Summary
Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çok çeşitli virülans faktörleri üretmesiyle bilinir. Böyle bir mekanizma, siderofor üretimi yoluyla demirin temizlenmesidir. P. aeruginosa iki farklı siderofor üretir: daha düşük demir şelatlama afinitesine sahip pyochelin ve daha yüksek demir şelatlama afinitesine sahip pyoverdine. Bu rapor, pyoverdin'in bakteriyel süpernatantlardan doğrudan ölçülebildiğini, piyochelin'in ise nicelemeden önce süpernatantlardan ekstrakte edilmesi gerektiğini göstermektedir.
Siderofor üretimini kalitatif olarak analiz etmek için birincil yöntem, Krom Azurol Sülfonat (CAS) agar plakası testidir. Bu tahlilde, Fe3+-Boya kompleksinden CAS boyasının salınması, maviden turuncuya bir renk değişimine yol açarak siderofor üretimini gösterir. Toplam sideroforların miktar tayini için, bakteriyel süpernatantlar bir mikrotitre plakasında CAS boyası ile eşit oranlarda karıştırıldı, ardından 630 nm'de spektrofotometrik analiz yapıldı. Pyoverdine, 50 mM Tris-HCl ile eşit oranlarda karıştırılarak bakteri süpernatantından doğrudan ölçüldü ve ardından spektrofotometrik analiz yapıldı. 380 nm'de bir zirve, pyoverdine'in varlığını doğruladı. Pyochelin'e gelince, bakteriyel süpernatanttan doğrudan miktar tayini mümkün değildi, bu yüzden önce ekstrakte edilmesi gerekiyordu. Daha sonraki spektrofotometrik analiz, 313 nm'de bir tepe noktası ile piyochelin varlığını ortaya çıkardı.
Introduction
Organizmalar, elektron taşınması ve DNA replikasyonu gibi çeşitli hayati işlevleri yerine getirmek için demire ihtiyaç duyar1. Gram-negatif fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa'nın, konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çeşitli virülans faktörlerine sahip olduğu bilinmektedir, bunlardan biri siderofor oluşumudur2. Demir tüketen koşullar sırasında, P. aeruginosa , çevredeki demiri söndüren siderofor adı verilen özel molekülleri serbest bırakır. Sideroforlar demiri hücre dışı olarak şelatlar ve ortaya çıkan ferrik-siderofor kompleksi aktif olarak hücre3'e geri taşınır.
P. aeruginosa'nın iki siderofor, pyoverdine ve pyochelin ürettiği bilinmektedir. Pyoverdinin daha yüksek bir demir şelatlama afinitesine (1:1) sahip olduğu bilinirken, pyochelin'in daha az demir şelatlama afinitesine (2:1) sahip olduğu bilinmektedir4. Pyochelin ayrıca ikincil bir siderofor olarak da adlandırılır çünkü daha düşük bir demir şelatlama afinitesinesahiptir 5. Sideroforların üretimi ve düzenlenmesi, P. aeruginosa6'daki Çekirdek Algılama (QS) sistemleri tarafından aktif olarak kontrol edilmektedir.
Demir söndürmenin yanı sıra, sideroforlar virülans faktörlerinin düzenlenmesinde de rol oynar ve biyofilm oluşumunda aktif rol oynar7. Sideroforlar, hücre sinyalizasyonuna katılım, oksidatif strese karşı savunma ve mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimlerin kolaylaştırılması dahil olmak üzere ek önemli rollere hizmet eder8. Sideroforlar tipik olarak demiri şelatladıkları spesifik fonksiyonel gruplara göre kategorize edilir. Bu sınıflandırmadaki üç birincil iki dişli ligand, katekolat, hidroksiamat ve α-hidroksikarboksilat3'tür. Pioverdinler, P. aeruginosa ve P. fluorescens5 gibi floresan Pseudomonas türlerinin ayırt edici özellikleridir. 6-12 amino asit içeren bir oligopeptide bağlı karışık bir yeşil floresan kromofordan oluşurlar. Birkaç ribozomal olmayan peptit sentetaz (NRP) sentezlerinde yer alır9. Pioverdin üretimi ve regülasyonunda yer alan dört gen pvdL, pvdI, pvdJ ve pvdD'dir10. Pyoverdine ayrıca memelilerde enfeksiyon ve virülanstan sorumludur11. P. aeruginosa'nın orta derecede demir sınırlayıcı koşullarda pyochelin ürettiği, pyoverdin'in ise şiddetli demir sınırlayıcı ortamlarda üretildiğibelirtilmektedir 12. Pyochelin üretiminde yer alan iki operon pchDCBA ve pchEFGHI13'tür. Piyosiyanin varlığında, piyochelin'in (katekolat) oksidatif hasara ve iltihaplanmaya neden olduğu ve konakçı dokulara zararlı olan hidroksil radikalleri ürettiğibelirtilmektedir 11.
