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Biology

आधा किण्वित बाँझ आहार के साथ Axenic Delia antiqua का पालन

Published: December 22, 2023 doi: 10.3791/66259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), 2Agriculture and Rural Bureau of Changqing District

Summary

आधा किण्वित बाँझ आहार के साथ कुल्हाड़ी डेलिया एंटीका को पालने की एक सरल प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। पीसीआर का उपयोग करके एक्सनिक डी एंटीका के प्रत्येक इंस्टार में केवल एक वोल्बाचिया स्ट्रेन का पता चला था।

Abstract

अक्षीय कीड़े बाँझ मीडिया का उपयोग करके बाँझ कृत्रिम पालन प्रणालियों से प्राप्त किए जाते हैं। ये कीड़े, उनके छोटे आकार, लघु विकास चक्र और कम फ़ीड आवश्यकताओं की विशेषता है, सूक्ष्मजीवों और मेजबानों के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए आदर्श हैं। आंत माइक्रोबायोटा कीट मेजबानों की शारीरिक विशेषताओं को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है, और कुल्हाड़ी कीड़ों में विशिष्ट उपभेदों को पेश करना आंत माइक्रोबियल कार्यों को सत्यापित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। डेलिया एंटीक्वा, डिप्टेरा, परिवार एंथोमाइडे और जीनस डेलिया के क्रम में एक खतरनाक कीट, मुख्य रूप से प्याज, लहसुन, लीक और परिवार लिलियासी की अन्य सब्जियों पर फ़ीड करता है। इसके लार्वा बल्बों पर फ़ीड करते हैं, जिससे पूरे पौधे सड़ जाते हैं, मुरझा जाते हैं और यहां तक कि मर भी जाते हैं। कुल्हाड़ी लार्वा का पालन करके, विकास और विकास पर आंतों के माइक्रोफ्लोरा के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए अनुवर्ती अध्ययन आयोजित किए जा सकते हैं डी। संबंधित रोगाणुओं के एंटीबायोटिक उन्मूलन से जुड़ी विधि के विपरीत, यह लेख अक्षीय डी को बढ़ाने के लिए कम लागत और उच्च दक्षता वाला दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। डी. एंटीक्वा अंडे की सतह नसबंदी के बाद, लार्वा को बढ़ाने के लिए आधा किण्वित बाँझ आहार का उपयोग किया गया था, और डी. एंटीका की कुल्हाड़ी की स्थिति को संस्कृति-निर्भर और संस्कृति-स्वतंत्र परख के माध्यम से सत्यापित किया गया था। अंत में, कीट अंडे की नसबंदी और लार्वा संस्कृति के लिए बाँझ आहार की तैयारी के संयोजन ने अक्षीय डी प्राप्त करने के लिए एक कुशल और सरल विधि के विकास को सक्षम किया है। यह विधि कीट-माइक्रोफ्लोरा इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करती है।

Introduction

कुल्हाड़ी जानवरों, जानवरों में कोई व्यवहार्य सूक्ष्मजीव या परजीवी का पता लगाया जा सकता है के रूप में परिभाषित, मेजबान सूक्ष्मजीव बातचीत 1,2 का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल हैं. कीड़े, अकशेरुकी जीवों का सबसे बड़ा समूह, सूक्ष्मजीवों के साथ सहजीवी संबंध बना सकते हैं3. एक्सनिक कीड़ों का उपयोग सहजीवी प्रणालियों में मेजबान-सहजीवन बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकताहै 4. उदाहरण के लिए, Nishide et al.5 ने मैलोडोर वर्म Plautia stali के लिए एक व्यावहारिक बाँझ पालन प्रक्रिया की स्थापना की, जिससे मॉडल सहजीवी प्रणालियों में मेजबान-सहजीवी इंटरैक्शन का विश्वसनीय और कठोर विश्लेषण सक्षम हो गया। कुल्हाड़ी कीड़े अंडे चरण निष्फल और लार्वा और वयस्कों 6,7 के लिए बाँझ भोजन प्रदान करके उत्पादन किया जा सकता है. एक्सनिक कीड़े बहुत महत्व के हैं और जैविक अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, सोमरविले एट अल 8 द्वारा किए गए एक अध्ययन से पता चला है कि एंटरोबैक्टर क्लोएक के साथ टीका लगाए गए डायमंडबैक पतंगों ने ट्रांसजेनिक पुरुषों की अनुकूलन क्षमता में सुधार किया है।

डेलिया एंटीक्वा मीगेन दुनिया भर में प्याज और अन्य लिलियासी फसलों का एक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट है, इसके लार्वा प्याज और अन्य लिलियासीफसलों के बल्बों को नुकसान पहुंचाते हैं। डी. एंटीका मुख्य रूप से समशीतोष्ण जलवायु में पाया जाता है और अमेरिका, यूरोप और एशिया के प्याज की खेती वाले क्षेत्रों में व्यापक है। यदि ठीक से नियंत्रित नहीं किया जाता है, तो यह प्याज (एलियम सेपा एल), लहसुन (एलियम सैटिवम एल), shallots (एलियम फिस्टुलोसम एल), और लीक (एलियमकोएनोप्रासम एल) में 50% से 100% 10,11 तक फसल के नुकसान का कारण बन सकता है। लार्वा पौधों के नीचे जमीन के नीचे के हिस्सों पर फ़ीड करते हैं, और इस भोजन के कारण रोपाई मुरझा जाती है और अंततः मर जाती है। इसके अलावा, क्षतिग्रस्त पौधों रोगजनकों में प्रवेश करने के लिए अनुमति दे सकते हैं, बल्ब सड़ने के लिए अग्रणी12. यहां तक कि अगर पौधों को लार्वा द्वारा पूरी तरह से भस्म नहीं किया जाता है, तो वे जो नुकसान पहुंचाते हैं, वह प्याज के पौधों को अप्राप्य बना देता है और इसके परिणामस्वरूप आर्थिक नुकसान होता है।

