का विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक विधि क्रोम Azurol सल्फोनेट (सीएएस) अगर अगर प्लेट परख है. इस परख में, Fe3+-डाई कॉम्प्लेक्स से CAS डाई की रिहाई नीले से नारंगी रंग में परिवर्तन की ओर ले जाती है, जो साइडरोफोर उत्पादन का संकेत देती है। कुल साइडरोफोरस की मात्रा का ठहराव के लिए, बैक्टीरियल सुपरनेटेंट को माइक्रोटिटर प्लेट में सीएएस डाई के साथ समान अनुपात में मिलाया गया था, इसके बाद 630 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। Pyoverdine सीधे 50 मिमी Tris-HCl के साथ बराबर अनुपात में मिश्रण द्वारा बैक्टीरियल सतह पर तैरनेवाला से मात्रा निर्धारित की गई थी, इसके बाद स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। 380 एनएम पर एक चोटी ने पाइवरडाइन की उपस्थिति की पुष्टि की। पायोचेलिन के लिए, बैक्टीरियल सुपरनेटेंट से प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव संभव नहीं था, इसलिए इसे पहले निकाला जाना था। बाद के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण ने 313 एनएम पर एक चोटी के साथ पायोचेलिन की उपस्थिति का खुलासा किया।

Introduction

जीवों को विभिन्न महत्वपूर्ण कार्यों को करने के लिए लोहे की आवश्यकता होती है, जैसे इलेक्ट्रॉन परिवहन और डीएनए प्रतिकृति1. स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, एक ग्राम-नकारात्मक अवसरवादी रोगज़नक़, मेजबान में संक्रमण स्थापित करने के लिए विभिन्न प्रकार के विषाणु कारकों के अधिकारी के रूप में जाना जाता है, जिनमें से एक तंत्र साइडरोफोर गठन2 है। लोहे की कमी की स्थिति के दौरान, पी. एरुगिनोसा साइडरोफोरस नामक विशेष अणुओं को छोड़ता है, जो आसपास के वातावरण से लोहे को बुझाते हैं। साइडरोफोर्स लोहे को बाह्य रूप से काटते हैं, और परिणामस्वरूप फेरिक-साइडरोफोर कॉम्प्लेक्स को सक्रिय रूप से सेल3 में वापस ले जाया जाता है।

एरुगिनोसा को दो साइडरोफोरस, पायओवरडाइन और पायोचेलिन का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है। पायवर्डाइन को उच्च आयरन चेलेटिंग आत्मीयता (1:1) के लिए जाना जाता है, जबकि पायोचेलिन को कम आयरन चेलेटिंग आत्मीयता (2:1)4 के लिए जाना जाता है। पायोकेलिन को द्वितीयक साइडरोफोर भी कहा जाता है क्योंकि इसमें कम आयरन केलेटिंग आत्मीयताहोती है 5. साइडरोफोरस का उत्पादन और विनियमन सक्रिय रूप से कोरम सेंसिंग (क्यूएस) सिस्टम द्वारा नियंत्रित किया जाता है पी. एरुगिनोसा6.

लोहे की शमन के अलावा, साइडरोफोरस भी विषाणु कारकों को विनियमित करने में शामिल हैं और बायोफिल्म गठन7 में सक्रिय भूमिका निभाते हैं। Siderophores अतिरिक्त महत्वपूर्ण भूमिकाओं, सेल संकेत में भागीदारी सहित, ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ रक्षा, और माइक्रोबियल समुदायों8 के बीच बातचीत की सुविधा की सेवा. साइडरोफोरस को आमतौर पर विशिष्ट कार्यात्मक समूहों के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है जिसके माध्यम से वे लोहे को काटते हैं। इस वर्गीकरण में तीन प्राथमिक बिडेंटेट लिगैंड कैटेकोलेट, हाइड्रोक्सामेट और α-हाइड्रॉक्सीकार्बोक्सिलेट3 हैं। Pyoverdines फ्लोरोसेंट Pseudomonas प्रजातियों की पहचान कर रहे हैं जैसे P. aeruginosa और P. fluorescens5. इनमें एक मिश्रित हरे फ्लोरोसेंट क्रोमोफोर होते हैं जो एक ऑलिगोपेप्टाइड के साथ मिलकर होते हैं जिसमें 6-12 अमीनो एसिड होते हैं। कई गैर-राइबोसोमल पेप्टाइड सिंथेटेस (एनआरपी) उनके संश्लेषण9 में शामिल हैं। पाइवरडाइन उत्पादन और विनियमन में शामिल चार जीन पीवीडीएल, पीवीडीआई, पीवीडीजे और पीवीडीडी10 हैं। पायवरडाइन स्तनधारियों में संक्रमण और विषाणु के लिए भी जिम्मेदार है11. पी. aeruginosa मध्यम लौह सीमित शर्तों में pyochelin का उत्पादन करने के लिए उल्लेख किया है, जबकि pyoverdine गंभीर लौह सीमित वातावरण12 के दौरान उत्पादन किया जाता है. पायोचेलिन उत्पादन में शामिल दो ऑपेरॉन pchDCBA और pchEFGHI13 हैं। यह ध्यान दिया जाता है कि pyocyanin की उपस्थिति में, pyochelin (catecholate) ऑक्सीडेटिव क्षति और सूजन लाती है और हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी, जो मेजबान ऊतकों11 के लिए हानिकारक हैं उत्पन्न करता है.

