Summary
تم وصف إجراء بسيط لتربية أكسينيك ديليا أنتيكا مع الوجبات الغذائية المعقمة نصف المخمرة. تم الكشف عن سلالة Wolbachia واحدة فقط في كل من النجوم من Axenic D. antiqua باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.
Abstract
يتم الحصول على الحشرات المحورية من أنظمة التربية الاصطناعية المعقمة باستخدام وسائط معقمة. هذه الحشرات ، التي تتميز بصغر حجمها ، ودورة نموها القصيرة ، ومتطلبات التغذية المنخفضة ، مثالية لدراسة العلاقة بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيفين. تؤثر ميكروبيوتا الأمعاء بشكل كبير على الخصائص الفسيولوجية لمضيفات الحشرات ، ويوفر إدخال سلالات معينة في الحشرات المحورية طريقة للتحقق من وظائف ميكروبات الأمعاء. Delia antiqua ، وهي آفة مهددة في رتبة Diptera ، وعائلة Anthomyiidae ، وجنس Delia ، تتغذى بشكل أساسي على البصل والثوم والكراث والخضروات الأخرى من عائلة Liliaceae. تتغذى يرقاتها على المصابيح ، مما يتسبب في تعفن وذبول وحتى موت نباتات بأكملها. من خلال تربية اليرقات المحورية ، يمكن إجراء دراسات متابعة لمراقبة آثار البكتيريا المعوية على نمو وتطور D. antiqua. على عكس الطريقة التي تنطوي على القضاء على المضادات الحيوية من الميكروبات المرتبطة بها ، تقدم هذه المقالة نهجا منخفض التكلفة وعالي الكفاءة لرفع axenic D. antiqua. بعد التعقيم السطحي لبيض D. antiqua ، تم استخدام وجبات معقمة نصف مخمرة لتربية اليرقات ، وتم التحقق من الحالة المحورية ل D. antiqua من خلال المقايسات المعتمدة على الثقافة والمستقلة عن الثقافة. في الختام ، فإن الجمع بين تعقيم بيض الحشرات وإعداد الوجبات الغذائية المعقمة لتربية اليرقات قد مكن من تطوير طريقة فعالة وبسيطة للحصول على axenic D. antiqua. توفر هذه الطريقة نهجا قويا لدراسة تفاعلات الحشرات والبكتيريا.
Introduction
المحورية ، التي تعرف بأنها لا يمكن فيها اكتشاف كائنات دقيقة أو طفيليات قابلة للحياة ، هي نماذج تجريبية قيمة لدراسة تفاعلات الكائنات الحية الدقيقة المضيفة 1,2. الحشرات ، أكبر مجموعة من اللافقاريات ، يمكن أن تشكل علاقات تكافلية مع الكائنات الحية الدقيقة3. يمكن استخدام الحشرات المحورية لدراسة تفاعلات المضيف والتعايش في الأنظمة التكافلية4. على سبيل المثال ، أنشأ Nishide et al.5 إجراء عمليا لتربية الدودة ذات الرائحة الكريهة Plautia stali ، مما يتيح تحليلا موثوقا ودقيقا للتفاعلات بين المضيف والمتعايش في الأنظمة التكافلية النموذجية. يمكن إنتاج الحشرات المحورية عن طريق تعقيم مرحلة البيض وتوفير الغذاء المعقم لليرقات والبالغين 6,7. الحشرات المحورية لها أهمية كبيرة وتستخدم على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. على سبيل المثال ، أظهرت دراسة أجراها Somerville et al.8 أن عث الماس الخلفي الملقح ب Enterobacter cloacae يحسن قدرة الذكور المعدلة وراثيا على التكيف.
Delia antiqua Meigen هي آفة مهمة اقتصاديا للبصل ومحاصيل Liliaceae الأخرى في جميع أنحاء العالم ، حيث تلحق يرقاتها الضرر ببصيلات البصل ومحاصيل Liliaceae الأخرى9. توجد D. antiqua بشكل رئيسي في المناخات المعتدلة وتنتشر على نطاق واسع في مناطق زراعة البصل في الأمريكتين وأوروبا وآسيا. إذا لم يتم التحكم فيه بشكل صحيح ، يمكن أن يتسبب في خسائر في المحاصيل في البصل (Allium cepa L.) ، والثوم (Allium sativum L.) ، والكراث (Allium fistulosum L.) ، والكراث (Alliumchoenoprasum L.) تتراوح من 50٪ إلى 100٪ 10,11. تتغذى اليرقات على الأجزاء الموجودة تحت الأرض من النباتات ، وتتسبب هذه التغذية في ذبول الشتلات وموتها في النهاية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للنباتات التالفة أن تسمح لمسببات الأمراض بالدخول ، مما يؤدي إلى تعفن المصباح12. حتى لو لم تستهلك اليرقات النباتات بالكامل ، فإن الضرر الذي تسببه يجعل نباتات البصل غير قابلة للتسويق ويؤدي إلى خسائر اقتصادية.