कीड़े बारीकी से आंत माइक्रोबायोटा के साथ जुड़े हुए हैं, और सबसे कीट हिम्मत सहजीवी बैक्टीरिया है कि मेजबान13,14 द्वारा प्रदान की पोषक तत्वों पर पनपने की एक किस्म होते हैं. जिंग एट अल 15 ने दिखाया कि आंतों के सहजीवी समुदाय का प्राथमिक कार्य आवश्यक पोषक तत्व प्रदान करना है, इसके बाद पाचन और विषहरण से संबंधित कार्य होते हैं। कुछ मामलों में, आंत बैक्टीरिया कीट प्रबंधन उद्देश्यों के लिए एक माइक्रोबियल संसाधन के रूप में काम कर सकते हैं। नतीजतन, व्यक्तिगत आंत बैक्टीरिया के प्रदर्शन और शरीर के भीतर विशिष्ट कार्यों का अध्ययन डी. एंटीका वांछनीय है। इसलिए, कुल्हाड़ी लार्वा की तैयारी विशिष्ट जीवाणु उपभेदों औरकीड़े 16 के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. वर्तमान में, कीट आंत बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए एक आम तौर पर इस्तेमाल विधि संबद्ध रोगाणुओं 17,18,19 उन्मूलन के लिए एक एंटीबायोटिक संयोजन का उपयोग है. अकेले एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने के विपरीत, जो केवल माइक्रोबियल संख्या को कम कर सकता है, कीड़ों का अक्षीय पालन सूक्ष्मजीवों की संरचना और मात्रा पर नियंत्रण की अनुमति देता है, जिससे आंत माइक्रोबायोटा कार्यक्षमता का अधिक सटीक सत्यापन सक्षम होता है।

इस प्रकार, यह लेख अक्षीय डी. एंटीका की तैयारी और पालन के लिए एक प्रोटोकॉल का परिचय देता है। एक्सेनिक लार्वा भोजन आधे-किण्वित खाद्य पदार्थों के साथ संयुक्त प्राकृतिक आहार के उच्च तापमान नसबंदी का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। अंडों को अक्षीय अंडे प्राप्त करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का पालन करते हुए निष्फल किया जाता है, और अंत में, अक्षीय लार्वा को अक्षीय अंडे से सुसंस्कृत किया जाता है। प्रयोग के लिए केवल एक पीढ़ी के लिए कुल्हाड़ी पालन प्रणाली की गई थी। यह कीड़े और आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए सुविधा प्रदान करेगा।