क्रोम Azurol सल्फोनेट (सीएएस) परख व्यापक रूप से अपनी व्यापकता, उच्च संवेदनशीलता, और सूक्ष्मजीवविज्ञानी assays की तुलना में अधिक सुविधा के कारण अपनाया जाता है, जो, हालांकि संवेदनशील, अत्यधिक विशिष्ट14 हो सकता है. सीएएस परख अगर सतहों पर या एक समाधान में आयोजित किया जा सकता है. यह रंग परिवर्तन पर निर्भर करता है जो तब होता है जब फेरिक आयन अपने तीव्र नीले परिसर से नारंगी में परिवर्तित हो जाता है। सीएएस वर्णमिति परख एक Fe-CAS-सर्फैक्टेंट टर्नरी कॉम्प्लेक्स से लोहे की कमी को निर्धारित करता है। धातु, कार्बनिक डाई और सर्फेक्टेंट से मिलकर बने इस विशेष परिसर में एक नीला रंग होता है और 630 एनएम पर एक अवशोषण शिखर प्रदर्शित करता है।

यह रिपोर्ट साइडरोफोर उत्पादन के गुणात्मक पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करती है, जहां कोई अगर प्लेट पर साइडरोफोरस के उत्पादन का पता लगा सकता है। एक माइक्रोटिटर प्लेट में कुल साइडरोफोर उत्पादन के मात्रात्मक अनुमान के लिए एक विधि और दो साइडरोफोरस, पायवरडाइन और पायोचेलिन का पता लगाने और मात्रात्मक विश्लेषण, पी. एरुगिनोसा से भी प्रदान किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

एरुगिनोसा के सभी बैक्टीरियल आइसोलेट्स वडोदरा और जयपुर, भारत से मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं से प्राप्त किए गए थे। सभी चयनित नैदानिक आइसोलेट्स को जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएसएल2) में संभाला गया था और प्रयोगों के दौरान बैक्टीरियल आइसोलेट्स को संभालते समय अत्यधिक सावधानी बरती गई थी। सभी अभिकर्मकों/समाधानों का वाणिज्यिक विवरण सामग्री की तालिका में दिया गया है।

