Summary
Yarı fermente steril diyetlerle axenic Delia antiqua yetiştirmek için basit bir prosedür tarif edilmiştir. PCR kullanılarak her bir aksenik D. antiqua instarında sadece bir Wolbachia suşu tespit edildi.
Abstract
Aksenik böcekler, steril ortam kullanılarak steril yapay yetiştirme sistemlerinden elde edilir. Küçük boyutları, kısa büyüme döngüleri ve düşük yem gereksinimleri ile karakterize edilen bu böcekler, mikroorganizmalar ve konakçılar arasındaki ilişkiyi incelemek için idealdir. Bağırsak mikrobiyotası, böcek konakçılarının fizyolojik özelliklerini önemli ölçüde etkiler ve aksenik böceklere spesifik suşların sokulması, bağırsak mikrobiyal fonksiyonlarını doğrulamak için bir yöntem sağlar. Diptera, Anthomyiidae familyası ve Delia cinsinde tehdit edici bir haşere olan Delia antiqua, öncelikle soğan, sarımsak, pırasa ve Liliaceae familyasının diğer sebzeleriyle beslenir. Larvaları ampullerle beslenerek tüm bitkilerin çürümesine, solmasına ve hatta ölümüne neden olur. Aksenik larvaları yetiştirerek, bağırsak mikroflorasının D. antiqua'nın büyümesi ve gelişmesi üzerindeki etkilerini gözlemlemek için takip çalışmaları yapılabilir. İlişkili mikropların antibiyotik eliminasyonunu içeren yöntemden farklı olarak, bu makale aksenik D. antiqua'nın yükseltilmesi için düşük maliyetli ve yüksek verimli bir yaklaşım sunmaktadır. D. antiqua yumurtalarının yüzey sterilizasyonundan sonra, larvaları yetiştirmek için yarı fermente steril diyetler kullanıldı ve D. antiqua'nın aksenik durumu, kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız deneylerle doğrulandı. Sonuç olarak, böcek yumurtası sterilizasyonu ve larva kültürü için steril diyetlerin hazırlanmasının kombinasyonu, aksenik D. antiqua elde etmek için etkili ve basit bir yöntemin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntem, böcek-mikroflora etkileşimlerini incelemek için güçlü bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Canlı mikroorganizma veya parazitlerin tespit edilemediği hayvanlar olarak tanımlanan aksenik hayvanlar, konakçı-mikroorganizma etkileşimlerini incelemek için değerli deneysel modellerdir 1,2. En büyük omurgasız grubu olan böcekler, mikroorganizmalarla simbiyotik ilişkiler kurabilir3. Aksenik böcekler, simbiyotik sistemlerde konakçı-simbiyont etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir4. Örneğin, Nishide ve ark.5, kötü kokulu solucan Plautia stali için pratik bir steril yetiştirme prosedürü oluşturarak, model simbiyotik sistemlerde konakçı-simbiyont etkileşimlerinin güvenilir ve titiz bir şekilde analiz edilmesini sağlamıştır. Aksenik böcekler, yumurta aşamasını sterilize ederek ve larvalara ve yetişkinlere steril gıda sağlayarak üretilebilir 6,7. Aksenik böcekler büyük önem taşır ve biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır. Örneğin, Somerville ve ark.8 tarafından yapılan bir araştırma, Enterobacter cloacae ile aşılanmış elmas sırtlı güvelerin transgenik erkeklerin adaptasyonunu geliştirdiğini göstermiştir.
Delia antiqua Meigen, dünya çapında soğan ve diğer Liliaceae mahsullerinin ekonomik açıdan önemli bir zararlısıdır ve larvaları soğan ve diğer Liliaceae mahsullerinin soğanlarına zarar verir9. D. antiqua esas olarak ılıman iklimlerde bulunur ve Amerika, Avrupa ve Asya'nın soğan yetiştirme alanlarında yaygındır. Uygun şekilde kontrol edilmezse soğan (Allium cepa L.), sarımsak (Allium sativum L.), arpacık soğanı (Allium fistulosum L.) ve pırasada (Alliumchoenoprasum L.) %50 ile %100 arasında değişen ürün kayıplarına neden olabilir10,11. Larvalar bitkilerin toprak altı kısımlarında beslenir ve bu beslenme fidelerin solmasına ve sonunda ölmesine neden olur. Ek olarak, hasarlı bitkiler patojenlerin girmesine izin vererek ampul çürümesineneden olabilir 12. Bitkiler larvalar tarafından tamamen tüketilmese bile verdikleri zararlar soğan bitkilerini pazarlanamaz hale getirmekte ve ekonomik kayıplara neden olmaktadır.