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Protocol

डी. एंटीक्वा फैन्ज़ेन, ताइयान के क्षेत्र से प्राप्त किए जाते हैं।

1. बाँझ आहार की तैयारी

  1. स्कैलियन की बाहरी परतों को छीलें और हरी पत्तियों को त्याग दें। स्कैलियन (चित्रा 1 ए) के सफेद हिस्से को रखें और उन्हें बाँझ पानी से धो लें, तीन बार रिंसिंग प्रक्रिया को दोहराएं। बाद में उपयोग के लिए 75% EtOH समाधान (चरण 2.5 में उल्लिखित) के साथ निष्फल कैंची ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके स्कैलियन के सफेद हिस्से को 1-2 सेमी diced टुकड़ों में काटें।
  2. 50 ग्राम कटे हुए स्कैलियन का वजन करें और उन्हें एक खाद्य प्रोसेसर में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)। निष्फल पानी के 50 एमएल जोड़ें और उन्हें 2 मिनट प्रत्येक के लिए पांच बार में पीस. सभी कटा हुआ स्कैलियन एक पेस्ट की तरह स्थिरता (चित्रा 2 ए) में आधारित होना चाहिए।
  3. 1x पीबीएस के 10 एमएल युक्त 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में डी. एंटीक्वा के 10 टुकड़े 3इंस्टार लार्वा स्थानांतरित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें, और लार्वा पीसने वाले तरल प्राप्त करने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए उन्हें डिस्पोजेबल पीस मूसल (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पीस लें।
  4. पेस्टी स्कैलियन तरल और लार्वा पीसने वाले तरल को एक साफ 500 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में डालें ( सामग्री की तालिकादेखें)। पारदर्शी सील फिल्म की दो परतों के साथ शंक्वाकार फ्लास्क मुंह लपेटें, और फिर फ्लास्क को 25 डिग्री सेल्सियस पर किण्वन के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर ( सामग्री की तालिकादेखें) और 12 घंटे (चित्रा 2बी) के लिए 180 आरपीएम में रखें।
  5. कैंची के साथ 10 सेमी पक्षों (बाँझपन की कोई ज़रूरत नहीं) के साथ वर्ग धुंध की सात परतों को काटें और एक साधारण फिल्टर डिवाइस बनाने के लिए उन्हें एक साथ ढेर करें। धीरे-धीरे धुंध पर किण्वित स्कैलियन तरल डालना और फ़िल्टर किए गए तरल को एक नए 500 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में निचोड़ें। बाद में उपयोग के लिए टिन पन्नी में धुंध पर शेष स्कैलियन अवशेषों को लपेटें।
  6. एक वैक्यूम पंप ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक Buchner फ़नल का उपयोग करके पिछले चरण में प्राप्त छानना फ़िल्टर करें। बुचनर फ़नल पर विआयनीकृत पानी से गीला फिल्टर पेपर डालें, और फिर छानना डालें और अलग-अलग फिल्टर पेपर के साथ तीन बार सक्शन निस्पंदन करें। 500 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में अंतिम छानना ले लीजिए।
  7. एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर बोतल और एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर एक और निस्पंदन प्रदर्शन. आगे उपयोग के लिए एक अल्ट्रा-क्लीन बेंच ( सामग्री की तालिकादेखें) में सक्शन फिल्टर फ्लास्क के कवर को पेंच करें। इस बिंदु पर, किण्वित स्कैलियन अवशेष और छानना प्राप्त कर रहे हैं(चित्रा 2सी).
    नोट: इस चरण से प्राप्त फ़िल्टर किया गया तरल बाँझ होगा। (0.22 माइक्रोन फिल्टर बोतल छानना स्टरलाइज़ करने के लिए एक बाँझ वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली है)।
  8. बिना किण्वित स्कैलियन अवशेष प्राप्त करने और छानने के लिए पिछले चरणों को दोहराएं। यहां अंतर यह है कि किण्वन की आवश्यकता नहीं है।
  9. 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 0.24 ग्राम कोलीन क्लोराइड और 0.56 ग्राम एल-एस्कॉर्बिक एसिड ( सामग्री की तालिकादेखें) का वजन करें। विआयनीकृत पानी के 3 एमएल जोड़ें और जोर से हिलाएं जब तक कि वे पूरी तरह से भंग न हो जाएं। अल्ट्रा-क्लीन बेंच में, एक नई 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें और समाधान को निष्फल करने के लिए तीन 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) संलग्न करें, और इसे बाद में उपयोग के लिए एक बाँझ 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
    नोट: कोलीन क्लोराइड कीड़ों के विकास के लिए एक आवश्यक न्यूरोट्रांसमीटर है, जबकि एल-एस्कॉर्बिक एसिड एक संरक्षक के रूप में कार्य करता है।
  10. 2 ग्राम अगर पाउडर और 6 ग्राम टीएसबी ( सामग्री की तालिकादेखें) वजन करें और उन्हें 500 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में डालें। फिर संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए विआयनीकृत पानी के 100 एमएल जोड़ें। कांच की छड़ को विआयनीकृत पानी से धोने के बाद, मिश्रण को अच्छी तरह मिश्रित होने तक हिलाने के लिए इसका उपयोग करें। फिर, पारदर्शी सीलिंग फिल्म की दो परतों का उपयोग करके शंक्वाकार फ्लास्क को सील करें।
  11. एल्यूमीनियम पन्नी में किण्वित स्कैलियन और अनकिण्वित स्कैलियन (चरण 1.5 और चरण 1.8 में उल्लिखित) लपेटें और उन्हें संस्कृति माध्यम के साथ, 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव में बाँझ करें।
  12. अल्ट्रा साफ बेंच में, निष्फल choline क्लोराइड, एल एस्कॉर्बिक एसिड, और बाँझ संस्कृति माध्यम में छानना डालना, जबकि धीरे उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए घूमता. अंत में, किण्वित और बिना किण्वित स्कैलियन डालें और बाँझ आहार प्राप्त करने के लिए हाथ से जोर से हिलाएं। आहार को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों (बाँझ; 0.22 माइक्रोन पीवीडीएफ हाइड्रोफोबिक झिल्ली के साथ वेंट कैप) ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक कोण (चित्रा 2 डी) पर डालें।
    नोट: नसबंदी के बाद, संस्कृति माध्यम का तापमान 65-80 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखा जाना चाहिए ताकि स्कैलियन या अन्य अवयवों को जोड़ते समय तेजी से ठंडा और जमने से रोका जा सके। इसके अलावा, प्रत्येक ट्यूब में, लगभग 10-15 एमएल आहार डालें। एक बार आहार जम गया है, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटर में ट्यूबों की दुकान, अगर यह तुरंत इस्तेमाल नहीं किया है.