1. क्रोम Azurol सल्फोनेट (सीएएस) डाई और अगर मीडिया की तैयारी

  1. निम्नलिखित संरचना के साथ सीएएस डाई (100 एमएल) तैयार करें:
    1. आसुत जल (समाधान 1) के 50 एमएल में 60 मिलीग्राम सीएएस भंग।
    2. 10 एमएम एचसीएल (समाधान 2) के 10 एमएल में 2.7 मिलीग्राम FeCl3·6H2O को भंग करें।
    3. आसुत जल (समाधान 3) के 40 एमएल में 73 मिलीग्राम सेट्रिमोनियम ब्रोमाइड (एचडीटीएमए) को भंग करें।
    4. समाधान 1, समाधान 2 और समाधान 3 को ध्यान से मिलाएं। इसे कांच की बोतल में स्टोर करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सीएएस अगर तैयार करें:
    1. आसुत जल के 750 एमएल के लिए एमएम 9 नमक समाधान के 100 एमएल जोड़ें।
    2. 32.24 ग्राम पाइपरज़ीन-एन, एन'-बीआईएस (2-एथेनेसल्फोनिक एसिड) (पाइप्स) मुक्त एसिड को भंग करें।
    3. 15 ग्राम अगर अगर डालें। आटोक्लेव करें और इसे ठंडा होने दें।
    4. मिश्रण में बाँझ कैसामिनो एसिड समाधान के 30 एमएल और बाँझ 20% ग्लूकोज समाधान के 10 एमएल जोड़ें।
    5. सीएएस डाई के 100 एमएल जोड़ें, मिश्रण, और सड़न रोकनेवाला स्थिति में डालना.
      नोट: एमएम 9 मीडिया, कैसामिनो एसिड समाधान, और 8-हाइड्रोक्सीक्विनोलिन की तैयारी पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की जाती है। पाइप्स बफर पीएच-संवेदनशील है। पीएच 5.6 प्राप्त होने तक यह भंग नहीं होगा। सुनिश्चित करें कि पीएच की लगातार निगरानी की जाती है क्योंकि जब पाइप पानी में घुलने लगता है, तो यह पीएच को और कम कर देगा। क्लोरोफॉर्म में भंग 3% 8-हाइड्रॉक्सीक्विनोलिन की समान मात्रा के साथ कैसामिनो एसिड निकालें। लगभग 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अमिश्रणीय समाधान छोड़ दें और ध्यान से निचले चरण को परेशान किए बिना समाधान के ऊपरी चरण को इकट्ठा करें।

2. साइडरोफोरस उत्पादन का गुणात्मक विश्लेषण

  1. पी aeruginosa के 24 घंटे उगाया संस्कृतियों के लिए 0.2 के लिए आयुध डिपो600 एनएम सेट करें.
  2. एक बाँझ तार पाश का प्रयोग, एक सीएएस अगर प्लेट पर जीवाणु संस्कृति लकीर.
  3. 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: पेप्टोन पानी मीडिया या 0.8% सामान्य खारा बैक्टीरिया संस्कृति को पतला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यदि 24 घंटे में कोई जीवाणु विकास नहीं देखा जाता है, तो 48 से 72 घंटे के लिए सीएएस प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

3. कुल साइडरोफोर का मात्रात्मक अनुमान

  1. 0.25 के लिए आयुध डिपो600 समायोजित करने के बाद पेप्टोन पानी मीडिया में पी. aeruginosa के 24 घंटे उगाया संस्कृतियों को फिर से टीका लगाना, और 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  2. 48 घंटे के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4650 x ग्राम पर जीवाणु संस्कृति अपकेंद्रित्र.
  3. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में सेल-फ्री सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोन जोड़ें और इसमें सीएएस डाई के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. इनक्यूबेशन बाद, 630 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग लें।
  6. प्रतिशत साइडरोफोर यूनिट (पीएसयू) के रूप में कुल साइडरोफोरस की मात्रा का ठहराव के लिए प्राप्त परिणामों की गणना करें।
    नोट: पीएसयू की गणना इस प्रकार की जा सकती है: [(एआर - एएस)/एआर] x 100
    जहां, एआर = 630 एनएम पर संदर्भ का अवशोषण, एएस = नमूने के सेल-मुक्त सतह पर तैरनेवाला का अवशोषण। संदर्भ के लिए, सीएएस डाई uninoculated पेप्टोन पानी मीडिया के लिए जोड़ा जाना चाहिए. सभी कांच के बने पदार्थ, जैसे टेस्ट ट्यूब, फ्लास्क, आदि को 2 घंटे के लिए 6 एम एचसीएल से भरें और उन पर लोहे के किसी भी निशान को हटाने के लिए आसुत जल से दो बार कुल्ला करें।

4. पाइवरडाइन का मात्रात्मक अनुमान

  1. 0.25 के लिए आयुध डिपो600 को समायोजित करने और 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते के बाद पेप्टोन पानी मीडिया में पी. aeruginosa के 24 घंटे उगाया संस्कृतियों फिर से टीका लगाना.
  2. 48 घंटे के बाद, आगे बढ़ने से पहले बैक्टीरिया के विकास के आयुध डिपो600 एनएम को मापें।
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4650 x ग्राम पर जीवाणु संस्कृति अपकेंद्रित्र.
  4. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में सेल-फ्री सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोन जोड़ें और इसमें 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  5. आयुध डिपो405 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग ले लो.