Krom Azurol Sülfonat (CAS) testi, hassas olmasına rağmen aşırı spesifik olabilen mikrobiyolojik tahlillere kıyasla kapsamlılığı, yüksek hassasiyeti ve daha fazla rahatlığı nedeniyle yaygın olarak benimsenmiştir14. CAS testi, agar yüzeylerinde veya bir çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ferrik iyon yoğun mavi kompleksinden turuncuya geçtiğinde meydana gelen renk değişimine dayanır. CAS kolorimetrik testi, bir Fe-CAS-yüzey aktif madde üçlü kompleksinden demirin tükenmesini ölçer. Metal, organik boya ve yüzey aktif maddeden oluşan bu özel kompleks, mavi bir renge sahiptir ve 630 nm'de bir absorpsiyon zirvesi sergiler.
Bu rapor, bir agar plakası üzerinde siderofor üretiminin tespit edilebildiği siderofor üretiminin kalitatif tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Bir mikrotitre plakasında toplam siderofor üretiminin kantitatif tahmini ve P. aeruginosa'dan iki sideroforun, pyoverdine ve pyochelin'in tespiti ve kantitatif analizi için bir yöntem de sağlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
P. aeruginosa'nın tüm bakteri izolatları, Hindistan'ın Vadodara ve Jaipur kentindeki tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarından elde edilmiştir. Seçilen tüm klinik izolatlar Biyogüvenlik Kabini'nde (BSL2) ele alındı ve deneyler sırasında bakteri izolatları kullanılırken azami özen gösterildi. Tüm reaktiflerin/çözeltilerin ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Krom Azurol Sülfonat (CAS) boya ve agar ortamının hazırlanması
- Aşağıdaki bileşimle CAS boyasını (100 mL) hazırlayın:
- 60 mg CAS'ı 50 mL damıtılmış suda çözün (Çözelti 1).
- 2.7 mg FeCl3·6H2O'yu 10mL 10 mM HCl (Çözelti 2) içinde çözün.
- 73 mg Setrimonyum bromür (HDTMA) 40 mL damıtılmış suda (Çözelti 3) çözülür.
- Çözüm 1, Çözüm 2 ve Çözüm 3'ü dikkatlice karıştırın. Cam bir şişede saklayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek CAS agarını hazırlayın:
- 750 mL damıtılmış suya 100 mL MM9 tuz çözeltisi ekleyin.
- 32.24 g piperazin-N,N'-bis (2-etansülfonik asit) (PIPES) serbest asidi çözün.
- 15 g Agar agar ekleyin. Otoklavlayın ve soğumaya bırakın.
- Karışıma 30 mL steril Casamino asit çözeltisi ve 10 mL steril% 20 glikoz çözeltisi ekleyin.
- 100 mL CAS boyası ekleyin, karıştırın ve aseptik koşullarda dökün.
NOT: MM9 ortamının, Kasamino asit çözeltisinin ve 8-Hidroksikinolinin hazırlanması Ek Dosya 1'de verilmiştir. PIPES tamponu pH'a duyarlıdır. PH 5.6'ya ulaşılana kadar çözünmez. PH'ın sürekli izlendiğinden emin olun, çünkü BORULAR suda çözünmeye başladığında pH'ı daha da düşürecektir. Kloroformda çözünmüş aynı hacimde% 3 8-hidroksikinolin ile Casamino asidi ekstrakte edin. Karışmayan çözeltiyi yaklaşık 20 °C'de bırakın ve alt fazı bozmadan çözeltinin üst fazını dikkatlice toplayın.
2. Siderofor üretiminin kalitatif analizi
- 24 saat yetiştirilen P. aeruginosa kültürleri için OD600 nm'yi 0.2'ye ayarlayın.