2. कुल्हाड़ी के अंडे का अधिग्रहण

  1. डी. एंटीका के लिए प्रयोगशाला पालन प्रणाली
    1. एक 25 डिग्री सेल्सियस आंतरिक रूप से एलईडी प्रबुद्ध इनक्यूबेटर (24 घंटे एक चक्र, अंधेरे के लिए प्रकाश का अनुपात 16: 8) में एक पालन पिंजरे को पुरुष और महिला वयस्कों को पीछे करने के लिए, उन्हें संभोग करने और अंडे देने की अनुमति देता है। पानी निकालने की मशीन (चित्रा 1 बी) पानी के साथ भरें और वयस्कों के लिए पानी उपलब्ध कराने के लिए सिक्त कपास ऊन के साथ सील करें।
    2. एक 94 मिमी x 16 मिमी पेट्री डिश ढक्कन में चार 35 मिमी x 12 मिमी पेट्री डिश बॉटम्स रखें। आयनित पानी के साथ गीला कपास ऊन और फिर पेट्री डिश बोतलों में से दो पर नम कपास ऊन रखें, और कपास ऊन के शीर्ष पर, सुक्रोज का एक बड़ा चमचा जोड़ें।
    3. सुक्रोज और खमीर निकालने ( सामग्री की तालिकादेखें) के दो बड़े चम्मच के साथ अन्य दो पेट्री डिश बोतलों को भरें, जो वयस्क कीड़ों (चित्रा 1 सी) के लिए भोजन के रूप में काम करते हैं।
      नोट: चरण 2.1.2 और चरण 2.1.3 में उल्लिखित सुक्रोज और खमीर निकालने को निष्फल करने की आवश्यकता नहीं है।
    4. अंडे इकट्ठा करने के लिए मक्खी पिंजरे के अंदर सिक्त रेत और बिना जड़, खुली लहसुन लौंग (चित्रा 1 डी) का एक टुकड़ा युक्त एक 94 मिमी x 16 मिमी पेट्री डिश तल रखो। मादा लहसुन की गंध से आकर्षित होगी और उसके चारों ओर अंडे देगी।
  2. अंडे का संग्रह
    1. ओविपोजिशन डिवाइस को बाहर निकालें, जो पिंजरे से ऊपर उल्लिखित रेत और लहसुन युक्त 94 मिमी x 16 मिमी पेट्री डिश है (चरण 2.14)। एक 500 एमएल बीकर में लहसुन के साथ एक साथ रेत डालो, और बीकर में लहसुन से शेष अंडे फ्लश करने के लिए नल के पानी का उपयोग करें. इस बिंदु पर, अंडे पानी में तैर रहे हैं।
    2. एक 100-जाल चलनी लें ( सामग्री की तालिकादेखें), और इसे नल के पानी से सिक्त करें। फिर बीकर से तैरते अंडे वाले पानी को छलनी पर डालें। अंडे छलनी पर रहेंगे।
    3. अंडे स्वाभाविक रूप से छलनी पर सूख के बाद, धीरे एक पेट्री डिश पर अंडे झाडू करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें.
  3. पहले दिन, कीटाणुशोधन या नसबंदी के बिना अंडे इकट्ठा करने के लिए ओविपोजिशन डिवाइस को फ्लश करें। दूसरे दिन दोपहर चार बजे अंडों को फिर से फ्लश करके साफ पानी से छानकर इकट्ठा कर लें।
    नोट: दूसरे दिन अंडे एकत्र करना बाद के चरणों में लगातार विकास दर सुनिश्चित करना है। दोपहर में चार बजे डी एंटीका के लिए अंडे देने वाली चोटी है। इस प्रकार, इस समय अंडे इकट्ठा करना आदर्श है।
  4. अल्ट्रा साफ बेंच(चित्रा 3 ए) में एक बाँझ सेल चलनी (सामग्री की तालिकादेखें) पर एकत्रित अंडे रखें.
  5. अंडे की नसबंदी के लिए घोल तैयार करें
    1. 5.2% NaClO के 5 एमएल लें ( सामग्री की तालिकादेखें) और इसे निष्फल 250 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित करें। 100 एमएल की कुल मात्रा बनाने के लिए निष्फल पानी के 95 एमएल जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 0.26% NaClO समाधान होता है।
    2. 75% EtOH समाधान तैयार करने के लिए, 99.7% EtOH के 75 एमएल लें और इसे निष्फल 250 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित करें। 100 एमएल की कुल मात्रा बनाने के लिए निष्फल पानी के 25 एमएल जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 75% ईटीओएच समाधान होता है।
  6. एक पेट्री डिश में 30 एमएल NaClO डालो और एक और पेट्री डिश में 30 एमएल EtOH डालना. NaClO युक्त डिश में चरण 2.4 में उल्लिखित अंडे युक्त सेल चलनी रखें। 0.5 मिनट के लिए 0.26% NaClO समाधान में यह भिगोएँ. फिर चलनी को EtOH युक्त डिश में स्थानांतरित करें, जिससे यह एक और 0.5 मिनट के लिए 75% EtOH समाधान में भिगो सके।
  7. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं, हर 0.5 मिनट में 0.26% NaClO और 75% EtOH के बीच बारी-बारी से। उसके बाद, कुल्हाड़ी के अंडे प्राप्त किए जाएंगे। इस बिंदु पर, अंडे वाली छलनी को EtOH में डुबोया जाना चाहिए।
    नोट: पूरी तरह से नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए, NaClO और EtOH को महाप्राण करने और अंडे फैलाने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। रिंसिंग प्रक्रिया को कई बार दोहराएं। यह कदम अंडों की सतह को अवशिष्ट बैक्टीरिया और अशुद्धियों से और साफ करेगा, जिससे एक साफ और बाँझ सतह सुनिश्चित होगी।