5. पायोशेलिन निष्कर्षण और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री

  1. राजा के बी मीडिया (पूरक फ़ाइल 1) में पी aeruginosa के 24-एच विकसित संस्कृतियों को फिर से टीका आयुध डिपो 0.25 करने के लिए आयुध डिपो600 और 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं समायोजित करने के बाद.
  2. 24 घंटे के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4650 x ग्राम पर संस्कृति और अपकेंद्रित्र के 100 एमएल लें।
  3. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला में 1 एम साइट्रिक एसिड के 5 एमएल जोड़ें। एथिल एसीटेट के 50 एमएल के साथ दो बार निकालें।
  4. एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मैग्नीशियम सल्फेट के साथ कार्बनिक चरण को फ़िल्टर करें। फ़िल्टर किए गए कार्बनिक चरण को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 320 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग ले लो.
    नोट: चूंकि पायोचेलिन कमरे के तापमान पर एक अत्यधिक अस्थिर यौगिक है, इसलिए बर्फ पर निष्कर्षण प्रक्रिया करें। फिल्टर पृथक्करण के लिए एक 50 एमएल बाँझ सिरिंज का प्रयोग करें. सिरिंज की नोक पर रुई रखें और उस पर 1 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट मिलाएं। सिरिंज की नोक पर एक बाँझ सिरिंज फिल्टर को ठीक करें और एक बाँझ ट्यूब में छानना इकट्ठा करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

नैदानिक आइसोलेट्स से साइडरोफोरस की मात्रा का ठहराव करने से पहले, साइडरोफोर उत्पादन के लिए गुणात्मक स्क्रीनिंग साइडरोफोर उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए की गई थी। नैदानिक आइसोलेट्स से साइडरोफोरस का गुणात्मक पता लगाना सीएएस अगर प्लेटों पर स्ट्रीकिंग बैक्टीरिया द्वारा देखा गया था। पीएओ 1 (संदर्भ तनाव) के साथ एमआर 1, टीएल 7, जे 3 नामक तीन नैदानिक आइसोलेट्स को अध्ययन के लिए चुना गया था। सभी तीन नैदानिक आइसोलेट्स और पीएओ 1 ने साइडरोफोर उत्पादन के लिए सकारात्मक परिणाम दिखाए, जहां नीले अगर सतह पर बैक्टीरिया के विकास के चारों ओर एक स्पष्ट नारंगी प्रभामंडल ने सकारात्मक साइडरोफोर उत्पादन(चित्रा 1)का संकेत दिया। सीएएस अगर (चित्रा 1) पर प्रभामंडल गठन नैदानिक आइसोलेट्स द्वारा साइडरोफोर उत्पादन का एक मोटा अनुमान दिया। इसलिए, सीएएस अभिकर्मक और तरल मीडिया का उपयोग करके साइडरोफोर उत्पादन का मात्रात्मक अनुमान किया गया था।

कुल साइडरोफोर परिमाणीकरण सीधे सेल-मुक्त सतह पर तैरनेवाला से किया गया था। इनक्यूबेशन के बाद, एक रंग परिवर्तन देखा गया जहां पीले रंग ने Fe-कॉम्प्लेक्स से CAS डाई को हटाने का संकेत दिया। यहां, uninoculated विकास मीडिया के साथ सीएएस डाई नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो siderophores गणना के लिए लिया गया था. एमआर 1 और टीएल 7 को अलग करने में कुल साइडरोफोर उत्पादन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जबकि पीएओ 1 (चित्रा 2) की तुलना में जे 3 में एक महत्वपूर्ण कुल साइडरोफोर उत्पादन था।

इसके बाद, पायवर्डाइन मात्रा का ठहराव सीधे सेल-फ्री सुपरनेटेंट से किया गया था। Pyoverdines सेल वातावरण में जारी कर रहे हैं, तो सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला pyoverdine मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा एक यूवी रेंज स्कैन भी किया गया था, जहां 380 एनएम पर चोटी ने पाइवरेडाइन(चित्रा 3ए)की उपस्थिति की पुष्टि की। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग 405 एनएम पर ली गई थी, और परिणामों की व्याख्या ओडी405/ओडी600 एनएम के रूप में की गई थी। सभी आइसोलेट्स ने पाइओवरडाइन उत्पादन दिखाया, जहां एमआर 1 और जे 3 को अलग करता है, पीएओ 1 की तुलना में काफी कम पाइवरडाइन दिखाया गया है, जबकि टीएल 7 (चित्रा 3 बी) के लिए कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था।