ترتبط الحشرات ارتباطا وثيقا بميكروبات الأمعاء ، وتحتوي معظم أمعاء الحشرات على مجموعة متنوعة من البكتيريا التكافلية التي تزدهر على العناصر الغذائية التي يوفرها المضيف13,14. أظهر Jing et al.15 أن الوظيفة الأساسية للمجتمع التكافلي المعوي هي توفير العناصر الغذائية الأساسية ، تليها الوظائف المتعلقة بالهضم وإزالة السموم. في بعض الحالات ، يمكن أن تعمل بكتيريا الأمعاء كمورد ميكروبي لأغراض إدارة الآفات. وبالتالي ، فإن دراسة أداء بكتيريا الأمعاء الفردية ووظائفها المحددة داخل جسم D. antiqua أمر مرغوب فيه. لذلك ، فإن تحضير اليرقات المحورية مهم بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين سلالات بكتيرية معينة والحشرات16. حاليا ، هناك طريقة شائعة الاستخدام للقضاء على بكتيريا الأمعاء الحشرية وهي استخدام مزيج مضاد حيوي للقضاء على الميكروبات المرتبطة17،18،19. على عكس استخدام المضادات الحيوية وحدها ، والتي يمكن أن تقلل فقط من أعداد الميكروبات ، فإن التربية المحورية للحشرات تسمح بالتحكم في تكوين وكمية الكائنات الحية الدقيقة ، مما يتيح التحقق بشكل أكثر دقة من وظائف ميكروبات الأمعاء.
وبالتالي ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا لإعداد وتربية axenic D. antiqua. يتم الحصول على غذاء اليرقات Axenic من خلال استخدام التعقيم بدرجة حرارة عالية من الوجبات الغذائية الطبيعية جنبا إلى جنب مع الأطعمة نصف المخمرة. يتم تعقيم البيض باتباع بروتوكول تجريبي للحصول على بيض أكسيني ، وأخيرا ، يتم استزراع يرقات الأكسنيك من بيض المحور. تم تنفيذ نظام التربية المحورية لجيل واحد فقط للتجربة. سيوفر هذا الراحة لدراسة التفاعل بين الحشرات وميكروبات الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم الحصول على D. antiqua من مجال Fanzhen ، تايان.
1. إعداد الوجبات الغذائية المعقمة
- انزع الطبقات الخارجية للبصل الأخضر وتخلص من الأوراق الخضراء. احتفظ بالجزء الأبيض من البصل الأخضر (الشكل 1 أ) واغسله بالماء المعقم ، كرر عملية الشطف ثلاث مرات. قطع الجزء الأبيض من البصل الأخضر إلى قطع مكعبات 1-2 سم باستخدام مقص (انظر جدول المواد) معقمة بمحلول EtOH بنسبة 75٪ (مذكور في الخطوة 2.5) لاستخدامها لاحقا.
- قم بوزن 50 جم من مكعبات البصل الأخضر وضعها في محضر الطعام (انظر جدول المواد). أضف 50 مل من الماء المعقم وطحنها خمس مرات لمدة 2 دقيقة لكل منها. يجب تأريض جميع مكعبات البصل الأخضر في قوام يشبه العجينة (الشكل 2 أ).
- استخدم الملقط لنقل 10 قطع 3يرقات داخلية من D. antiqua إلى أنبوب طرد مركزي سعة 10 مل يحتوي على 10 مل من 1x PBS ، وطحنها بمدقة طحن يمكن التخلص منها (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق تقريبا للحصول على سائل طحن اليرقات.
- صب سائل البصل الأخضر الفطري وسائل طحن اليرقات في دورق مخروطي نظيف سعة 500 مل (انظر جدول المواد). لف فم القارورة المخروطية بطبقتين من فيلم الختم الشفاف ، ثم ضع القارورة في حاضنة اهتزاز (انظر جدول المواد) للتخمير عند 25 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة (الشكل 2 ب).