- Steril bir tel halka kullanarak, bakteri kültürünü bir CAS agar plakası üzerinde çizin.
- 30 °C'de 24 saat inkübe edin.
NOT: Bakteri kültürünü seyreltmek için pepton su ortamı veya% 0.8 normal salin kullanılabilir. 24 saatte bakteri üremesi gözlenmezse, CAS plakalarını 48 ila 72 saat inkübe edin.
3. Toplam sideroforların kantitatif tahmini
- OD600 nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini Pepton su ortamında yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- 48 saat sonra, bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'de santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatan ekleyin ve buna 100 μL CAS boyası ekleyin.
- Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, 630 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
- Toplam sideroforların nicelleştirilmesi için elde edilen sonuçları Yüzde Siderofor Birimi (PSU) olarak hesaplayın.
NOT: PSU şu şekilde hesaplanabilir: [(Ar - As)/Ar] x 100
burada, Ar = 630 nm'de referansın emilimi, As = numunenin hücresiz süpernatantının emilimi. Referans için, aşılanmamış pepton su ortamına CAS boyası eklenmelidir. Test tüpleri, mataralar vb. gibi tüm cam eşyaları 2 saat boyunca 6 M HCl ile doldurun ve üzerlerindeki demir kalıntılarını gidermek için damıtılmış suyla iki kez durulayın.
4. Pioverdinin kantitatif tahmini
- OD600 nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini Pepton su ortamında yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
- 48 saat sonra, devam etmeden önce bakteri üremesinin OD600 nm'sini ölçün.
- Bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'da santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatan ekleyin ve buna 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ekleyin.
- OD405 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
5. Piyochelin ekstraksiyonu ve spektrofotometri
- OD600 nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini King's B ortamında (Ek Dosya 1) yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- 24 saat sonra, 100 mL kültür alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'da santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatanıma 5 mL 1 M sitrik asit ekleyin. 50 mL Etil asetat ile iki kez ekstrakte edin.
- Organik fazı bir şırınga filtresinden magnezyum sülfat ile süzün. Filtrelenmiş organik fazı -20 °C'de saklayın.
- 320 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
NOT: Piyochelin, oda sıcaklığında oldukça kararsız bir bileşik olduğundan, ekstraksiyon işlemini buz üzerinde gerçekleştirin. Filtre ayırma için 50 mL steril şırınga kullanın. Şırınganın ucuna pamuk yerleştirin ve üzerine 1 gr magnezyum sülfat ekleyin. Şırınganın ucuna steril bir şırınga filtresi sabitleyin ve süzüntüyü steril bir tüpte toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Klinik izolatlardan sideroforların miktar tayini yapılmadan önce, siderofor üretimini sağlamak için siderofor üretimi için kalitatif bir tarama yapıldı. Klinik izolatlardan sideroforların kalitatif tespiti, CAS agar plakaları üzerinde çizgi oluşturan bakterilerle gözlenmiştir. Çalışma için MR1, TL7, J3 ve PAO1 (referans suş) olmak üzere üç klinik izolat seçildi. Her üç klinik izolat ve PAO1, mavi agar yüzeyindeki bakteri üremesinin etrafındaki berrak turuncu bir halenin pozitif siderofor üretimini gösterdiği siderofor üretimi için pozitif sonuçlar gösterdi (Şekil 1). CAS agarındaki hale oluşumu (Şekil 1), klinik izolatlar tarafından siderofor üretiminin kabaca bir tahminini vermiştir. Bu nedenle, CAS reaktifi ve sıvı ortam kullanılarak siderofor üretiminin kantitatif tahmini yapılmıştır.
Toplam siderofor ölçümü doğrudan hücresiz süpernatanttan gerçekleştirildi. İnkübasyon sonrası, sarı rengin CAS boyasının Fe kompleksinden çıkarıldığını gösterdiği bir renk değişikliği gözlendi. Burada, siderofor hesaplaması için alınan aşılanmamış büyüme ortamına sahip CAS boyası kontrol olarak kullanıldı. MR1 ve TL7 izolatlarında toplam siderofor üretiminde anlamlı bir fark bulunmazken, J3'te PAO1'e göre anlamlı bir toplam siderofor üretimi vardı (Şekil 2).