पायोकेलिन को सीधे सेल-मुक्त सतह पर तैरनेवाला से निर्धारित नहीं किया जा सकता है। सेल-फ्री सुपरनेटेंट के 1 एमएल से पायोकेलिन निकालना संभव नहीं था, इसलिए इसे 100 एमएल सेल-फ्री सुपरनेटेंट से निकाला गया था। यह 1 एम साइट्रिक एसिड के साथ अम्लीकृत था। चूंकि पायोचेलिन एक अत्यधिक अस्थिर यौगिक है, निष्कर्षण प्रक्रिया बर्फ पर की गई थी। पायोचेलिन का पता लगाने 300 से 600 एनएम की एक सीमा से एक यूवी रेंज स्कैन चलाकर किया गया था, जहां आयुध डिपो320 एनएम पर चोटी ने पायोचेलिन(चित्रा 4ए)की उपस्थिति की पुष्टि की। पायोकेलिन परिमाणीकरण आयुध डिपो320 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडिंग लेने के द्वारा किया गया था. ओडी320/ओडी600 को विभाजित करके गणना की गई थी। आइसोलेट्स एमआर 1, टीएल 7, और जे 3 ने पीएओ 1 (चित्रा 4 बी) के संदर्भ की तुलना में पायोचेलिन का काफी अधिक उत्पादन दिखाया।