- اقطع سبع طبقات من الشاش المربع بجوانب 10 سم (لا حاجة للعقم) بالمقص وقم بتكديسها معا لتشكيل جهاز ترشيح بسيط. صب ببطء سائل البصل الأخضر المخمر على الشاش واضغط على السائل المصفى في دورق مخروطي جديد سعة 500 مل. لف بقايا البصل الأخضر المتبقية على الشاش بورق القصدير لاستخدامها لاحقا.
- قم بتصفية المرشح الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة باستخدام مضخة تفريغ (انظر جدول المواد) وقمع Buchner. ضع ورق الترشيح المبلل بالماء منزوع الأيونات على قمع Buchner ، ثم صب المرشح وقم بإجراء ترشيح الشفط لثلاث مرات باستخدام ورق ترشيح مختلف. اجمع الراشح النهائي في دورق مخروطي سعة 500 mL.
- قم بإجراء ترشيح آخر باستخدام زجاجة مرشح 0.22 ميكرومتر ومضخة تفريغ. قم بربط غطاء دورق مرشح الشفط في مقعد فائق النظافة (انظر جدول المواد) لمزيد من الاستخدام. في هذه المرحلة ، يتم الحصول على بقايا البصل الأخضر المخمر والترشيح (الشكل 2C).
ملاحظة: السائل المصفى الذي تم الحصول عليه من هذه الخطوة سيكون معقما. (زجاجة مرشح 0.22 ميكرومتر عبارة عن نظام ترشيح فراغ معقم لتعقيم المرشح). - كرر الخطوات السابقة للحصول على بقايا البصل الأخضر غير المخمرة والترشيح. الفرق هنا هو أن التخمير ليس ضروريا.
- تزن 0.24 غرام كلوريد الكولين و 0.56 غرام حمض الأسكوربيك L (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي 10 مل. أضف 3 مل من الماء منزوع الأيونات ورج بقوة حتى يذوب تماما. في المقعد فائق النظافة ، استخدم حقنة جديدة سعة 5 مل وقم بتوصيل ثلاثة مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لتعقيم المحلول ، ووضعه في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 10 مل لاستخدامه لاحقا.
ملاحظة: كلوريد الكولين هو ناقل عصبي أساسي لنمو الحشرات, في حين أن حمض الأسكوربيك L- يعمل كمادة حافظة. - قم بوزن 2 جم من مسحوق أجار و 6 جم من TSB (انظر جدول المواد) واسكبها في دورق مخروطي سعة 500 مل. ثم أضف 100 مل من الماء منزوع الأيونات لتحضير وسط الاستزراع. بعد شطف القضيب الزجاجي بالماء منزوع الأيونات ، استخدمه لتحريك الخليط حتى يمتزج جيدا. ثم قم بإغلاق القارورة المخروطية باستخدام طبقتين من فيلم الختم الشفاف.
- لف البصل الأخضر المخمر والبصل الأخضر غير المخمر (المذكور في الخطوة 1.5 والخطوة 1.8) بورق الألمنيوم وقم بتعقيمها ، جنبا إلى جنب مع وسط الاستزراع ، في الأوتوكلاف على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- في المقعد فائق النظافة, صب كلوريد الكولين المعقمة, حمض الأسكوربيك, وترشيح معقم في وسط الثقافة مع تحريكها بلطف لخلطها جيدا. أخيرا ، أضف البصل الأخضر المخمر وغير المخمر ورجه بقوة باليد للحصول على الوجبات الغذائية المعقمة. صب الوجبات الغذائية في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل (معقمة ؛ غطاء تنفيس مع غشاء كاره للماء 0.22 ميكرومتر PVDF) (انظر جدول المواد) بزاوية (الشكل 2 د).
ملاحظة: بعد التعقيم ، يجب الحفاظ على درجة حرارة وسط الاستزراع بين 65-80 درجة مئوية لمنع التبريد السريع والتصلب عند إضافة البصل الأخضر أو المكونات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، في كل أنبوب ، صب ما يقرب من 10-15 مل من الوجبات الغذائية. بمجرد أن تصلب الوجبات الغذائية ، قم بتخزين الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية ، إذا لم يتم استخدامها على الفور.
2. اقتناء بيض المحورية
- نظام التربية المختبرية ل D. antiqua
- ضع قفص تربية في حاضنة مضاءة داخليا LED بدرجة حرارة 25 درجة مئوية (24 ساعة في الدورة ، ونسبة الضوء إلى الظلام هي 16: 8) لتربية البالغين من الذكور والإناث ، مما يسمح لهم بالتزاوج ووضع البيض. املأ موزع المياه (الشكل 1 ب) بالماء وأغلقه بصوف قطني مبلل لتوفير الماء للبالغين.
- ضع أربعة قيعان طبق بتري مقاس 35 مم × 12 مم في غطاء طبق بتري مقاس 94 مم × 16 مم. بللي الصوف القطني بالماء المتأين ثم ضعي الصوف القطني الرطب في اثنين من قيعان طبق بتري ، وفوق الصوف القطني ، أضيفي ملعقة كبيرة من السكروز.
- املأ قيعان طبق بتري الآخرين بملعقتين كبيرتين من مستخلص السكروز والخميرة (انظر جدول المواد) ، والتي تعمل كغذاء للحشرات البالغة (الشكل 1 ج).
ملاحظة: لا يحتاج مستخلص السكروز والخميرة المذكور في الخطوة 2.1.2 والخطوة 2.1.3 إلى التعقيم. - ضع قاع طبق بتري 94 مم × 16 مم يحتوي على رمل مبلل وقطعة من فص الثوم المقشر غير المتجذر (الشكل 1 د) داخل قفص الذباب لجمع البيض. سوف تنجذب الأنثى برائحة الثوم وتضع البيض حولها.
- جمع البيض
- أخرج جهاز وضع البيض ، وهو طبق بتري 94 مم × 16 مم يحتوي على الرمل والثوم المذكور أعلاه (الخطوة 2.14) ، من القفص. صب الرمل مع الثوم في دورق سعة 500 مل ، واستخدم ماء الصنبور لطرد البيض المتبقي من الثوم إلى الدورق. عند هذه النقطة ، يطفو البيض في الماء.
- خذ غربالا من 100 شبكة (انظر جدول المواد) ، وقم بترطيبه بماء الصنبور. ثم صب الماء الذي يحتوي على البيض العائم من الدورق على الغربال. سيبقى البيض على الغربال.
- بعد أن يجف البيض بشكل طبيعي على الغربال ، استخدم فرشاة لمسح البيض برفق على طبق بتري.
- في اليوم الأول ، اغسل جهاز وضع البيض لجمع البيض دون تطهير أو تعقيم. في اليوم الثاني في الساعة الرابعة بعد الظهر ، اغسل البيض مرة أخرى واجمعها عن طريق غربلها بالماء النظيف.
ملاحظة: جمع البيض في اليوم الثاني هو لضمان معدل نمو ثابت في المراحل اللاحقة. الساعة الرابعة بعد الظهر هي ذروة وضع البيض ل D. antiqua. وبالتالي ، فهي مثالية لجمع البيض في هذا الوقت. - ضع البيض الذي تم جمعه على غربال خلية معقمة (انظر جدول المواد) في المقعد فائق النظافة (الشكل 3 أ).
- تحضير الحل لتعقيم البيض
- خذ 5 مل من 5.2٪ NaClO (انظر جدول المواد) وانقله إلى دورق مخروطي معقم سعة 250 مل. أضف 95 مل من الماء المعقم لتكوين حجم إجمالي قدره 100 مل ، مما ينتج عنه محلول NaClO بنسبة 0.26٪.
- لتحضير محلول EtOH بنسبة 75٪ ، خذ 75 مل من 99.7٪ EtOH وانقله إلى دورق مخروطي معقم سعة 250 مل. أضف 25 مل من الماء المعقم لتكوين حجم إجمالي قدره 100 مل ، مما ينتج عنه محلول EtOH بنسبة 75٪.
- صب 30 مل من كلوريد الصوديوم في طبق بتري واسكب 30 مل من EtOH في طبق بتري آخر. ضع غربال الخلية الذي يحتوي على البيض المذكور في الخطوة 2.4 في الطبق الذي يحتوي على NaClO. انقعه في محلول كلوريد الصوديوم 0.26٪ لمدة 0.5 دقيقة. ثم انقل الغربال إلى الطبق الذي يحتوي على EtOH ، مما يسمح له بالنقع في محلول EtOH بنسبة 75٪ لمدة 0.5 دقيقة أخرى.
- كرر هذه العملية ثلاث مرات ، بالتناوب بين 0.26٪ NaClO و 75٪ EtOH كل 0.5 دقيقة. بعد ذلك ، سيتم الحصول على بيض axenic. في هذه المرحلة ، يجب غمر الغربال الذي يحتوي على البيض في EtOH.
ملاحظة: لضمان التعقيم الشامل ، استخدم ماصة 1 مل لشفط NaClO و EtOH وتفريق البيض. كرر عملية الشطف عدة مرات. ستعمل هذه الخطوة على تنظيف سطح البيض من البكتيريا والشوائب المتبقية ، مما يضمن سطحا نظيفا ومعقما.
3. تربية اليرقات المحورية
- لنقل البيض المعقم ، استخدم مقصا تم تعقيمه بمصباح كحولي لقطع الطرف النهائي لماصة سعة 1 مل (الشكل 3 ب). تأكد من أن الفتحة النهائية للماصة المقطوعة أكبر من قطر البيض (حوالي 2 مم). بعد ذلك ، استخدم الماصة لنقل البيض من محلول EtOH (البيض مع المحلول) (الشكل 3C) إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على الوجبات الغذائية المعقمة ، ويجب أن يحتوي كل أنبوب على ما يقرب من 20-50 بيضة (الشكل 3 د). كرر هذه العملية حتى يتم نقل كل البيض.
ملاحظة: يجب أن يكون قطر طرف الماصة كبيرا قدر الإمكان لتجنب كسر البيض أثناء النقل ، مما قد يؤدي إلى وفاته. - استخدم ماصة لإزالة أي إيثانول زائد من الأنبوب. ضع أنبوب الطرد المركزي مغلقا بأغطية داخل كيس ذاتي الإغلاق ، وضع قطعة من القطن عند فتحة الكيس للسماح بتدوير الهواء. أخيرا ، ضع الكيس داخل حاضنة 25 درجة مئوية (الرطوبة النسبية: 50٪ -70٪ ؛ الفترة الضوئية: 16 ساعة خفيفة: 8 ساعات داكنة) للمراقبة والزراعة.
- بعد حوالي ثلاثة أيام ، يبدأ بيض الأكسنيك في الوجبات الغذائية في الفقس (الشكل 4 أ). ستكون اليرقات المفرغة نشطة ولن يكون سطح الوجبات الغذائية المعقمة أملسا. ستبدأ اليرقات في التغذية على الوجبات الغذائية.
- استمر في مراقبة اليرقات حتى تصل إلى مرحلة يرقات 2ndinstar . استمر في مراقبة نموها وتطورها خلال هذه الفترة.
- بعد 9-12 يوما ، تطور أكثر من 80٪ من البيض إلى يرقات3 (الشكل 4 ب). هذا يدل على نجاح نمو وتطور اليرقات.
4. التحقق من صحة اليرقات المحورية مع المقايسات المعتمدة على الثقافة
- اختر عشوائيا ثلاثة يرقات محورية3 من أنبوب الطرد المركزي.
- ضع اليرقات في طبق بتري 94 مم × 16 مم يحتوي على 75٪ كحول للتنظيف. بعد ذلك ، قم بنقلها إلى وعاء به ماء معقم لمزيد من الشطف.
- استخدم ملقط تشريح مطهر تم تعقيمه بمحلول EtOH بنسبة 75٪ للإمساك باليرقات (يظهر الرأس والذيل في الشكل 5 أ). استخدم مقص التشريح لإزالة نهايات الرأس والذيل (الشكل 5 ب). امسك ذيل اليرقات بالملقط واستخدم ملقطا آخر للضغط برفق من الذيل إلى الرأس واستخراج الأعضاء الداخلية (النتيجة الموضحة في الشكل 5C). ضع الأعضاء الداخلية في ماء منزوع الأيونات واسحب الأمعاء برفق عن طريق الضغط على الأنسجة الدهنية بالملقط ، وضع الجزء الداخلي المستخرج (الشكل 5 د) في ماء معقم لمزيد من الاستخدام.
- ضع الأمعاء في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعقم 1x PBS ، واستخدم مدقة يمكن التخلص منها لطحن الأنسجة المعوية إلى متجانسة.
- خذ 100 ميكرولتر من التجانس وأضفه إلى وسط أجار المغذيات. استخدم مفرشة على شكل حرف L (انظر جدول المواد) لربط لوحة أجار.
- ضع طبق بتري في حاضنة كيميائية حيوية على حرارة 28 درجة مئوية واحتضانها لمدة 72 ساعة لمراقبة نمو المستعمرات.
5. التحقق من صحة اليرقات المحورية مع المقايسات المستقلة عن الثقافة
- استخرج الحمض النووي الكلي من أنسجة الأمعاء لليرقات المحورية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
- قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات 16S rRNA البكتيرية العالمية (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3' ، 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). حجم التفاعل الكلي هو 25 ميكرولتر ، ويتكون من قالب DNA 1 ميكرولتر ، و 0.5 ميكرولتر أمامي تمهيدي ، و 0.5 ميكرولتر أساس عكسي ، و 10.5 ميكرولتر ddH2O ، و 12.5 ميكرولتر 2x Taq PCR Master Mix (انظر جدول المواد). اضبط شروط تفاعل تفاعل PCR على النحو التالي: تمسخ أولي عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 35 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ؛ تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمزيد من التحليل.
- قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات ITS الفطرية العالمية (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3 '، ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). حجم التفاعل الكلي هو 25 ميكرولتر ، ويتكون من قالب DNA 1 ميكرولتر ، و 0.5 ميكرولتر تمهيدي أمامي ، و 0.5 ميكرولتر أساس عكسي ، و 10.5 ميكرولتر ddH2O ، و 12.5 ميكرولتر 2x Taq PCR Master Mix. اضبط شروط PCR على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ؛ تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمزيد من التحليل.
- استخدم صبغة الحمض النووي Super Green (انظر جدول المواد) للخلط مع كل نوع من نوعي منتجات PCR بالتساوي ، وتحليلها عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز 1٪ في 1x TAE buffer (مخفف من 50x TAE ، انظر جدول المواد). استخدم 3 ميكرولتر من علامة الحمض النووي (انظر جدول المواد) كمرجع.
- استخدم جهاز نقل الأشعة فوق البنفسجية لمراقبة الجل وتحديد موقع الجزء المستهدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تصوير مراحل حياة D. antiqua في الشكل 4. تتكون دورة الحياة الكاملة من البيض واليرقات والخادرة (الشكل 4C) والبالغين (الشكل 4D). يتم زراعتها في أنابيب طرد مركزي معقمة ، ولا يمكن تمييز مظهرها ومعدل بقائها عن D. antiqua التي أثيرت في ظل ظروف غير محورية. يمكن العثور على أوقات النمو والتطور لكل مرحلة من مراحل D. antiqua في الشكل 6. مرحلة البيض من D. antiqua غير المرباة محوريا هي 2.83 ± 0.29 يوما ، ومرحلة D. antiqua التي يتم تربيتها محوريا هي 2.83 ± 0.29 يوما ، مع عدم وجود فرق كبير بين الاثنين ( اختبار t المستقل ، t = 0.00 ، p = 1.00). تستمر مرحلة اليرقات الطبيعية لمدة 13.83 ± 0.76 يوما ، بينما تستمر مرحلة اليرقات المحورية لمدة 14.50 ± 0.50 يوما ، مع عدم وجود فرق كبير بين الاثنين ( اختبار t المستقل ، t = 1.27 ، p = 0.27). مرحلة العذراء من D. antiqua التي يتم تربيتها عادة هي 17.33 ± 0.76 يوما ، ومرحلة D. antiqua التي يتم تربيتها محوريا هي 18.00 ± 0.50 يوما ، مع عدم وجود فرق كبير بين الاثنين ( اختبار t المستقل ، t = 1.27 ، p = 0.27). وقت البقاء على قيد الحياة للبالغين هو 81.50 ± 1.00 يوم للتربية العادية و 80.33 ± 0.76 يوما للتربية المحورية ، مع عدم وجود فرق كبير بين الاثنين ( اختبار t المستقل ، t = 1.61 ، p = 0.18). يمكن ملاحظة أنه لا يوجد فرق كبير في وقت النمو بين axenic D. antiqua وتلك التي أثيرت في ظل الظروف العادية.
أظهرت المقايسات المعتمدة على الثقافة أنه لم يتم اكتشاف أي مستعمرات في أمعاء اليرقات (الشكل 7). علاوة على ذلك ، كشف تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل المستند إلى 16S rRNA البكتيري عن وجود نطاق عند حوالي 1500 bp (الشكل 8A) ، تم تحديده على أنه Wolbachia (رقم انضمام GenBank لتسلسل النوكليوتيدات هذا هو: OR564190) ، وهي بكتيريا تكافلية داخلية. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي نطاقات في تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يستهدف مناطق ITS الفطرية (الشكل 8B). هذا يدل على أن اليرقات قد حققت حالة محورية. تعتبر يرقات Axenic ذات أهمية كبيرة لدراسة آليات التفاعل بين D. antiqua والكائنات الحية الدقيقة ، وكذلك لمنع والسيطرة على الأضرار الناجمة عن D. antiqua.
الشكل 1: أجهزة تربية وغذاء D. antiqua. أ: الجزء الأبيض من البصل الأخضر لليرقات. (ب) مبرد مياه للبالغين. ج: الغذاء للبالغين. د: جهاز تجميع البيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مكونات تحضير الوجبات الغذائية. أ: البصل الأخضر المطحون. ب: البصل الأخضر المخمر. (ج) بقايا البصل الأخضر المخمر والترشيح. د: الوجبات الغذائية الجاهزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عملية نقل البويضات. أ: البيض في غربال الخلية. (ب) 1 مل ماصة بدون طرف طرفي. ج: 1 مل ماصة مع البيض. د: نقل البيض إلى الوجبات الغذائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مراحل حياة الأكسنيك D. antiqua. أ: البيض. ب: اليرقات. ج: الخاداخ. (د) البالغون إناثا وذكورا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عملية تشريح أمعاء اليرقات. أ: رأس اليرقة وذيلها. ب: إزالة اليرقة ورأسها وذيلها. ج: فصل أنسجة الأمعاء والجسم. د: الأمعاء السليمة بعد التسلخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: وقت النمو لكل مرحلة نمو من مراحل D . antiqua التي يتم تربيتها بشكل طبيعي وتربيتها محوريا. لا يوجد فرق كبير في وقت النمو بين D. antiqua التي يتم تربيتها محوريا وتربيتها عادة. اختبار t المستقل ، ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تأكيد عقم D. antiqua عن طريق الاختيار العشوائي لثلاث يرقات واحتضان متجانسات الأمعاء على ألواح أجار TSA و PDA. لم تلاحظ أي بكتيريا في اليرقات التي تتغذى على وجبات معقمة. (أ) يرقات المحاور في TSA. (ب) يرقات طبيعية في TSA. ج: اليرقات المحورية على القناة الشريانية السالكة (PDA). د: اليرقات الطبيعية على القناة الشريانية السالكة (PDA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تأكيد عقم D. antiqua عن طريق تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات 16S rRNA العالمية وبادئات ITS الفطرية. النطاق المستهدف لجين 16S rRNA هو ~ 1,500 bp. لوحظ نطاق يبلغ حوالي 1500 bp وتم تحديده على أنه بكتيريا التكافل الداخلي Wolbachia. النطاق المستهدف لجين ITS هو 500-750 bp. لم يلاحظ أي نطاق مستهدف في مجموعات التركيز البؤري التلقائي. أ: مخطط كهربية 16S rRNA. (ب) مخطط كهربية ITS. الاختصارات: M = علامة. NC = السيطرة السلبية ؛ NF = التغذية الطبيعية ؛ AF = التغذية المحورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمتلك الحشرات ميكروبيوتا الأمعاءالمعقدة للغاية 20،21 ، مما يستلزم استخدام الحشرات المحورية الملقحة بسلالات ميكروبية معوية محددة لدراسة تفاعلات الحشرات والكائنات الحية الدقيقة. يعد تحضير الحشرات المحورية أمرا بالغ الأهمية لمثل هذه المساعي البحثية. العلاج بالمضادات الحيوية هو طريقة تستخدم للقضاء على ميكروبات الأمعاء. على سبيل المثال ، قام Jung و Kim22 بتغذية Spodoptera exigua بالبنسلين ، بينما قام Raymond23 بإطعام P. xylostella بنظام غذائي اصطناعي يحتوي على ريفامبيسين لإزالة بكتيريا الأمعاء. ومع ذلك ، لا يمكن للعلاج بالمضادات الحيوية القضاء تماما على بكتيريا الأمعاء وله العديد من الآثار الجانبية على الحشرات المضيفة. وتشمل هذه التغيرات في نشاط الإنزيم الأيضي ، وضعف وظيفة الأمعاء ، وتثبيط النمو ، والتنمية ، والتكاثر ، فضلا عن زيادة معدلات الوفيات23،24،25. وبالتالي ، قد يتم إخفاء وظيفة ميكروبيوتا أمعاء الحشرات بعد العلاج بالمضادات الحيوية. لحسن الحظ ، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تطهير سطح البيض كيميائيا ، مما يسمح بإنتاج الحشرات المحورية بسهولة نسبية16. نسبيا ، فإن الجمع بين التطهير السطحي للبيض متبوعا بالتغذية بالوجبات الغذائية المعقمة أكثر فعالية وجدوى من العلاج بالمضادات الحيوية 26,27.