3. अक्षीय लार्वा का पालन

  1. निष्फल अंडे को स्थानांतरित करने के लिए, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें जिसे अल्कोहल लैंप के साथ निष्फल किया गया है ताकि 1 एमएल पिपेट(चित्रा 3बी)के अंत टिप को काट दिया जा सके। सुनिश्चित करें कि कट विंदुक के अंत खोलने अंडे के व्यास (के बारे में 2 मिमी) से बड़ा है. फिर, बाँझ आहार युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए EtOH समाधान (समाधान के साथ एक साथ अंडे) (चित्रा 3C) से अंडे को स्थानांतरित करने के लिए विंदुक का उपयोग करें, और प्रत्येक ट्यूब में लगभग 20-50 अंडे(चित्रा 3डी)होना चाहिए। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी अंडे स्थानांतरित न हो जाएं।
    नोट: विंदुक टिप का व्यास स्थानांतरण के दौरान अंडे को तोड़ने से बचने के लिए जितना संभव हो उतना बड़ा होना चाहिए, जिससे उनकी मृत्यु हो सकती है।
  2. ट्यूब से किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें। एक स्व-सीलिंग बैग के अंदर ढक्कन के साथ बंद अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें, और हवा परिसंचरण की अनुमति देने के लिए बैग के उद्घाटन पर कपास का एक टुकड़ा रखें। अंत में, अवलोकन और खेती के लिए बैग को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (सापेक्ष आर्द्रता: 50% -70%; फोटोपेरियोड: 16 घंटे प्रकाश: 8 घंटे अंधेरे) के अंदर रखें।
  3. लगभग तीन दिन बाद, आहार में कुल्हाड़ी के अंडे सेने लगते हैं (चित्र 4A)। रची हुई लार्वा सक्रिय होगी और बाँझ आहार की सतह अब चिकनी नहीं होगी। लार्वा आहार पर खिलाना शुरू कर देगा।
  4. लार्वा का निरीक्षण करना जारी रखें जब तक कि वे 2वें इंस्टार लार्वा के चरण तक नहीं पहुंच जाते। इस अवधि के दौरान उनकी वृद्धि और विकास की निगरानी करते रहें।
  5. 9-12 दिनों के बाद, 80% से अधिक अंडे 3इंस्टार लार्वा(चित्रा 4बी)में विकसित हो गए हैं। यह लार्वा की सफल वृद्धि और विकास को इंगित करता है।

4. संस्कृति-निर्भर परख के साथ अक्षीय लार्वा का सत्यापन

  1. बेतरतीब ढंग से अपकेंद्रित्र ट्यूब से तीन अक्षीय 3वें इंस्टार लार्वा का चयन करें।
  2. सफाई के लिए 75% अल्कोहल युक्त एक 94 मिमी x 16 मिमी पेट्री डिश में लार्वा रखें. उसके बाद, उन्हें आगे धोने के लिए बाँझ पानी के साथ एक कंटेनर में स्थानांतरित करें।
  3. लार्वा (सिर और पूंछ चित्रा 5 ए में दिखाए गए हैं) को समझने के लिए 75% ईटीओएच समाधान के साथ निष्फल किया गया है कि एक कीटाणुरहित विदारक संदंश का उपयोग करें। सिर और पूंछ समाप्त होता है (चित्रा 5 बी) को हटाने के लिए विदारक कैंची का प्रयोग करें. संदंश के साथ लार्वा की पूंछ पकड़ो और धीरे सिर के लिए पूंछ से निचोड़ और आंतरिक अंगों ( चित्रा 5 सी में दिखाया गया परिणाम) निकालने के लिए एक और संदंश का उपयोग करें. विआयनीकृत पानी में आंतरिक अंगों प्लेस और धीरे संदंश के साथ वसा ऊतक पर दबाने से आंत बंद खींच, और आगे उपयोग के लिए बाँझ पानी में निकाले गए आंतरिक (चित्रा 5 डी) जगह है.
  4. आंत को एक बाँझ 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें, निष्फल 1x पीबीएस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें, और आंतों के ऊतकों को एक समरूप में पीसने के लिए एक डिस्पोजेबल मूसल का उपयोग करें।
  5. समरूप के 100 माइक्रोन लें और इसे पोषक तत्व अगर माध्यम में जोड़ें। अगर प्लेट को स्ट्रीक करने के लिए एल-आकार का स्प्रेडर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
  6. पेट्री डिश को 28 डिग्री सेल्सियस पर जैव रासायनिक इनक्यूबेटर में रखें और कालोनियों के विकास का निरीक्षण करने के लिए 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

5. संस्कृति-स्वतंत्र परख के साथ अक्षीय लार्वा का सत्यापन

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए डीएनए निष्कर्षण किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके कुल्हाड़ी के लार्वा के आंत ऊतक से कुल डीएनए निकालें।
  2. एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर डीएनए एकाग्रता को मापें।
  3. यूनिवर्सल बैक्टीरियल 16S rRNA प्राइमरों (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3') का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया करें। कुल प्रतिक्रिया मात्रा 25 माइक्रोन है, और इसमें 1 माइक्रोन डीएनए टेम्पलेट, 0.5 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर, 0.5 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर, 10.5 माइक्रोन डीडीएच2ओ, और 12.5 माइक्रोन 2x टाक पीसीआर मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) शामिल हैं। पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थिति निम्नानुसार सेट करें: 3 मिन के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 35 चक्र, 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 90 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार। आगे के विश्लेषण के लिए पीसीआर उत्पादों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. सार्वभौमिक कवक आईटीएस प्राइमरों (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCCCTTATTGATATGC -3') का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया करें। कुल प्रतिक्रिया मात्रा 25 माइक्रोन है, और इसमें 1 माइक्रोन डीएनए टेम्पलेट, 0.5 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर, 0.5 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर, 10.5 माइक्रोन डीडीएच2ओ और 12.5 माइक्रोन 2x टाक पीसीआर मास्टर मिक्स शामिल हैं। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर शर्तों सेट; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 1 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 90 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद। आगे के विश्लेषण के लिए पीसीआर उत्पादों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. समान रूप से पीसीआर उत्पादों के दो प्रकार के साथ मिश्रण करने के लिए सुपर ग्रीन न्यूक्लिक एसिड डाई ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, और 1x टीएई बफर में 1% agarose जेल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा उनका विश्लेषण करें (50x टीएई से पतला, सामग्री की तालिका देखें)। संदर्भ के रूप में डीएनए मार्कर के 3 माइक्रोन ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
  6. जेल का निरीक्षण करने और लक्ष्य टुकड़े का पता लगाने के लिए एक यूवी ट्रांसल्यूमिनेटर का उपयोग करें।

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Representative Results

डी. एंटीका के जीवन चरणों को चित्रा 4 में दर्शाया गया है। पूर्ण जीवन चक्र में अंडे, लार्वा, प्यूपा(चित्रा 4सी)और वयस्क (चित्रा 4डी)शामिल हैं। वे बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों में खेती की जाती है, और उनकी उपस्थिति और जीवित रहने की दर गैर-अक्षीय परिस्थितियों में उठाए गए डी. एंटीक्वा से अप्रभेद्य है। डी. एंटीका के प्रत्येक चरण के लिए वृद्धि और विकास के समय चित्रा 6 में पाया जा सकता है. गैर-अक्षीय रूप से पाले गए डी. एंटीक्वा का अंडा चरण 2.83 ± 0.29 दिन है, और अक्षीय रूप से पाला गया डी. एंटीक्वा 2.83 ± 0.29 दिन है, जिसमें दोनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है (स्वतंत्र टी-परीक्षण, टी = 0.00, पी = 1.00)। सामान्य लार्वा चरण 13.83 ± 0.76 दिनों तक रहता है, जबकि अक्षीय लार्वा चरण 14.50 ± 0.50 दिनों तक रहता है, जिसमें दोनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं होता है (स्वतंत्र टी-परीक्षण, टी = 1.27, पी = 0.27)। सामान्य रूप से पाले गए डी. एंटीका का प्यूपा चरण 17.33 ± 0.76 दिन है, और अक्षीय रूप से पाला गया डी. एंटीक्वा 18.00 ± 0.50 दिन है, जिसमें दोनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है (स्वतंत्र टी-परीक्षण, टी = 1.27, पी = 0.27)। सामान्य पालन के लिए वयस्कों का जीवित रहने का समय 81.50 ± 1.00 दिन और कुल्हाड़ी पालन के लिए 80.33 ± 0.76 दिन है, दोनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है (स्वतंत्र टी-परीक्षण, टी = 1.61, पी = 0.18)। यह देखा जा सकता है कि अक्षीय डी. एंटीका और सामान्य परिस्थितियों में उठाए गए लोगों के बीच विकास के समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है।

संस्कृति-निर्भर परखों से पता चला है कि लार्वा आंतों (चित्रा 7) में कोई उपनिवेश नहीं पाया गया था। इसके अलावा, बैक्टीरियल 16S rRNA पर आधारित पीसीआर विश्लेषण ने लगभग 1500 बीपी(चित्रा 8A)पर एक बैंड की उपस्थिति का खुलासा किया, जिसे वोल्बाचिया (इस न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के लिए जेनबैंक परिग्रहण संख्या: OR564190), एक एंडोसिम्बायोटिक जीवाणु के रूप में पहचाना गया। हालांकि, फंगल आईटीएस क्षेत्रों (चित्रा 8 बी) को लक्षित पीसीआर विश्लेषण में कोई बैंड नहीं देखा गया था। यह इंगित करता है कि लार्वा ने अक्षीय अवस्था प्राप्त कर ली है। एक्सनिक लार्वा डी. एंटीक्वा और सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के तंत्र का अध्ययन करने के साथ-साथ डी. एंटीका के कारण होने वाले नुकसान को रोकने और नियंत्रित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं।

Figure 1
चित्रा 1: पालन उपकरण और भोजन के लिए डी। (ए) लार्वा के लिए स्कैलियन का सफेद हिस्सा। (बी) वयस्कों के लिए पानी निकालने की मशीन। (C) वयस्कों के लिए भोजन। (डी) अंडे के लिए संग्रह उपकरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आहार की तैयारी के घटक। (ए) ग्राउंड स्कैलियन। (बी) किण्वित स्कैलियन। (सी) किण्वित स्कैलियन अवशेष और छानना। (डी) तैयार आहार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अंडे हस्तांतरण की प्रक्रिया। (ए) सेल छलनी में अंडे। (बी) अंत टिप के बिना 1 एमएल विंदुक। (सी) अंडे के साथ 1 एमएल पिपेट। (डी) अंडे आहार में स्थानांतरित हो जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक्सनिक डी। (ए) अंडे। (B) लार्वा। (C) प्यूपा। (डी) महिला और पुरुष वयस्क। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लार्वा आंतों विदारक की प्रक्रिया. (ए) लार्वा का सिर और पूंछ। (बी) सिर और पूंछ के साथ लार्वा हटा दिया। (सी) अलग आंतों और शरीर के ऊतकों. (डी) विच्छेदन के बाद एक बरकरार आंत। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सामान्य रूप से पाला और अक्षीय रूप से पाला गया डी. एंटीका के प्रत्येक विकास चरण का विकासात्मक समय। अक्षीय रूप से पाले जाने और सामान्य रूप से पाले जाने वाले डी. एंटीका के बीच विकासात्मक समय में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। स्वतंत्र टी-परीक्षण, पी < 0.05। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: डी. एंटीक्वा की बाँझपन की पुष्टि बेतरतीब ढंग से तीन लार्वा का चयन करके और टीएसए और पीडीए अगर प्लेटों पर आंत समरूप सेते हैं। लार्वा खिलाया बाँझ आहार में कोई बैक्टीरिया नहीं देखा गया। (ए) टीएसए पर एक्सेनिक लार्वा। (बी) टीएसए पर सामान्य लार्वा। (सी) पीडीए पर एक्सेनिक लार्वा। (डी) पीडीए पर सामान्य लार्वा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: सार्वभौमिक 16 एस आरआरएनए प्राइमरों और फंगल आईटीएस प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर विश्लेषण द्वारा डी. एंटीक्वा की बाँझपन की पुष्टि। 16S rRNA जीन का लक्ष्य बैंड ~ 1,500 bp है। लगभग 1500 बीपी के एक बैंड को एंडोसिम्बायोटिक जीवाणु वोल्बाचिया के रूप में देखा और पहचाना गया। आईटीएस जीन का लक्ष्य बैंड 500-750 बीपी है। वायुसेना समूहों में कोई लक्ष्य बैंड नहीं देखा गया था। (ए) 16 एस आरआरएनए इलेक्ट्रोफेरोग्राम। (B) आईटीएस इलेक्ट्रोफेरोग्राम। संक्षिप्ताक्षर: एम = मार्कर; एनसी = नकारात्मक नियंत्रण; NF = सामान्य खिला; AF = अक्षीय खिला। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कीड़ों के पास एक अत्यधिक जटिल आंत माइक्रोबायोटा20,21 होता है, जिससे कीट-सूक्ष्मजीव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट आंत माइक्रोबियल उपभेदों के साथ टीका लगाए गए अक्षीय कीड़ों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इस तरह के शोध प्रयासों के लिए अक्षीय कीड़ों की तैयारी महत्वपूर्ण है। एंटीबायोटिक उपचार एक विधि है जिसका उपयोग आंत माइक्रोबायोटा को खत्म करने के लिए किया जाता है। उदाहरण के लिए, जंग और किम22 ने पेनिसिलिन के साथ स्पोडोप्टेरा एक्सिगुआ खिलाया, जबकि23 वर्षीय रेमंड ने आंत के बैक्टीरिया को साफ करने के लिए रिफैम्पिसिन युक्त कृत्रिम आहार के साथ पी। हालांकि, एंटीबायोटिक उपचार आंत के बैक्टीरिया को पूरी तरह से समाप्त नहीं कर सकता है और मेजबान कीड़ों पर इसके कई दुष्प्रभाव हैं। इनमें चयापचय एंजाइम गतिविधि में परिवर्तन, बिगड़ा हुआ आंत समारोह, विकास, विकास और प्रजनन में निषेध, साथ ही मृत्यु दर 23,24,25 में वृद्धि शामिल है। नतीजतन, एंटीबायोटिक उपचार के बाद कीट आंत माइक्रोबायोटा की कार्यक्षमता को मुखौटा किया जा सकता है। सौभाग्य से, इस मुद्दे को रासायनिक रूप से अंडे की सतह कीटाणुरहित करके दूर किया जा सकता है, जिससे सापेक्ष आसानी से16 के साथ कुल्हाड़ी कीड़े के उत्पादन की अनुमति मिलती है। तुलनात्मक रूप से, बाँझ आहार के साथ खिलाने के बाद अंडे की सतह कीटाणुशोधन का संयोजन एंटीबायोटिक उपचार26,27 की तुलना में अधिक प्रभावी और व्यवहार्य है।

एक्सनिक डी एंटीका प्राप्त करना मुख्य रूप से अक्षीय अंडे और बाँझ आहार का उपयोग करने पर निर्भर करता है। अन्य कीट प्रजातियों की तुलना में, डी. एंटीका के अंडे अपेक्षाकृत छोटे होते हैं। पहले नियोजित कीटाणुशोधन विधियों, जैसे कि 0.1% सोडियम डोडेसिलबेनज़ीन सल्फोनेट में अंडे को संक्षेप में भिगोना, इसके बाद 5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के साथ 5 मिनट का उपचार कुल्हाड़ी तिलचट्टा अंडे28 प्राप्त करने के लिए, या 10 मिनट के लिए 10% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान का उपयोग करके लाल ताड़ के घुन29 के अंडे कीटाणुरहित करने के लिए, डी एंटीका कीटाणुरहित करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं अंडे। डिप्टेरा प्रजातियों के अंडों की कीटाणुशोधन पर पिछले अध्ययन, जैसे कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान का उपयोग हाथ कीटाणुनाशक के रूप में और हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग सतह कीटाणुनाशक के रूप में ल्यूसिलिया सेरिकाटा (डिप्टेरा: कैलिफोरिडे) अंडे30 को निष्फल करने के लिए सतह कीटाणुनाशक के रूप में किया जाता है, मौजूद हैं। इसलिए, कीटाणुनाशक और कीटाणुशोधन समय की पसंद का अनुकूलन आवश्यक हो जाता है। प्रयोग के बाद, यह पाया गया है कि 0.26% NaClO और 75% EtOH का उपयोग, 0.5 मिनट के लिए अंडे कीटाणुरहित और तीन बार प्रक्रिया दोहरा D . antiqua अंडे की नसबंदी प्राप्त कर सकते हैं.

कुल्हाड़ी के अंडे प्राप्त करने के बाद, अक्षीय डी. एंटीक्वा को पालने का एक और महत्वपूर्ण पहलू उन्हें इन विट्रो में लार्वा के लिए बाँझ आहार प्रदान कर रहा है। यद्यपि कृत्रिम आहार प्राकृतिक भोजन को पूरी तरह से दोहरा नहीं सकते हैं, अध्ययन 31,32,33 ने कृत्रिम आहार का उपयोग करके कीटों को पालने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। कृत्रिम आहार की पोषण सामग्री प्रतिरक्षा प्रणाली और कीड़ों की अनुकूलन क्षमता को प्रभावित कर सकती है34. इसलिए, कृत्रिम रूप से तैयार आहार के लिए प्राकृतिक भोजन के समान पोषण घटकों को शामिल करना महत्वपूर्ण है। इससे यह सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी कि पाले गए कीड़ों को उनके विकास, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और समग्र स्वास्थ्य के लिए आवश्यक पोषक तत्व प्राप्त हों। इस अध्ययन में, स्कैलियन डी. एंटीका के लिए बाँझ आहार के प्राथमिक घटक के रूप में कार्य करते हैं। आधा किण्वित आहार डी. एंटीका के लिए बेहतर पोषक तत्व प्रदान करते हैं, जो उनके विकास और विकास में योगदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, आहार के साथ लार्वा समरूप को मिलाकर शरीर के बाहर आंत माइक्रोबायोटा द्वारा आहार के पूर्व-पाचन को सुविधाजनक बनाना है। ऐसा इसलिए है क्योंकि आंतों के बैक्टीरिया का कीट खिलाने और पाचन35 पर प्रभाव पड़ता है। डी एंटीक्वा के लिए बाँझ आहार तैयार करने के लिए इस पद्धति का उपयोग प्रक्रिया को सरल करता है और आहार की तैयारी की दक्षता में काफी सुधार करता है।

कोशिकाओं के भीतर मातृ रूप से प्रेषित जीवाणु सहजीवन व्यापक रूप से कीटों में मौजूद हैं36. वोल्बाचिया, एक इंट्रासेल्युलर जीवाणु जो मातृ रूप से प्रेषित होता है, कई कीड़ों में मौजूद होताहै। वोल्बाचिया आमतौर पर प्रजनन हेरफेर में अपनी भूमिका के लिए जाना जाता है, क्योंकि यह अधिक संक्रमित मादाओं के उत्पादन की दिशा में मेजबान की संतानों के लिंग अनुपात को पूर्वाग्रह करसकता है। डी. एंटीक्वा लार्वा की अक्षीय अवस्था की पुष्टि करने के बाद, यह पाया गया कि लार्वा अनिवार्य रूप से कीटाणुशोधन के बाद अक्षीय थे, एंडोसिम्बायोटिक बैक्टीरिया वोल्बाचिया को छोड़कर, डी. एंटीक्वा में डिम्बग्रंथि ऊतक कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में मौजूद थे और अंडे की कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म के माध्यम से पीढ़ियों में लंबवत रूप से प्रेषित होते थे। वोल्बाचिया को खत्म करने की विधि के लिए, एंटीबायोटिक उपचार एक सामान्य दृष्टिकोण है। संक्षेप में, यह लेख अक्षीय डी। प्रोटोकॉल के अनुसार, अक्षीय डी. एंटीक्वा को सफलतापूर्वक नस्ल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस पद्धति को इसकी सादगी और कम लागत की विशेषता है, जो अन्य अक्षीय कीड़ों के पालन के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करती है और कीड़े और आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत का अध्ययन करने की व्यवहार्यता बढ़ाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32272530), जिनान परियोजना में विश्वविद्यालय के लिए नई बीस नीतियां (2021GXRC040), शेडोंग प्रांत में प्रमुख वैज्ञानिक और तकनीकी नवाचार परियोजनाएं (2021TZXD002), और किलू प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय की विज्ञान और शिक्षा एकीकरण परियोजना (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μM filter bottle Thermo Scientific 450-0045
0.22 μM Syringe Filter Biosharp BS-QT-011
100-mesh sieve Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory No Catalog numbers
1x PBS solution Solarbio P1020
2x Taq PCR Master Mix GENVIEW GR1113-1ML
5.2% NaClO solution Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 80010428
500 mL Conical flask Thermo Scientific 4103-0500
50 mL vented centrifuge tube JET BIOFIL BRT-011-050
50x TAE buffer GENVIEW GT1307
Agar powder Ding Guo DH010-1.1
Biochemical incubator STIK 21040121500010
Cell sieve SAINING 5022200
Choline chloride Sangon Biotech A600299-0100
ddH2O Ding Guo PER018-2
Disposable grinding pestle JET BIOFIL CSP-003-002
DNA extraction kit Sangon Biotech B518221-0050
DNA Marker Sangon Biotech B600335-0250
Ethanol absolute Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10009218
Filter paper NEWSTAR 1087309025
Food processor Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. WBL25B26
Illuminated  incubator Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. A16110768
L-Ascorbic acid Sangon Biotech A610021-0100
L-shaped spreader SAINING 6040000
Nutrient agar medium Hope Bio HB0109
Scissors Bing Yu  BY-103 Purchase on Jingdong
Shock incubator Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. 2020000014
Sucrose GENVIEW CS326-500G
Super Green nucleic acid dye Biosharp BS355A
Super-clean table Heal Force AC130052
TSB Hope Bio HB4114
Vacuum pump Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. 22051031
Yeast extract Thermo Scientific LP0021B

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References

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इस महीने में JoVE अंक 202
आधा किण्वित बाँझ आहार के साथ Axenic <em>Delia antiqua</em> का पालन
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Cao, X., Liang, Q., Li, M., Wu, X., Fan, S., Zhang, X., Zhou, F., Zhao, Z. Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets. J. Vis. Exp. (202), e66259, doi:10.3791/66259 (2023).

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