विभिन्न जीवाणु विकास मीडिया में तुलनात्मक siderophore उत्पादन विभिन्न विकास मीडिया में उत्पादित कुल siderophores की मात्रा की जाँच करने के लिए प्रदर्शन किया गया था. चार अलग-अलग मीडिया का चयन किया गया था, जहां लुरिया शोरबा, किंग्स बी मीडिया और पेप्टोन पानी को 3% 8-हाइड्रॉक्सीक्विनोलिन के साथ निकाला गया था, और अध्ययन के लिए अप्रकाशित लुरिया शोरबा का चयन किया गया था। एक्सट्रैक्टेड लूरिया ब्रोथ, किंग्स बी मीडिया और पेप्टोन वॉटर मीडिया में साइडरोफोर उत्पादन के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जबकि बिना निकाले गए लुरिया शोरबा में साइडरोफोर उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण अंतर देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सीएएस अगर पर साइडरोफोर उत्पादन। 24-एच-उगाए गए संस्कृतियों के सीएएस अगर प्लेटों पर पी. एरुगिनोसा का विकास कैस अगर प्लेटों पर देखा गया और 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। साइडरोफोर उपस्थिति बैक्टीरियल कॉलोनी (PAO1, MR1, TL7, और J3) के आसपास एक नारंगी प्रभामंडल द्वारा इंगित की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कुल साइडरोफोर उत्पादन। पीएओ 1 और तीन नैदानिक आइसोलेट्स (एमआर 1, टीएल 7, और जे 3) के लिए कुल साइडरोफोर उत्पादन का मूल्यांकन किया गया था। सेल-फ्री सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोन (पीएओ 1, एमआर 1, टीएल 7, और जे 3 पेप्टोन वॉटर शोरबा में 24 घंटे के लिए उगाए गए) को 96-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट में जोड़ा गया था, उसके बाद सीएएस डाई के 100 माइक्रोन को इसमें जोड़ा गया था। सांख्यिकीय महत्व के लिए एक तरह से एनोवा परीक्षण किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ तीन जैविक प्रतिकृतियों के बीच ± मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करती हैं। * पी < 0.05 से मेल खाती है; NS P > 0.05 से मेल खाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पाइवरडाइन उत्पादन। P. aeruginosa तनाव PAO1 और नैदानिक आइसोलेट्स (MR1, TL7, और J3) के pyoverdine उत्पादन पेप्टोन पानी मीडिया में वृद्धि के 24 घंटे के बाद मूल्यांकन किया. जीवाणु संस्कृतियों centrifuged थे, और सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला के 100 माइक्रोन एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में जोड़ा गया था. इसके बाद, 50 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) के 100 माइक्रोन को इसमें जोड़ा गया। Pyoverdine का पता लगाना यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा 350 एनएम से 600 एनएम की सीमा के साथ किया गया था। pyoverdine उत्पादन (ए) के 380 एनएम पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण. पाइवरेडाइन उत्पादन (बी) की मात्रा का ठहराव। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतियों के प्रयोगों के माध्य पर मानक त्रुटि का संकेत देती हैं। त्रुटि पट्टियाँ तीन जैविक प्रतिकृतियों के बीच ± एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। पी < 0.0001 से मेल खाती है, ** पी < 0.01 से मेल खाती है, और एनएस एक तरफा एनोवा परीक्षण के आधार पर पी > 0.05 से मेल खाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पायोचेलिन उत्पादन। पीएओ 1 (एक संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाता है) और नैदानिक आइसोलेट्स (एमआर 1, टीएल 7, और जे 3) एथिल एसीटेट और मैग्नीशियम सल्फेट के साथ निष्कर्षण का उपयोग करते हुए। 230 एनएम से 400 एनएम (ए) तक की सीमा के साथ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण। पायोचेलिन (बी) की मात्रा का ठहराव। प्रत्येक पृथक के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोग किए गए थे। त्रुटि पट्टियाँ तीन जैविक प्रतिकृतियों के बीच ± एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। एक तरफा एनोवा परीक्षण के आधार पर पी < 0.001 से मेल खाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: विभिन्न जीवाणु विकास मीडिया में तुलनात्मक साइडरोफोर उत्पादन। चार अलग-अलग विकास मीडिया में कुल साइडरोफोरस उत्पादन जहां किंग्स बी मीडिया, पेप्टोन वॉटर मीडिया और लुरिया शोरबा को 3% 8-हाइड्रॉक्सीक्विनोलिन के साथ निकाला गया था ताकि इसमें से कोई भी ट्रेस आयरन निकाला जा सके, और लुरिया शोरबा (बिना निकाले हुए) का चयन किया गया। 3% 8-hydroxyquinoline द्वारा निष्कर्षण मीडिया के लिए 3% 8-hydroxyquinoline के बराबर मात्रा जोड़कर किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ तीन जैविक प्रतिकृतियों के बीच ± एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। ** पी < 0.001 से मेल खाती है, और एनएस एक तरफा एनोवा परीक्षण के आधार पर पी > 0.5 से मेल खाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया व्यंजनों। कृपया फ़ाइल देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं कुल siderophores और पी के दो अलग siderophores मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है. aeruginosa, अर्थात् pyoverdine और pyochelin, जीवाणु कोशिका मुक्त सतह पर तैरनेवाला से. सीएएस अगर प्लेटों परख में, सीएएस डाई और फे3+ आयन एक जटिल बनाते हैं। जब बैक्टीरिया साइडरोफोरस का उत्पादन करते हैं, तो वे CAS-Fe3+ कॉम्प्लेक्स से Fe3+ आयनों को बुझाते हैं, जिससे बैक्टीरिया के विकास के आसपास रंग बदल जाता है। इस परिवर्तन के परिणामस्वरूप बैक्टीरिया के विकास14,15 के आसपास एक स्पष्ट नारंगी प्रभामंडल होता है। जबकि बैक्टीरिया सीधे सीएएस अगर प्लेटों पर लकीर किया जा सकता है, समग्र परिणाम प्रभावित हो सकता है. बैक्टीरिया कोशिकाओं की एक उच्च संख्या को स्ट्रीक करने से बैक्टीरिया के विकास के चारों ओर एक विस्तृत नारंगी प्रभामंडल बन सकता है, जबकि कम जीवाणु कोशिकाओं का उपयोग करने से एक संकीर्ण स्पष्ट क्षेत्र हो सकता है। इसे संबोधित करने के लिए, हमने आयुध डिपो600 को समायोजित करके बैक्टीरिया कोशिकाओं की एक समान संख्या को लकीर दी। फास्टिडियस बैक्टीरिया 24 घंटे में परिणाम दिखा सकते हैं, जबकि धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया को साइडरोफोर उत्पादन प्रदर्शित करने में 72 घंटे से अधिक समय लग सकता है।