يعتمد الحصول على axenic D. antiqua بشكل أساسي على استخدام بيض axenic والوجبات الغذائية المعقمة. بالمقارنة مع أنواع الحشرات الأخرى ، فإن بيض D. antiqua صغير نسبيا. طرق التطهير المستخدمة سابقا ، مثل نقع البيض لفترة وجيزة في 0.1٪ من سلفونات دوديسيل بنزين الصوديوم متبوعة بمعالجة لمدة 5 دقائق بمحلول بيروكسيد الهيدروجين 2٪ للحصول على بيض صرصور محوري28 ، أو استخدام محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق لتطهير بيض سوسة النخيل الحمراء29 ، ليست مناسبة للتطهير D. antiqua بيض. توجد دراسات سابقة حول تطهير بيض أنواع Diptera ، مثل استخدام محاليل بيروكسيد الهيدروجين المستخدمة كمطهر لليدين وبيروكسيد الهيدروجين كمطهر سطحي لتعقيم بيض Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. لذلك ، يصبح من الضروري تحسين اختيار وقت المطهر والتطهير. بعد التجربة ، وجد أن استخدام 0.26٪ NaClO و 75٪ EtOH ، وتطهير البيض لمدة 0.5 دقيقة وتكرار العملية ثلاث مرات يمكن أن يحقق تعقيم بيض D. antiqua .
بعد الحصول على بيض axenic ، هناك جانب آخر مهم لتربية axenic D. antiqua وهو تزويدهم بوجبات معقمة لليرقات في المختبر. على الرغم من أن الأنظمة الغذائية الاصطناعية لا يمكنها تكرار الطعام الطبيعي بشكل كامل ، فقد أثبتت الدراسات31،32،33 جدوى تربية الحشرات باستخدام الأنظمة الغذائية الاصطناعية. يمكن أن يؤثر المحتوى الغذائي للوجبات الغذائية الاصطناعية على جهاز المناعة والقدرة على التكيف مع الحشرات34. لذلك ، من المهم أن تحتوي الوجبات الغذائية المعدة صناعيا على مكونات غذائية مماثلة للأغذية الطبيعية. سيساعد ذلك في ضمان حصول الحشرات التي يتم تربيتها على العناصر الغذائية اللازمة لنموها واستجابتها المناعية وصحتها العامة. في هذه الدراسة ، يعمل البصل الأخضر كمكون أساسي للوجبات الغذائية المعقمة ل D. antiqua. توفر الوجبات الغذائية نصف المخمرة مغذيات أفضل ل D. antiqua ، مما يساهم في نموها وتطورها. بالإضافة إلى ذلك ، يهدف خلط تجانس اليرقات مع الوجبات الغذائية إلى تسهيل الهضم المسبق للوجبات بواسطة ميكروبيوتا الأمعاء خارج الجسم. وذلك لأن البكتيريا المعوية لها تأثير على تغذية الحشرات والهضم35. استخدام هذه الطريقة لإعداد وجبات معقمة ل D. antiqua يبسط العملية ويحسن بشكل كبير من كفاءة إعداد النظام الغذائي.
المتعايشات البكتيرية التي تنتقل عن طريق الأم داخل الخلايا موجودة على نطاق واسع في الحشرات36. Wolbachia ، وهي بكتيريا داخل الخلايا تنتقل عن طريق الأم ، موجودة في العديد من الحشرات37. تشتهر Wolbachia بدورها في التلاعب التناسلي ، حيث يمكن أن تنحاز نسبة الجنس لنسل المضيف نحو إنتاج المزيد من الإناث المصابة38. بعد التحقق من الحالة المحورية ليرقات D. antiqua ، وجد أن اليرقات كانت محورية بشكل أساسي بعد التطهير ، باستثناء البكتيريا التكافلية الداخلية Wolbachia ، الموجودة في سيتوبلازم خلايا أنسجة المبيض في D. antiqua وتنتقل عموديا عبر الأجيال من خلال سيتوبلازم خلايا البويضات. أما بالنسبة لطريقة القضاء على Wolbachia ، فإن العلاج بالمضادات الحيوية هو نهج شائع. باختصار ، تقدم هذه المقالة طريقة لتربية axenic D. antiqua. وفقا للبروتوكول ، يمكن تربية axenic D. antiqua بنجاح. علاوة على ذلك ، تتميز هذه الطريقة ببساطتها وتكلفتها المنخفضة ، مما يوفر نهجا جديدا لتربية الحشرات المحورية الأخرى ويزيد من جدوى دراسة التفاعلات بين الحشرات وميكروبات الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32272530) ، ومشروع السياسات العشرين الجديدة للجامعة في جينان (2021GXRC040) ، ومشاريع الابتكار العلمي والتكنولوجي الرئيسية في مقاطعة شاندونغ (2021TZXD002) ، ومشروع تكامل العلوم والتعليم بجامعة تشيلو للتكنولوجيا (2022PYI009 ، 2022PY016 ، 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