Daha sonra, doğrudan hücresiz süpernatantlardan pioverdin miktar tayini yapıldı. Pioverdinler hücre ortamlarında salınır, bu nedenle piloverdin miktar tayini için hücresiz süpernatant kullanılmıştır. Spektrofotometre ile bir UV aralığı taraması da yapıldı, burada 380 nm'deki pik piroverdin varlığını doğruladı (Şekil 3A). Spektrofotometrik okumalar 405 nm'de alındı ve sonuçlar OD405 / OD600 nm olarak yorumlandı. MR1 ve J3 izolatları PAO1'e kıyasla önemli ölçüde daha düşük pioverdin gösterirken, TL7 için anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 3B).
Pyochelin, hücresiz süpernatanttan doğrudan ölçülemez. 1 mL hücresiz süpernatandan piyochelin ekstrakte etmek mümkün değildi, bu nedenle 100 mL hücresiz süpernatanttan ekstrakte edildi. 1 M sitrik asit ile asitlendirildi. Pyochelin oldukça kararsız bir bileşik olduğundan, ekstraksiyon işlemi buz üzerinde gerçekleştirildi. Piyochelin tespiti, 300 ila 600 nm aralığında bir UV aralığı taraması çalıştırılarak gerçekleştirildi, burada OD320 nm'deki pik piyochelin varlığını doğruladı (Şekil 4A). Pyochelin miktar tayini, OD320 nm'de spektrofotometrik ölçümler alınarak gerçekleştirildi. Hesaplamalar OD320/OD600'e bölünerek yapılmıştır. MR1, TL7 ve J3 izolatları, referans izolat PAO1'e kıyasla önemli ölçüde daha yüksek piyochelin üretimi gösterdi (Şekil 4B).
Çeşitli büyüme ortamlarında üretilen toplam siderofor miktarını kontrol etmek için çeşitli bakteri üreme ortamlarında karşılaştırmalı siderofor üretimi gerçekleştirildi. Çalışma için Luria suyu, King's B ortamı ve Pepton suyunun %3 8-hidroksikinolin ile ekstrakte edildiği ve ekstrakte edilmemiş Luria suyunun seçildiği dört farklı ortam seçildi. Ekstrakte edilmiş Luria et suyu, King's B ortamı ve Pepton su ortamında siderofor üretimi arasında anlamlı bir fark bulunmazken, ekstrakte edilmemiş Luria suyunda siderofor üretimi için anlamlı bir fark gözlenmiştir.
Şekil 1: CAS agarda siderofor üretimi. 24 saat yetiştirilen kültürlerin CAS agar plakalarında P. aeruginosa'nın büyümesi, CAS agar plakaları üzerinde tespit edildi ve 30 ° C'de 24 saat inkübe edildi. Siderofor varlığı, bakteri kolonisinin etrafında turuncu bir hale ile gösterilir (PAO1, MR1, TL7 ve J3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Toplam siderofor üretimi. Toplam siderofor üretimi PAO1 ve üç klinik izolat (MR1, TL7 ve J3) için değerlendirildi. 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatant (pepton su suyunda 24 saat boyunca yetiştirilen PAO1, MR1, TL7 ve J3) ilave edildi, daha sonra buna 100 μL CAS boyası eklendi. İstatistiksel anlamlılık için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi yapıldı. Hata çubukları± üç biyolojik kopya arasındaki standart sapmayı (SD) temsil eder. * p < 0.05'e karşılık gelir; ns, p > 0.05'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Pyoverdine üretimi. P. aeruginosa suşu PAO1 ve klinik izolatların (MR1, TL7 ve J3) piyoverdin üretimi, pepton su ortamında 24 saatlik büyümeden sonra değerlendirildi. Bakteri kültürleri santrifüj edildi ve 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatant eklendi. Daha sonra buna 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ilave edildi. Pyoverdine tespiti, 350 nm ila 600 nm aralığında UV spektrofotometrisi ile yapıldı. 380 nm pioverdin üretiminde (A) spektrometrik analiz. Pioverdin üretiminin (B) miktarının belirlenmesi. Hata çubukları, üçlü deneylerin ortalaması üzerindeki standart hatayı gösterir. Hata çubukları± üç biyolojik kopya arasındaki SD'yi temsil eder. p < 0.0001'e karşılık gelir, ** p < 0.01'e karşılık gelir ve ns p > 0.05'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Pyochelin üretimi. Etil asetat ve magnezyum sülfat ile ekstraksiyon kullanılarak PAO1 (referans olarak kullanılır) ve klinik izolatların (MR1, TL7 ve J3) piyochelin üretimi. 