कुल साइडरोफोरस के मात्रात्मक निर्धारण के लिए, शास्त्रीय स्पेक्ट्रोस्कोपी को शुरू में नियोजित किया गया था, जिसके लिए साइडरोफोर डिटेक्शन के लिए सुपरनेटेंट की एक महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है, जिससे यह अव्यावहारिक हो जाता है। कुल siderophores की मात्रा का ठहराव अब एक संशोधित सीएएस परख के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर आयोजित किया जाता है. इस दृष्टिकोण अभिकर्मकों, बैक्टीरियल सतह पर तैरनेवाला, समय, और पारंपरिक स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों16 की तुलना में वृद्धि सटीकता के उपयोग में कमी आई है. अन्य अध्ययनों भी एक समय की बचत और अधिक कुशल विधि17 के रूप में microtiter प्लेटों के उपयोग की सूचना दी है. एक microtiter प्लेट का उपयोग कुल siderophores की मात्रा का ठहराव एक कुशल दृष्टिकोण साबित हुआ है. इस अध्ययन में, आयरन मुक्त मीडिया में उगाए गए 48-h-पुराने जीवाणु संस्कृतियों को परीक्षा के लिए चुना गया था। एक तुलनात्मक अध्ययन भी इस तरह के Luria शोरबा के रूप में विभिन्न विकास मीडिया में siderophore उत्पादन का आकलन करने के लिए आयोजित किया गया था, Luria शोरबा (3% 8-hydroxyquinoline के साथ निकाले गए), किंग्स बी मीडिया (3% 8-hydroxyquinoline के साथ निकाले गए), और Peptone पानी मीडिया (3% 8-hydroxyquinoline के साथ निकाले गए). यह देखा गया कि पेप्टोन वाटर मीडिया ने साइडरोफोर उत्पादन की उच्चतम मात्रा का प्रदर्शन किया, और इस प्रकार, इसे आगे के प्रयोगों के लिए चुना गया। विभिन्न विकास मीडिया में साइडरोफोर उत्पादन का चित्रण करने वाला एक ग्राफ पूरक चित्रा 1 में शामिल है।

Pyoverdine का पता लगाया जा सकता है और spectrofluorimetric रीडिंग का उपयोग मात्रा निर्धारित की जा सकती है, लेकिन केवल pyoverdine प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के लिए जाना जाता है. Fe3+ आयनों के साथ जटिल में Pyoverdine प्रतिदीप्ति18,19 प्रदर्शित नहीं करता है. पाइवरडाइन का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए, 48-एच-पुराने जीवाणु संस्कृतियों को अध्ययन के लिए चुना गया था। पी. एरुगिनोसा प्रारंभिक लौह-भूखे परिस्थितियों में पायोचेलिन का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है और गंभीर लौह-तनाव की स्थिति के संपर्क में आने के बाद पाइवरडाइन उत्पादन में बदल जाता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि pyoverdine इस तरह के एल्यूमीनियम, गैलियम, मैंगनीज, और क्रोमियम के रूप में अन्य धातु धनायन, chelate कर सकते हैं, लेकिन केवल लोहे को सफलतापूर्वक कोशिका झिल्ली19 के लिए ले जाया जाता है.

कुल siderophores और pyoverdine के समान, pyochelin सीधे सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला से मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है और dichloromethane20 का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए. डाइक्लोरोमेथेन सेल-मुक्त सतह पर तैरनेवाला के साथ अमिश्रणीय है और तल पर एक अलग परत बनाता है। इस अध्ययन में, विभिन्न पोषक तत्वों का परीक्षण किया गया था, जिसमें लुरिया शोरबा, पेप्टोन पानी और कैसामिनो एसिड मीडिया शामिल थे, लेकिन किंग्स बी मीडिया से पायोचेलिन की एक महत्वपूर्ण मात्रा प्राप्त की गई थी। जबकि होगी एट अल ने अपने प्रोटोकॉल में सीएए मीडिया का इस्तेमाल किया था, हमने इसे किंग्स बी मीडिया के साथ संशोधित किया, क्योंकि सीएए मीडिया ने बैक्टीरिया के विकास21 का समर्थन नहीं किया था। विधि को आगे 8-हाइड्रॉक्सीक्विनोलिन के साथ पोषक तत्व मीडिया को निकालकर संशोधित किया गया था ताकि मीडिया से किसी भी लोहे के अवशेषों को हटाया जा सके, जिससे लोहे की कमी वाला माध्यम बन सके। इसके अतिरिक्त, इनक्यूबेशन समय पायोचेलिन उत्पादन को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करने के लिए पाया गया था। डुमास एट अल ने प्रदर्शित किया कि पी. एरुगिनोसा गंभीर लौह-सीमित स्थितियों के तहत पाइवरेडाइन उत्पादन के लिए पायोचेलिन से स्विच करता है12. इस अध्ययन में, 24-एच-पुराने जीवाणु संस्कृतियों से पायोकेलिन निष्कर्षण और पता लगाया गया था, क्योंकि 48-एच संस्कृतियों में पायोकेलिन का पता नहीं चला था। सतह पर तैरनेवाला की मात्रा भी pyochelin का पता लगाने को प्रभावित करता है, और इस प्रकार, सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला के 100 एमएल निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया गया था. इसके अलावा, एमआर 1, टीएल 7 और जे 3 आइसोलेट्स में पायोचेलिन उत्पादन काफी अधिक था, संभवतः बैक्टीरिया के उपभेदों के कारण जो शक्तिशाली लौह chelators22 होने के बावजूद पाइवरेडाइन का उत्पादन करने में असमर्थ हैं।