Böcekler bağırsak mikrobiyotası ile yakından ilişkilidir ve çoğu böcek bağırsağı, konakçı tarafından sağlanan besinlerle gelişen çeşitli simbiyotik bakteriler içerir13,14. Jing ve ark.15, bağırsak simbiyotik topluluğunun birincil işlevinin temel besinleri sağlamak olduğunu, ardından sindirim ve detoksifikasyon ile ilgili işlevlerin geldiğini göstermiştir. Bazı durumlarda, bağırsak bakterileri haşere yönetimi amacıyla mikrobiyal bir kaynak görevi görebilir. Sonuç olarak, bireysel bağırsak bakterilerinin performanslarını ve D. antiqua'nın vücudundaki spesifik işlevlerini incelemek arzu edilir. Bu nedenle, aksenik larvaların hazırlanması, spesifik bakteri suşları ve böcekler arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle önemlidir16. Şu anda, böcek bağırsak bakterilerini ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, ilişkili mikropları yok etmek için bir antibiyotik kombinasyonunun kullanılmasıdır 17,18,19. Sadece mikrobiyal sayıları azaltabilen tek başına antibiyotik kullanmanın aksine, böceklerin aksenik yetiştirilmesi, mikroorganizmaların bileşimi ve miktarı üzerinde kontrol sağlayarak bağırsak mikrobiyota işlevselliğinin daha doğru bir şekilde doğrulanmasını sağlar.
Bu nedenle, bu makale axenic D. antiqua'nın hazırlanması ve yetiştirilmesi için bir protokol sunmaktadır. Aksenik larva yemi, yarı fermente gıdalarla birlikte doğal diyetlerin yüksek sıcaklıkta sterilizasyonu kullanılarak elde edilir. Yumurtalar, aksenik yumurtalar elde etmek için deneysel bir protokol izlenerek sterilize edilir ve son olarak, aksenik larvalar aksenik yumurtalardan kültürlenir. Aksenik yetiştirme sistemi, deney için sadece bir nesil boyunca gerçekleştirildi. Bu, böcekler ve bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimi incelemek için kolaylık sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua , Fanzhen, Taian sahasından elde edilir.
1. Steril diyetlerin hazırlanması
- Yeşil soğanların dış katmanlarını soyun ve yeşil yaprakları atın. Yeşil soğanların beyaz kısmını saklayın (Şekil 1A) ve steril suyla yıkayın, durulama işlemini üç kez tekrarlayın. Yeşil soğanların beyaz kısmını, daha sonra kullanmak üzere %75 EtOH çözeltisi (adım 2.5'te bahsedilmiştir) ile sterilize edilmiş makas ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 1-2 cm'lik doğranmış parçalar halinde kesin.
- 50 gr doğranmış yeşil soğanı tartın ve bir mutfak robotuna koyun (Malzeme Tablosuna bakın). 50 mL sterilize su ekleyin ve her biri 2 dakika boyunca beş kez öğütün. Doğranmış yeşil soğanların tamamı macun kıvamına gelene kadar topraklanmalıdır (Şekil 2A).
- D. antiqua'nın 10 adet 3. instar larvasını 10 mL 1x PBS içeren 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için cımbız kullanın ve bir larva öğütme sıvısı elde etmek için bunları tek kullanımlık bir öğütme tokmağı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile yaklaşık 5 dakika öğütün.
- Macun kıvamındaki yeşil soğan sıvısını ve larva öğütme sıvısını 500 mL'lik temiz bir erlene dökün (Malzeme Tablosuna bakın). Erlen ağzını iki kat şeffaf sızdırmazlık filmi ile sarın ve ardından şişeyi 25 °C'de ve 180 rpm'de 12 saat fermantasyon için çalkalayan bir inkübatöre (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin (Şekil 2B).
- Makasla 10 cm kenarlı (steriliteye gerek yok) yedi kat kare gazlı bez kesin ve basit bir filtre cihazı oluşturmak için bunları bir araya getirin. Fermente yeşil soğan sıvısını yavaşça gazlı bezin üzerine dökün ve filtrelenmiş sıvıyı 500 mL'lik yeni bir erlene sıkın. Kalan yeşil soğan kalıntısını daha sonra kullanmak üzere kalay folyoya gazlı bez üzerine sarın.
- Bir vakum pompası (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir Buchner hunisi kullanarak önceki adımda elde edilen süzüntüyü süzün. Deiyonize su ile ıslatılmış filtre kağıdını Buchner hunisine koyun ve ardından süzüntüyü dökün ve farklı filtre kağıdı ile üç kez emme filtrasyonu gerçekleştirin. Son süzüntüyü 500 mL'lik erlende toplayın.
- 0,22 μM'lik bir filtre şişesi ve bir vakum pompası kullanarak başka bir filtreleme gerçekleştirin. Daha fazla kullanım için emme filtresi şişesinin kapağını ultra temiz bir tezgaha vidalayın (Malzeme Tablosuna bakın). Bu noktada fermente yeşil soğan kalıntısı ve süzüntü elde edilir (Şekil 2C).
NOT: Bu adımdan elde edilen filtrelenmiş sıvı steril olacaktır. (0.22 μM filtre şişesi, filtratı sterilize etmek için steril bir vakumlu filtrasyon sistemidir). - Fermente edilmemiş yeşil soğan kalıntısı elde etmek ve süzmek için önceki adımları tekrarlayın. Buradaki fark, fermantasyona gerek olmamasıdır.
- 10 mL'lik bir santrifüj tüpünde 0.24 g kolin klorür ve 0.56 g L-askorbik asidi ( Malzeme Tablosuna bakınız) tartın. 3 mL deiyonize su ekleyin ve tamamen eriyene kadar kuvvetlice çalkalayın. Ultra temiz tezgahta, yeni bir 5 mL şırınga kullanın ve çözeltiyi sterilize etmek için üç adet 0.22 μM şırınga filtresi takın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve daha sonra kullanmak üzere steril bir 10 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Kolin klorür, böceklerin büyümesi için gerekli bir nörotransmiterdir, L-askorbik asit ise koruyucu görevi görür. - 2 g agar tozu ve 6 g TSB'yi tartın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları 500 mL'lik bir erlene dökün. Daha sonra kültür ortamını hazırlamak için 100 mL deiyonize su ekleyin. Cam çubuğu deiyonize suyla duruladıktan sonra, karışımı iyice karışana kadar karıştırmak için kullanın. Ardından, iki kat şeffaf sızdırmazlık filmi kullanarak erleni kapatın.
- Fermente edilmiş yeşil soğanları ve fermente edilmemiş yeşil soğanları (adım 1.5 ve adım 1.8'de bahsedilmiştir) alüminyum folyoya sarın ve kültür ortamıyla birlikte 121 °C'de 20 dakika boyunca bir otoklavda sterilize edin.
- Ultra temiz tezgahta, sterilize edilmiş kolin klorür, L-askorbik asit ve steril süzüntüyü iyice karıştırmak için hafifçe döndürerek kültür ortamına dökün. Son olarak, fermente edilmiş ve fermente edilmemiş yeşil soğanları ekleyin ve steril diyetleri elde etmek için elle kuvvetlice çalkalayın. Diyetleri 50 mL'lik santrifüj tüplerine (steril; 0.22 μM PVDF hidrofobik membranlı havalandırma kapağı) dökün (Malzeme Tablosuna bakın) bir açıyla (Şekil 2D).
NOT: Sterilizasyondan sonra, yeşil soğan veya diğer bileşenler eklenirken hızlı soğumayı ve katılaşmayı önlemek için kültür ortamının sıcaklığı 65-80 °C arasında tutulmalıdır. Ayrıca, her tüpe yaklaşık 10-15 mL diyet dökün. Diyetler katılaştıktan sonra, hemen kullanılmayacaksa tüpleri buzdolabında 4 °C'de saklayın.
2. Aksenik yumurtaların toplanması
- D. antiqua için laboratuvar yetiştirme sistemi
- 25 °C'lik dahili LED aydınlatmalı bir kuluçka makinesine (24 saat döngü, aydınlığın karanlığa oranı 16:8'dir) bir yetiştirme kafesi yerleştirerek erkek ve dişi yetişkinlerin çiftleşmelerini ve yumurtlamalarını sağlayın. Su sebilini (Şekil 1B) suyla doldurun ve yetişkinlere su sağlamak için nemli pamuk yünü ile kapatın.
- 94 mm x 16 mm'lik bir Petri kabı kapağına dört adet 35 mm x 12 mm Petri kabı tabanı yerleştirin. Pamuk yününü iyonize suyla ıslatın ve ardından Petri kabının iki dibine nemli pamuk yünü yerleştirin ve pamuk yününün üzerine bir çorba kaşığı sakaroz ekleyin.
- Diğer iki Petri kabının tabanını, yetişkin böcekler için besin görevi gören iki yemek kaşığı sakaroz ve maya özü ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Adım 2.1.2 ve adım 2.1.3'te bahsedilen sükroz ve maya ekstraktının sterilize edilmesine gerek yoktur. - Yumurtaları toplamak için sinek kafesinin içine nemli kum ve bir parça köksüz, soyulmuş sarımsak (Şekil 1D) içeren 94 mm x 16 mm'lik bir Petri kabı tabanı koyun. Dişi, sarımsak kokusundan etkilenecek ve etrafına yumurta bırakacaktır.
- Yumurtaların toplanması
- Yukarıda bahsedilen kum ve sarımsak içeren 94 mm x 16 mm petri kabı olan yumurtlama cihazını (adım 2.14) kafesten çıkarın. Kumu sarımsakla birlikte 500 mL'lik bir behere dökün ve kalan yumurtaları sarımsaktan behere akıtmak için musluk suyu kullanın. Bu noktada, yumurtalar suda yüzüyor.
- 100 gözenekli bir elek alın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve musluk suyuyla nemlendirin. Daha sonra beherden yüzen yumurtaları içeren suyu elek üzerine dökün. Yumurtalar elek üzerinde kalacaktır.
- Yumurtalar elek üzerinde doğal olarak kuruduktan sonra, yumurtaları bir Petri kabına nazikçe süpürmek için bir fırça kullanın.
- İlk gün, yumurtaları dezenfeksiyon veya sterilizasyon olmadan toplamak için yumurtlama cihazını yıkayın. İkinci gün öğleden sonra saat dörtte yumurtaları tekrar yıkayın ve temiz suyla eleyerek toplayın.
NOT: Yumurtaların ikinci günde toplanması, sonraki aşamalarda tutarlı bir büyüme hızı sağlamak içindir. Öğleden sonra saat dört, D. antiqua için yumurtlama zirvesidir. Bu nedenle, bu zamanda yumurtaları toplamak idealdir. - Toplanan yumurtaları ultra temiz tezgahta steril bir hücre eleceğine (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin (Şekil 3A).
- Çözeltiyi yumurta sterilizasyonu için hazırlayın
- 5 mL% 5.2 NaClO alın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve sterilize edilmiş 250 mL konik bir şişeye aktarın. Toplam hacmi 100 mL yapmak için 95 mL sterilize su ekleyin, bu da %0.26 NaClO çözeltisi elde edilmesini sağlar.
- % 75 EtOH çözeltisi hazırlamak için,% 99.7 EtOH'nin 75 mL'sini alın ve sterilize edilmiş 250 mL'lik bir erlene aktarın. Toplam hacmi 100 mL yapmak için 25 mL sterilize su ekleyin,% 75 EtOH çözeltisi elde edilir.
- Bir Petri kabına 30 mL NaClO dökün ve başka bir Petri kabına 30 mL EtOH dökün. Adım 2.4'te bahsedilen yumurtaları içeren hücre süzgecini NaClO içeren kabın içine yerleştirin. % 0.26 NaClO çözeltisinde 0.5 dakika bekletin. Daha sonra eleği EtOH içeren kaba aktarın ve% 75 EtOH çözeltisinde 0,5 dakika daha bekletin.
- Bu işlemi her 0,5 dakikada bir% 0.26 NaClO ve% 75 EtOH arasında dönüşümlü olarak üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, aksenik yumurtalar elde edilecektir. Bu noktada, yumurtaları içeren elek EtOH'ye batırılmalıdır.
NOT: Tam sterilizasyon sağlamak için, NaClO ve EtOH'yi aspire etmek ve yumurtaları dağıtmak için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Durulama işlemini birkaç kez tekrarlayın. Bu adım, yumurtaların yüzeyini artık bakteri ve yabancı maddelerden daha fazla temizleyerek temiz ve steril bir yüzey sağlayacaktır.
3. Aksenik larvaların yetiştirilmesi
- Sterilize edilmiş yumurtaları aktarmak için, 1 mL'lik bir pipetin uç ucunu kesmek için alkol lambası ile sterilize edilmiş bir makas kullanın (Şekil 3B). Kesilen pipetin uç açıklığının yumurtaların çapından (yaklaşık 2 mm) daha büyük olduğundan emin olun. Daha sonra, yumurtaları EtOH çözeltisinden (çözelti ile birlikte yumurtalar) (Şekil 3C) steril diyetleri içeren bir santrifüj tüpüne aktarmak için pipeti kullanın ve her tüp yaklaşık 20-50 yumurta içermelidir (Şekil 3D). Tüm yumurtalar transfer edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Aktarım sırasında yumurtaların kırılmasını önlemek için pipet ucunun çapı mümkün olduğunca büyük olmalıdır, bu da ölümlerine yol açabilir. - Tüpteki fazla etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Santrifüj tüpünü kendinden sızdırmaz bir torbanın içine kapaklarla kapalı olarak yerleştirin ve hava sirkülasyonu sağlamak için torbanın ağzına bir parça pamuk yerleştirin. Son olarak, gözlem ve uygulama için torbayı 25 °C'lik bir inkübatörün içine yerleştirin (bağıl nem: %50-%70; fotoperiyot: 16 saat aydınlık: 8 saat karanlık).
- Yaklaşık üç gün sonra, diyetlerdeki aksenik yumurtalar çatlamaya başlar (Şekil 4A). Yumurtadan çıkan larvalar aktif olacak ve steril diyetlerin yüzeyi artık pürüzsüz olmayacaktır. Larvalar diyetlerle beslenmeye başlayacaktır.
- Larvaları 2. instar larvaları aşamasına ulaşana kadar gözlemlemeye devam edin. Bu dönemde büyüme ve gelişmelerini izlemeye devam edin.
- 9-12 gün sonra yumurtaların %80'inden fazlası 3. instar larvaya dönüşmüştür (Şekil 4B). Bu, larvaların başarılı bir şekilde büyümesini ve gelişmesini gösterir.
4. Aksenik larvaların kültüre bağlı tahlillerle doğrulanması
- Santrifüj tüpünden rastgele üç aksenik 3. instar larvası seçin.
- Larvaları temizlik için% 75 alkol içeren 94 mm x 16 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Bundan sonra, daha fazla durulama için steril su içeren bir kaba aktarın.
- Larvaları kavramak için% 75 EtOH çözeltisi ile sterilize edilmiş dezenfekte edilmiş bir diseksiyon forseps kullanın (baş ve kuyruk Şekil 5A'da gösterilmiştir). Baş ve kuyruk uçlarını çıkarmak için diseksiyon makası kullanın (Şekil 5B). Larvaların kuyruğunu forseps ile tutun ve kuyruktan başa hafifçe sıkmak ve iç organları çıkarmak için başka bir forseps kullanın ( Şekil 5C'de gösterilen sonuç). İç organları deiyonize suya yerleştirin ve forseps ile yağ dokusuna bastırarak bağırsağı nazikçe çekin ve çıkarılan iç organı (Şekil 5D) daha fazla kullanım için steril suya koyun.
- Bağırsağı steril bir 1.5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin, 500 μL sterilize edilmiş 1x PBS tamponu ekleyin ve bağırsak dokusunu homojen bir şekilde öğütmek için tek kullanımlık bir havaneli kullanın.
- 100 μL homojenat alın ve besleyici bir agar ortamına ekleyin. Agar plakasını çizmek için L şeklinde bir yayıcı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Petri kabını 28 °C'de biyokimyasal bir inkübatöre yerleştirin ve kolonilerin büyümesini gözlemlemek için 72 saat inkübe edin.
5. Aksenik larvaların kültürden bağımsız deneylerle doğrulanması
- Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak aksenik larvaların bağırsak dokusundan toplam DNA'yı çıkarın.
- Bir UV spektrofotometresi kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
- Evrensel bakteriyel 16S rRNA primerleri (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3') kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Toplam reaksiyon hacmi 25 μL'dir ve 1 μL DNA şablonu, 0.5 μL ileri primer, 0.5 μL ters primer, 10.5 μLddH2Ove 12.5 μL 2x Taq PCR Master Mix'ten oluşur (bkz. PCR reaksiyon koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 94 °C'de 3 dakika boyunca ilk denatürasyon; 30 sn boyunca 94 ° C'de 35 döngü denatürasyon, 30 s boyunca 55 ° C'de tavlama ve 90 s boyunca 72 ° C'de uzatma; 72 °C'de 10 dakika son uzatma. Daha fazla analiz için PCR ürünlerini 4 °C'de saklayın.
- Evrensel mantar ITS primerleri (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3') kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirin. Toplam reaksiyon hacmi 25 μL'dir ve 1 μL DNA şablonu, 0.5 μL ileri primer, 0.5 μL ters primer, 10.5 μLddH2Ove 12.5 μL 2x Taq PCR Master Mix'ten oluşur. PCR koşullarını 5 dakika boyunca 95 °C'ye ayarlayın; 30 saniye boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 55 °C ve 90 saniye boyunca 72 °C 35 döngü; ardından 10 dakika boyunca 72 °C. Daha fazla analiz için PCR ürünlerini 4 °C'de saklayın.
- İki tip PCR ürününün her biriyle eşit şekilde karıştırmak için Süper Yeşil nükleik asit boyası kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bunları 1x TAE tamponunda (50x TAE'den seyreltilmiş) %1'lik bir agaroz jel üzerinde elektroforez ile analiz edin. Referans olarak 3 μL DNA işaretleyici kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Jeli gözlemlemek ve hedef parçayı bulmak için bir UV transillighter kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
D. antiqua'nın yaşam evreleri Şekil 4'te gösterilmiştir. Tüm yaşam döngüsü yumurtalar, larvalar, pupa (Şekil 4C) ve yetişkinlerden (Şekil 4D) oluşur. Steril santrifüj tüplerinde yetiştirilirler ve görünümleri ve hayatta kalma oranları, aksenik olmayan koşullar altında yetiştirilen D. antiqua'dan ayırt edilemez. D. antiqua'nın her aşaması için büyüme ve gelişme süreleri Şekil 6'da bulunabilir. Aksenik olarak yetiştirilmeyen D. antiqua'nın yumurta aşaması 2.83 ± 0.29 gün ve aksenik olarak yetiştirilen D. antiqua'nın yumurta aşaması 2.83 ± 0.29 gündür ve ikisi arasında anlamlı bir fark yoktur (Bağımsız t-testi, t = 0.00, p = 1.00). Normal larva dönemi 13.83 ± 0.76 gün sürerken, aksenik larva dönemi 14.50 ± 0.50 gün sürer ve ikisi arasında anlamlı bir fark yoktur (Bağımsız t-testi, t=1.27, p=0.27). Normal olarak yetiştirilen D. antiqua'nın pupa evresi 17.33 ± 0.76 gün, aksenik olarak yetiştirilen D. antiqua'nın ise 18.00 ± 0.50 gündür ve ikisi arasında anlamlı bir fark yoktur (Bağımsız t-testi, t = 1.27, p = 0.27). Erginlerin sağkalım süresi normal yetiştirme için 81.50 ± 1.00 gün, aksenik yetiştirme için 80.33 ± 0.76 gün olup, ikisi arasında anlamlı bir fark yoktur (Bağımsız t-testi, t=1.61, p=0.18). Aksenik D. antiqua ile normal şartlarda yetiştirilenler arasında gelişim süresi açısından önemli bir fark olmadığı görülmektedir.
Kültüre bağlı testler, larva bağırsaklarında koloni tespit edilmediğini göstermiştir (Şekil 7). Ayrıca, bakteriyel 16S rRNA'ya dayalı PCR analizi, endosimbiyotik bir bakteri olan Wolbachia (Bu nükleotid dizisi için GenBank erişim numarası: OR564190) olarak tanımlanan yaklaşık 1500 bp'de bir bandın varlığını ortaya çıkardı (Şekil 8A). Bununla birlikte, fungal ITS bölgelerini hedef alan PCR analizinde herhangi bir bant gözlenmemiştir (Şekil 8B). Bu, larvaların aksenik duruma ulaştığını gösterir. Aksenik larvalar, D. antiqua ve mikroorganizmalar arasındaki etkileşim mekanizmalarının incelenmesi ve ayrıca D. antiqua'nın neden olduğu hasarın önlenmesi ve kontrol edilmesi için büyük önem taşımaktadır.
Şekil 1: D. antiqua için yetiştirme araçları ve yem. (A) Larvalar için yeşil soğanın beyaz kısmı. (B) Yetişkinler için su sebili. (C) Yetişkinler için yiyecek. (D) Yumurtalar için toplama cihazı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Diyet hazırlama bileşenleri. (A) Öğütülmüş yeşil soğan. (B) Fermente yeşil soğanlar. (C) Fermente yeşil soğan kalıntısı ve süzüntü. (D) Hazır diyetler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yumurta transfer süreci. (A) Hücre süzgecindeki yumurtalar. (B) Uç ucu olmadan 1 mL pipet. (C) Yumurtalı 1 mL pipet. (D) Diyetlere aktarılan yumurtalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Aksenik D. antiqua'nın yaşam evreleri. (A) Yumurtalar. (b) larvalar. (c) Pupa. (D) Kadın ve erkek yetişkinler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Larva bağırsaklarının diseksiyon işlemi. (A) Larvaların başı ve kuyruğu. (B) Baş ve kuyruk çıkarılmış larva. (C) Ayrılmış bağırsak ve vücut dokuları. (D) Diseksiyondan sonra sağlam bir bağırsak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Normal olarak yetiştirilen ve aksenik olarak yetiştirilen D. antiqua'nın her büyüme aşamasının gelişim süresi. Aksenik olarak yetiştirilen ve normal olarak yetiştirilen D. antiqua arasında gelişim süresi açısından önemli bir fark yoktur. Bağımsız t-testi, p < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Rastgele üç larva seçilerek ve bağırsak homojenatları TSA ve PDA agar plakalarında inkübe edilerek D. antiqua'nın sterilitesinin doğrulanması. Steril rasyonlarla beslenen larvalarda bakteriye rastlanmamıştır. (A) TSA'daki aksenik larvalar. (B) TSA'daki normal larvalar. (C) PDA'daki aksenik larvalar. (D) PDA'daki normal larvalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Üniversal 16S rRNA primerleri ve fungal ITS primerleri kullanılarak PCR analizi ile D. antiqua'nın sterilitesinin doğrulanması. 16S rRNA geninin hedef bandı ~1.500 bp'dir. Yaklaşık 1500 bp'lik bir bant gözlendi ve endosimbiyotik bakteri Wolbachia olarak tanımlandı. ITS geninin hedef bandı 500-750 bp'dir. AF gruplarında hedef bant gözlenmedi. (A) 16S rRNA elektroferogramı. (B) Elektroferogramı. Kısaltmalar: M = işaretleyici; NC = negatif kontrol; NF = normal beslenme; AF = eksenik besleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Böcekler oldukça karmaşık bir bağırsak mikrobiyotasına20,21 sahiptir ve böcek-mikroorganizma etkileşimlerini incelemek için spesifik bağırsak mikrobiyal suşları ile aşılanmış aksenik böceklerin kullanılmasını gerektirir. Aksenik böceklerin hazırlanması bu tür araştırma çabaları için çok önemlidir. Antibiyotik tedavisi, bağırsak mikrobiyotasını ortadan kaldırmak için kullanılan bir yöntemdir. Örneğin, Jung ve Kim22, Spodoptera exigua'yı penisilin ile beslerken, Raymond23, bağırsak bakterilerini temizlemek için rifampisin içeren yapay bir diyetle P. xylostella'yı besledi. Bununla birlikte, antibiyotik tedavisi bağırsak bakterilerini tamamen ortadan kaldıramaz ve konakçı böcekler üzerinde birçok yan etkiye sahiptir. Bunlar arasında metabolik enzim aktivitesindeki değişiklikler, bozulmuş bağırsak fonksiyonu, büyüme, gelişme ve üremenin engellenmesi ve ayrıca artan ölüm oranları 23,24,25 yer alır. Sonuç olarak, böcek bağırsak mikrobiyotasının işlevselliği antibiyotik tedavisinden sonra maskelenebilir. Neyse ki, bu sorun, yumurtaların yüzeyinin kimyasal olarak dezenfekte edilmesiyle aşılabilir ve aksenik böceklerin nispeten kolaylıkla üretilmesine izin verir16. Nispeten, yumurtaların yüzey dezenfeksiyonu ve ardından steril diyetlerle beslenmenin kombinasyonu, antibiyotik tedavisinden daha etkili ve uygulanabilirdir26,27.
Aksenik D. antiqua'nın elde edilmesi, öncelikle aksenik yumurtaların ve steril diyetlerin kullanılmasına dayanır. Diğer böcek türleriyle karşılaştırıldığında, D. antiqua'nın yumurtaları nispeten küçüktür. Yumurtaları kısaca %0.1 sodyum dodesilbenzen sülfonat içinde ıslatmak ve ardından aksenik hamamböceği yumurtaları 28 elde etmek için %2 hidrojen peroksit çözeltisi ile 5 dakikalık bir işlem yapmak veya kırmızı palmiye bitininyumurtalarını dezenfekte etmek için 10 dakika boyunca %10 sodyum hipoklorit çözeltisi kullanmak gibi daha önce kullanılan dezenfeksiyon yöntemleri29, D. antiqua'yı dezenfekte etmek için uygun değildir Yumurta. Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) yumurtalarını sterilize etmek için el dezenfektanı olarak kullanılan hidrojen peroksit solüsyonları ve yüzey dezenfektanı olarak hidrojen peroksit kullanılmasıgibi Diptera türlerinin yumurtalarının dezenfeksiyonu ile ilgili önceki çalışmalar mevcuttur 30. Bu nedenle, dezenfektan seçimini ve dezenfeksiyon süresini optimize etmek gerekli hale gelir. Deneyden sonra, %0.26 NaClO ve %75 EtOH kullanarak, yumurtaları 0.5 dakika dezenfekte etmenin ve işlemi üç kez tekrarlamanın D. antiqua yumurtalarının sterilizasyonunu sağlayabileceği bulunmuştur.
Aksenik yumurtalar elde edildikten sonra, axenic D. antiqua yetiştirmenin bir diğer önemli yönü, onlara in vitro larvalar için steril diyetler sağlamaktır. Yapay diyetler doğal gıdaları tam olarak kopyalayamasa da,çalışmalar 31,32,33 yapay diyetler kullanarak böcek yetiştirmenin fizibilitesini göstermiştir. Yapay diyetlerin besin içeriği, bağışıklık sistemini ve böceklerin adaptasyonunu etkileyebilir34. Bu nedenle, yapay olarak hazırlanmış diyetlerin doğal gıdalara benzer besin bileşenleri içermesi önemlidir. Bu, yetiştirilen böceklerin gelişimleri, bağışıklık tepkileri ve genel sağlıkları için gerekli besinleri almalarını sağlamaya yardımcı olacaktır. Bu çalışmada yeşil soğan, D. antiqua için steril diyetlerin birincil bileşeni olarak hizmet vermektedir. Yarı fermente diyetler, D. antiqua için daha iyi besinler sağlayarak büyümelerine ve gelişmelerine katkıda bulunur. Ek olarak, larva homojenatın diyetlerle karıştırılması, diyetlerin bağırsak mikrobiyotasının vücut dışında sindirimini kolaylaştırmayı amaçlar. Bunun nedeni, bağırsak bakterilerinin böceklerin beslenmesi ve sindirimi üzerinde etkili olmasıdır35. D. antiqua için steril diyetler hazırlamak için bu yöntemi kullanmak, süreci basitleştirir ve diyet hazırlamanın etkinliğini önemli ölçüde artırır.
Hücreler içinde maternal olarak bulaşan bakteriyel simbiyontlar böceklerde yaygın olarak bulunur36. Maternal yolla bulaşan hücre içi bir bakteri olan Wolbachia, çok sayıda böcekte bulunur37. Wolbachia, en yaygın olarak üreme manipülasyonundaki rolüyle bilinir, çünkü konakçının yavrularının cinsiyet oranını daha fazla enfekte dişiler üretmeye yönlendirebilir38. Aksenik durumu doğrulandıktan sonra D. antiqua larvaları, D. antiqua'daki yumurtalık dokusu hücrelerinin sitoplazmasında bulunan ve yumurta hücrelerinin sitoplazması yoluyla nesiller boyunca dikey olarak iletilen endosimbiyotik bakteri Wolbachia hariç, larvaların dezenfeksiyondan sonra esasen aksenik olduğu bulundu. Wolbachia'yı ortadan kaldırma yöntemine gelince, antibiyotik tedavisi yaygın bir yaklaşımdır. Özet olarak, bu makale axenic D. antiqua yetiştirmek için bir yöntem sunmaktadır. Protokole göre, axenic D. antiqua başarıyla yetiştirilebilir. Ayrıca, bu yöntem basitliği ve düşük maliyeti ile karakterize edilir, diğer aksenik böceklerin yetiştirilmesi için yeni bir yaklaşım sağlar ve böcekler ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki etkileşimleri incelemenin fizibilitesini arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32272530), Jinan'daki Üniversite için Yeni Yirmi Politika Projesi (2021GXRC040), Shandong Eyaletindeki Büyük Bilimsel ve Teknolojik İnovasyon Projeleri (2021TZXD002) ve Qilu Teknoloji Üniversitesi Bilim ve Eğitim Entegrasyon Projesi (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