230 nm ila 400 nm (A) aralığında spektrofotometrik analiz. Piyochelin (B) miktarının belirlenmesi. Her izolat için üç bağımsız deney yapıldı. Hata çubukları± üç biyolojik kopya arasındaki SD'yi temsil eder. Tek yönlü ANOVA testine göre p < 0.001'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Çeşitli bakteri üreme ortamlarında karşılaştırmalı siderofor üretimi. King's B ortamı, Pepton su ortamı ve Luria suyunun, herhangi bir eser demiri çıkarmak için% 3 8-hidroksikinolin ile ekstrakte edildiği ve Luria suyunun (ekstrakte edilmemiş) seçildiği dört farklı büyüme ortamında toplam siderofor üretimi. %3 8-hidroksikinolin ile ekstraksiyon, ortama eşit hacimde %3 8-hidroksikinolin eklenerek gerçekleştirildi. Hata çubukları± üç biyolojik kopya arasındaki SD'yi temsil eder. **Tek yönlü ANOVA testine göre p < 0.001'e karşılık gelir ve ns p > 0.5'e karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu çalışma için kullanılan ortam tarifleri. Dosyayı görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, araştırmacıların toplam sideroforları ve P. aeruginosa'nın iki farklı sideroforunu, yani pyoverdine ve pyochelin'i, bakteriyel hücresiz süpernatanttan ölçmelerini sağlar. CAS agar plakaları tahlilinde, CAS boyası ve Fe3+ iyonları bir kompleks oluşturur. Bakteriler sideroforlar ürettiğinde, CAS-Fe3+ kompleksinden Fe3+ iyonlarını söndürürler ve bakteri büyümesi etrafında bir renk değişikliğine yol açarlar. Bu değişiklik, bakteri üremesi14,15 çevresinde berrak turuncu bir hale ile sonuçlanır. Bakteriler doğrudan CAS agar plakalarına sürülebilirken, genel sonuçlar etkilenebilir. Çok sayıda bakteri hücresinin çizgilenmesi, bakteri büyümesinin etrafında geniş bir turuncu hale oluşturabilirken, daha az bakteri hücresi kullanmak dar bir berrak bölgeye neden olabilir. Bunu ele almak için, OD600'ü ayarlayarak tek tip sayıda bakteri hücresi çizdik. Titiz bakteriler 24 saat içinde sonuç verebilirken, yavaş büyüyen bakterilerin siderofor üretimini göstermesi 72 saatten fazla sürebilir.
Toplam sideroforların kantitatif tayini için, başlangıçta klasik spektroskopi kullanıldı, bu da siderofor tespiti için önemli miktarda süpernatan gerektirdi ve bu da onu pratik hale getirdi. Toplam sideroforların miktar tayini, modifiye edilmiş bir CAS tahlili ile 96 oyuklu bir plaka kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Bu yaklaşım, geleneksel spektroskopik yöntemlere kıyasla reaktiflerin, bakteriyel süpernatanın, zamanın ve artan doğruluğun kullanımında bir azalma ile sonuçlanmıştır16. Diğer çalışmalar da mikrotitre plakalarının zaman kazandıran ve daha verimli bir yöntem olarak kullanıldığını bildirmiştir17. Bir mikrotitre plakası kullanılarak toplam sideroforların miktarının belirlenmesinin etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, incelenmek üzere demirsiz ortamda yetiştirilen 48 saatlik bakteri kültürleri seçilmiştir. Luria Et Suyu, Luria Suyu (%3 8-hidroksikinolin ile ekstrakte edilir), King's B ortamı (%3 8-hidroksikinolin ile ekstrakte edilir) ve Pepton su ortamı (%3 8-hidroksikinolin ile ekstrakte edilir) gibi farklı büyüme ortamlarında siderofor üretimini değerlendirmek için karşılaştırmalı bir çalışma da yapılmıştır. Pepton su ortamının en yüksek miktarda siderofor üretimi sergilediği gözlemlenmiş ve bu nedenle daha ileri deneyler için seçilmiştir. Farklı büyüme ortamlarında siderofor üretimini gösteren bir grafik Ek Şekil 1'de yer almaktadır.
Piyoverdin, spektroflorimetrik okumalar kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir, ancak yalnızca pyoverdin'in floresan sergilediği bilinmektedir. Fe3+ iyonları ile kompleks halinde pyoverdine floresan18,19 göstermez. Pioverdin tespiti ve miktar tayini için çalışma için 48 saatlik bakteri kültürleri seçildi. P. aeruginosa'nın ilk demir açlığı koşulları altında pyochelin ürettiği ve şiddetli demir stresi koşullarına maruz kaldıktan sonra pioverdin üretimine geçtiği bilinmektedir. Pioverdinin alüminyum, galyum, manganez ve krom gibi diğer metalik katyonları şelatlayabildiği, ancak hücre zarına yalnızca demirin başarıyla taşındığıgösterilmiştir 19.
Toplam sideroforlara ve pyoverdine benzer şekilde, pyochelin hücresiz süpernatanttan doğrudan ölçülemez ve diklorometan20 kullanılarak ekstrakte edilmelidir. Diklorometan, hücresiz süpernatan ile karışmaz ve altta ayrı bir tabaka oluşturur. Bu çalışmada, Luria suyu, Pepton suyu ve Casamino asit ortamı dahil olmak üzere çeşitli besin ortamları test edildi, ancak King's B ortamından önemli miktarda piyochelin elde edildi. Hoegy ve ark. protokollerinde CAA ortamını kullanmış olsalar da, CAA ortamı bakteri üremesini desteklemediği için King's B ortamı ile değiştirdik21. Yöntem, ortamdan herhangi bir demir kalıntısını uzaklaştırmak ve demir eksikliği olan bir ortam oluşturmak için besin ortamının 8-hidroksikinolin ile ekstrakte edilmesiyle daha da modifiye edildi. Ek olarak, inkübasyon süresinin pyochelin üretimini önemli ölçüde etkilediği bulunmuştur. Dumas ve ark. P. aeruginosa'nın şiddetli demir sınırlayıcı koşullar altında pyochelin'den pyoverdin üretimine geçtiğini göstermiştir12. Bu çalışmada, 48 saatlik kültürlerde piyochelin saptanmadığı için 24 saatlik bakteri kültürlerinden piyokelin ekstraksiyonu ve tespiti yapılmıştır. Süpernatantın hacmi de pyochelin tespitini etkiler ve bu nedenle ekstraksiyon için 100 mL hücresiz süpernatan kullanılmıştır. Ayrıca, MR1, TL7 ve J3 izolatlarında, muhtemelen güçlü demir şelatörlerine sahip olmasına rağmen pioverdin üretemeyen bakteri suşları nedeniyle piyochelin üretimi önemli ölçüde daha yüksekti22.
Ji ve ark. piyochelin miktar tayini için yeni ve hassas bir yaklaşım getirdi ve bunu LC / MS / MS kullanarak doğruladı. Ancak bu yöntem sadece kistik fibrozis hastalarının balgamından P. aeruginosa izolatlarına uygulanmıştır. Maliyetli bir kurulum olan LC/MS/MS, çoğu laboratuvar için uygun olmayabilir23. Visaggio ve ark. hızlı, hassas ve tek adımlı piyochelin miktar tayinini sağlayan biyolüminesan tam hücre bazlı bir biyosensör geliştirdi. Bununla birlikte, bu yöntem toplam sideroforlar ve pyoverdine24 için miktar tayini sağlayamaz.
Siderofor demir alım sistemleri, bakteriyel sağkalım ve virülansta çok önemli bir rol oynadıkları için çoklu ilaca dirençli bakteriler için ilaç dağıtımında antimikrobiyal bir uygulamaya sahip olabilir. Bu yaklaşım, çoklu ilaca dirençli bakterilerle savaşmak için yeni bir yol sunabilir25. Bakteri hücre zarına nüfuz edemeyen ilaçlar bir siderofora bağlanabilir ve ortaya çıkan Fe-siderofor kompleksi bakteri zarıiçinde taşınabilir 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, DBT - Biyoteknoloji Öğretim Programı, DBT - BUILDER Programı ve FIST'ten fon aldığını kabul eder. MR teşekkür bursu SHODH'dan alındı. HP, CSIR'den alınan burs sayesinde teşekkür etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K.
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J.
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