जी एट अल ने प्योचेलिन परिमाणीकरण के लिए एक उपन्यास और संवेदनशील दृष्टिकोण पेश किया, इसे एलसी / हालांकि, यह विधि केवल पी. aeruginosa सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के थूक से अलग करने के लिए लागू होती है। एलसी/एमएस/एमएस, एक महंगा सेटअप होने के नाते, अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए वहनीय नहीं हो सकता है23. विसागियो एट अल ने एक बायोलुमिनसेंट पूरे सेल-आधारित बायोसेंसर विकसित किया, जो तेजी से, संवेदनशील और एकल-चरण पायकेलिन मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। फिर भी, यह विधि कुल साइडरोफोरस और पाइवरडाइन24 के लिए परिमाणीकरण प्रदान नहीं कर सकती है।

साइडरोफोर आयरन अपटेक सिस्टम में मल्टीड्रग-प्रतिरोधी बैक्टीरिया के लिए दवा वितरण में एक रोगाणुरोधी अनुप्रयोग हो सकता है, क्योंकि वे बैक्टीरिया के अस्तित्व और विषाणु में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह दृष्टिकोण मल्टीड्रग-प्रतिरोधी बैक्टीरिया25 से निपटने के लिए एक नया तरीका प्रदान कर सकता है। ड्रग्स है कि जीवाणु कोशिका झिल्ली घुसना नहीं कर सकते एक siderophore से जोड़ा जा सकता है, और जिसके परिणामस्वरूप Fe-siderophore परिसर बैक्टीरिया झिल्ली26 के अंदर ले जाया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक DBT - जैव प्रौद्योगिकी शिक्षण कार्यक्रम, DBT - BUILDER कार्यक्रम और FIST से धन स्वीकार करते हैं। एसएचओडीएच से प्राप्त श्री धन्यवाद फेलोशिप। हिमाचल प्रदेश सीएसआईआर से प्राप्त फेलोशिप को धन्यवाद देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Agar, Type I HIMEDIA GRM666
8-Hydroxyquinoline Loba Chemie 4151
Casamino Acid SRL Chemicals 68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) HIMEDIA RM4867-100G
Chloroform Merck 1070242521
Chrome azurol sulfonate HIMEDIA RM336-10G
Citric acid Merck 100241
Dextrose monohydrate Merck 108342
Dichloromethane Merck 107020
Ferric chloride hexahydrate HIMEDIA GRM6353
Glass Flasks Borosil 5100021
Glass Test-tubes Borosil 9820U05
Hydrochloric acid SDFCL 20125
King's medium B base HIMEDIA M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts HIMEDIA G013-500G
Magnesium Sulphate  Qualigens 10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer Thermo Scientific 51119200
Peptone Type I, Bacteriological HIMEDIA RM667-500G
PIPES free acid MP Biomedicals 190257
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1048731000
Proteose peptone HIMEDIA RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer Shimadzu 2072310058
Sigma Laborzentrifuge Sigma-Aldrich 3-18K
Sodium chloride Qualigens 15915

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Tags

इस महीने में JoVE अंक 205
<em>Pseudomonas aeruginosa</em> से Siderophore उत्पादन के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathod, M., Patel, H., Gajjar, D.… More

Rathod, M., Patel, H., Gajjar, D. Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (205), e65980, doi:10.3791/65980 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter