Summary
Viene descritta una semplice procedura per l'allevamento di Delia antiqua axenica con diete sterili semifermentate. Solo un ceppo di Wolbachia è stato rilevato in ogni stadio di D. antiqua axenico utilizzando la PCR.
Abstract
Gli insetti axenici sono ottenuti da sistemi di allevamento artificiale sterili che utilizzano terreni sterili. Questi insetti, caratterizzati da piccole dimensioni, breve ciclo di crescita e basso fabbisogno alimentare, sono ideali per studiare la relazione tra microrganismi e ospiti. Il microbiota intestinale influenza in modo significativo le caratteristiche fisiologiche degli insetti ospiti e l'introduzione di ceppi specifici negli insetti axenici fornisce un metodo per verificare le funzioni microbiche intestinali. La Delia antiqua, un parassita minaccioso dell'ordine dei Ditteri, della famiglia Anthomyiidae e del genere Delia, si nutre principalmente di cipolle, aglio, porri e altri ortaggi della famiglia delle Liliaceae. Le sue larve si nutrono dei bulbi, causando marciume, appassimento e persino la morte di intere piante. Allevando larve axeniche, è possibile condurre studi di follow-up per osservare gli effetti della microflora intestinale sulla crescita e sullo sviluppo di D. antiqua. A differenza del metodo che prevede l'eliminazione antibiotica dei microbi associati, questo articolo presenta un approccio a basso costo e ad alta efficienza per l'allevamento di D. antiqua axenico. Dopo la sterilizzazione superficiale delle uova di D. antiqua , sono state utilizzate diete sterili semifermentate per allevare le larve e lo stato axenico di D. antiqua è stato verificato attraverso saggi dipendenti dalla coltura e indipendenti dalla coltura. In conclusione, la combinazione della sterilizzazione delle uova di insetti e la preparazione di diete sterili per la coltura larvale ha permesso lo sviluppo di un metodo efficiente e semplice per ottenere D. antiqua axenico. Questo metodo fornisce un potente approccio allo studio delle interazioni tra insetti e microflora.
Introduction
Gli animali axenici, definiti come animali in cui non è possibile rilevare microrganismi o parassiti vitali, sono validi modelli sperimentali per lo studio delle interazioni ospite-microrganismo 1,2. Gli insetti, il gruppo più numeroso di invertebrati, possono formare relazioni simbiotiche con i microrganismi3. Gli insetti axenici possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-simbionte in sistemi simbiotici4. Ad esempio, Nishide et al.5 hanno stabilito una pratica procedura di allevamento sterile per il verme maleodorante Plautia stali, consentendo un'analisi affidabile e rigorosa delle interazioni ospite-simbionte in sistemi simbiotici modello. Gli insetti axenici possono essere prodotti sterilizzando lo stadio di uovo e fornendo cibo sterile alle larve e agli adulti 6,7. Gli insetti axenici sono di grande importanza e sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Ad esempio, uno studio condotto da Somerville et al.8 ha dimostrato che le falene diamondback inoculate con cloache di Enterobacter hanno migliorato l'adattabilità dei maschi transgenici.
La Delia antiqua Meigen è un parassita economicamente importante per le cipolle e altre colture di Liliaceae in tutto il mondo, con le sue larve che danneggiano i bulbi delle cipolle e di altre colture di Liliaceae9. D. antiqua si trova principalmente nei climi temperati ed è diffusa nelle aree di coltivazione delle cipolle delle Americhe, dell'Europa e dell'Asia. Se non adeguatamente controllata, può causare perdite di raccolto nelle cipolle (Allium cepa L.), nell'aglio (Allium sativum L.), nello scalogno (Allium fistulosum L.) e nei porri (Alliumchoenoprasum L.) che vanno dal 50% al 100%10,11. Le larve si nutrono delle parti sotterranee delle piante e questa alimentazione fa appassire le piantine e alla fine morire. Inoltre, le piante danneggiate possono consentire l'ingresso di agenti patogeni, portando alla decomposizione del bulbo12. Anche se le piante non vengono completamente consumate dalle larve, i danni che provocano rendono le piante di cipolla non commerciabili e si traducono in perdite economiche.
Gli insetti sono strettamente associati al microbiota intestinale e la maggior parte delle viscere degli insetti contiene una varietà di batteri simbionti che prosperano grazie ai nutrienti forniti dall'ospite13,14. Jing et al.15 hanno dimostrato che la funzione primaria della comunità simbiotica intestinale è quella di fornire nutrienti essenziali, seguiti da funzioni legate alla digestione e alla disintossicazione. In alcuni casi, i batteri intestinali possono fungere da risorsa microbica per scopi di gestione dei parassiti. Di conseguenza, è auspicabile studiare le prestazioni dei singoli batteri intestinali e le funzioni specifiche all'interno del corpo di D. antiqua. Pertanto, la preparazione di larve axeniche è particolarmente importante per studiare le interazioni tra specifici ceppi batterici e insetti16. Attualmente, un metodo comunemente usato per eliminare i batteri intestinali degli insetti è l'uso di una combinazione di antibiotici per sradicare i microbi associati 17,18,19. A differenza dell'uso dei soli antibiotici, che possono solo ridurre il numero di microbi, l'allevamento axenico degli insetti consente di controllare la composizione e la quantità di microrganismi, consentendo una convalida più accurata della funzionalità del microbiota intestinale.
Pertanto, questo articolo introduce un protocollo per la preparazione e l'allevamento di D. antiqua axenico. Il cibo larvale Axenic è ottenuto utilizzando la sterilizzazione ad alta temperatura di diete naturali combinate con alimenti semifermentati. Le uova vengono sterilizzate seguendo un protocollo sperimentale per ottenere le uova axeniche e, infine, le larve axeniche vengono coltivate dalle uova axeniche. Il sistema di allevamento axenico è stato effettuato per una sola generazione per l'esperimento. Ciò fornirà comodità per studiare l'interazione tra insetti e microbiota intestinale.
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Protocol
D. antiqua sono ottenuti dal campo di Fanzhen, Taian.
1. Preparazione di diete sterili
- Staccare gli strati esterni dello scalogno e scartare le foglie verdi. Conservare la parte bianca dello scalogno (Figura 1A) e lavarli con acqua sterile, ripetendo il processo di risciacquo tre volte. Tagliare la parte bianca dello scalogno a pezzetti di 1-2 cm con le forbici (vedi Tabella dei materiali) sterilizzati con una soluzione di EtOH al 75 % (menzionata al punto 2.5) per un uso successivo.
- Pesare 50 g di scalogno tagliato a dadini e metterli in un robot da cucina (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 50 ml di acqua sterilizzata e macinarli cinque volte per 2 minuti ciascuno. Tutti gli scalogni tagliati a dadini devono essere macinati fino a ottenere una consistenza pastosa (Figura 2A).
- Utilizzare una pinzetta per trasferire 10 larve di D. antiqua in una provetta da centrifuga da 10 mL contenente 10 ml di PBS 1x e macinarle con un pestello di macinazione usa e getta (vedere la tabella dei materiali) per circa 5 minuti per ottenere un liquido di macinazione larvale.
- Versare il liquido pastoso di scalogno e il liquido di macinazione delle larve in un matraccio conico pulito da 500 ml (vedi Tabella dei materiali). Avvolgere l'imboccatura conica del matraccio con due strati di pellicola sigillante trasparente, quindi porre il pallone in un incubatore ad agitazione (cfr. tabella dei materiali) per la fermentazione a 25 °C e 180 giri/min per 12 ore (figura 2B).
- Ritagliare sette strati di garza quadrata con lati di 10 cm (non c'è bisogno di sterilità) con le forbici e impilarli insieme per formare un semplice dispositivo filtrante. Versare lentamente il liquido di scalogno fermentato sulla garza e spremere il liquido filtrato in un nuovo pallone conico da 500 ml. Avvolgere i residui di scalogno rimanenti sulla garza in un foglio di stagnola per un uso successivo.
- Filtrare il filtrato ottenuto nella fase precedente utilizzando una pompa a vuoto (vedi Tabella dei materiali) e un imbuto Buchner. Mettere la carta da filtro bagnata dall'acqua deionizzata sull'imbuto Buchner, quindi versare il filtrato ed eseguire la filtrazione per aspirazione per tre volte con carta da filtro diversa. Raccogliere il filtrato finale nel matraccio conico da 500 ml.
- Eseguire un'altra filtrazione utilizzando un flacone filtrante da 0,22 μM e una pompa per vuoto. Avvitare il coperchio del pallone del filtro di aspirazione in un banco ultra-pulito (vedi Tabella dei materiali) per un ulteriore utilizzo. A questo punto si ottengono il residuo di scalogno fermentato e il filtrato (Figura 2C).
NOTA: Il liquido filtrato ottenuto da questo passaggio sarà sterile. (Il flacone filtrante da 0,22 μM è un sistema di filtrazione sterile sottovuoto per la sterilizzazione del filtrato). - Ripetere i passaggi precedenti per ottenere il residuo di scalogno non fermentato e filtrato. Qui la differenza è che la fermentazione non è necessaria.
- Pesare 0,24 g di cloruro di colina e 0,56 g di acido L-ascorbico (vedere Tabella dei materiali) in una provetta da centrifuga da 10 ml. Aggiungere 3 mL di acqua deionizzata e agitare energicamente fino a completa dissoluzione. Nel banco ultra-clean, utilizzare una nuova siringa da 5 mL e collegare tre filtri per siringa da 0,22 μM (vedere la tabella dei materiali) per sterilizzare la soluzione e inserirla in una provetta da centrifuga sterile da 10 mL per un uso successivo.
NOTA: Il cloruro di colina è un neurotrasmettitore essenziale per la crescita degli insetti, mentre l'acido L-ascorbico agisce come conservante. - Pesare 2 g di agar in polvere e 6 g di TSB (vedi Tabella dei materiali) e versarli in un matraccio conico da 500 ml. Quindi aggiungere 100 ml di acqua deionizzata per preparare il terreno di coltura. Dopo aver sciacquato la bacchetta di vetro con acqua deionizzata, usala per mescolare il composto fino a quando non è ben amalgamato. Quindi, sigillare il pallone conico con due strati di pellicola sigillante trasparente.
- Avvolgere lo scalogno fermentato e lo scalogno non fermentato (menzionato nei passaggi 1.5 e 1.8) in un foglio di alluminio e sterilizzarli, insieme al terreno di coltura, in autoclave a 121 °C per 20 minuti.
- Nel banco ultra-pulito, versare il cloruro di colina sterilizzato, l'acido L-ascorbico e il filtrato sterile nel terreno di coltura mentre si agita delicatamente per mescolarli accuratamente. Infine, aggiungere lo scalogno fermentato e non fermentato e agitare energicamente a mano per ottenere le diete sterili. Versare le diete nelle provette da centrifuga da 50 mL (sterili; tappo di sfiato con membrana idrofobica in PVDF da 0,22 μM) (vedere la tabella dei materiali) ad angolo (Figura 2D).
NOTA: Dopo la sterilizzazione, la temperatura del terreno di coltura deve essere mantenuta tra 65-80 °C per evitare un rapido raffreddamento e solidificazione durante l'aggiunta di scalogno o altri ingredienti. Inoltre, in ogni provetta, versare circa 10-15 ml di diete. Una volta che le diete si sono solidificate, conservare le provette in frigorifero a 4 °C, se non viene utilizzato immediatamente.
2. Acquisizione di uova axeniche
- Sistema di allevamento da laboratorio per D. antiqua
- Collocare una gabbia di allevamento in un'incubatrice illuminata a LED a 25 °C (24 ore a ciclo, il rapporto tra luce e buio è di 16:8) per allevare adulti maschi e femmine, consentendo loro di accoppiarsi e deporre le uova. Riempite d'acqua l'erogatore d'acqua (Figura 1B) e sigillatelo con un batuffolo di cotone inumidito per fornire acqua agli adulti.
- Posizionare quattro fondi per piastre di Petri da 35 mm x 12 mm in un coperchio per piastre di Petri da 94 mm x 16 mm. Bagnare un batuffolo di cotone con acqua ionizzata e poi posizionare un batuffolo di cotone umido su due dei fondi delle piastre di Petri e, sopra il batuffolo di cotone, aggiungere un cucchiaio di saccarosio.
- Riempire gli altri due fondi delle piastre di Petri con due cucchiai di saccarosio ed estratto di lievito (vedi Tabella dei materiali), che servono da cibo per gli insetti adulti (Figura 1C).
NOTA: L'estratto di saccarosio e lievito menzionato nei passaggi 2.1.2 e 2.1.3 non deve essere sterilizzato. - Mettere un fondo di una capsula di Petri di 94 mm x 16 mm contenente sabbia inumidita e un pezzo di spicchio d'aglio sbucciato senza radici (Figura 1D) all'interno della gabbia per mosche per raccogliere le uova. La femmina sarà attratta dall'odore dell'aglio e deporrà le uova intorno ad esso.
- Raccolta delle uova
- Estrarre dalla gabbia il dispositivo di ovideposizione, che è una capsula di Petri di 94 mm x 16 mm contenente sabbia e aglio menzionati sopra (passaggio 2.14). Versare la sabbia insieme all'aglio in un bicchiere da 500 ml e utilizzare l'acqua del rubinetto per sciacquare le uova rimanenti dall'aglio nel bicchiere. A questo punto, le uova galleggiano nell'acqua.
- Prendi un setaccio da 100 maglie (vedi Tabella dei materiali) e inumidiscilo con acqua di rubinetto. Quindi versare l'acqua contenente le uova galleggianti dal bicchiere sul setaccio. Le uova rimarranno sul setaccio.
- Dopo che le uova si sono asciugate naturalmente sul setaccio, usa un pennello per spazzare delicatamente le uova su una capsula di Petri.
- Il primo giorno, sciacquare il dispositivo di ovideposizione per raccogliere le uova senza disinfezione o sterilizzazione. Il secondo giorno alle quattro del pomeriggio, sciacquate di nuovo le uova e raccoglietele setacciandole con acqua pulita.
NOTA: La raccolta delle uova il secondo giorno serve a garantire un tasso di crescita costante nelle fasi successive. Alle quattro del pomeriggio c'è il picco di deposizione delle uova per D. antiqua. Pertanto, è ideale raccogliere le uova in questo momento. - Mettere gli ovuli raccolti su un setaccio cellulare sterile (vedi Tabella dei materiali) nel banco ultra-pulito (Figura 3A).
- Preparare la soluzione per la sterilizzazione degli ovuli
- Prelevare 5 mL di NaClO al 5,2% (vedere la tabella dei materiali) e trasferirli in un matraccio conico sterilizzato da 250 ml. Aggiungere 95 mL di acqua sterilizzata per ottenere un volume totale di 100 mL, ottenendo una soluzione di NaClO allo 0,26%.
- Per preparare una soluzione di EtOH al 75%, prelevare 75 mL di EtOH al 99,7% e trasferirli in un matraccio conico sterilizzato da 250 mL. Aggiungere 25 mL di acqua sterilizzata per ottenere un volume totale di 100 mL, ottenendo una soluzione di EtOH al 75%.
- Versare 30 mL di NaClO in una capsula di Petri e versare 30 mL di EtOH in un'altra capsula di Petri. Mettere il setaccio contenente le uova menzionate al punto 2.4 nella capsula contenente NaClO. Immergerlo nella soluzione di NaClO allo 0,26% per 0,5 minuti. Quindi trasferire il setaccio nella capsula contenente EtOH, lasciandolo in ammollo nella soluzione di EtOH al 75% per altri 0,5 minuti.
- Ripetere questo processo tre volte, alternando tra lo 0,26% di NaClO e il 75% di EtOH ogni 0,5 minuti. Dopodiché si otterranno le uova axeniche. A questo punto, il setaccio contenente le uova deve essere immerso in EtOH.
NOTA: Per garantire una sterilizzazione accurata, utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare NaClO ed EtOH e disperdere gli ovuli. Ripetere il processo di risciacquo più volte. Questo passaggio pulirà ulteriormente la superficie delle uova da batteri residui e impurità, garantendo una superficie pulita e sterile.
3. Allevamento di larve axeniche
- Per trasferire gli ovuli sterilizzati, utilizzare un paio di forbici sterilizzate con una lampada ad alcool per tagliare la punta terminale di una pipetta da 1 mL (Figura 3B). Assicurarsi che l'apertura finale della pipetta tagliata sia maggiore del diametro delle uova (circa 2 mm). Quindi, utilizzare la pipetta per trasferire le uova dalla soluzione di EtOH (uova insieme alla soluzione) (Figura 3C) a una provetta da centrifuga contenente le diete sterili e ogni provetta dovrebbe contenere circa 20-50 uova (Figura 3D). Ripeti questo processo fino a quando tutti gli ovuli non sono stati trasferiti.
NOTA: Il diametro del puntale della pipetta deve essere il più grande possibile per evitare la rottura degli ovuli durante il trasferimento, che potrebbe portare alla loro morte. - Utilizzare una pipetta per rimuovere l'etanolo in eccesso dalla provetta. Posizionare la provetta da centrifuga chiusa con i coperchi all'interno di un sacchetto autosigillante e posizionare un pezzo di cotone all'apertura del sacchetto per consentire la circolazione dell'aria. Infine, posizionare il sacchetto all'interno di un'incubatrice a 25 °C (umidità relativa: 50%-70%; fotoperiodo: 16 h luce: 8 h buio) per l'osservazione e la coltivazione.
- Circa tre giorni dopo, le uova axeniche nelle diete iniziano a schiudersi (Figura 4A). Le larve schiuse saranno attive e la superficie delle diete sterili non sarà più liscia. Le larve inizieranno a nutrirsi delle diete.
- Continuare ad osservare le larve fino a quando non raggiungono lo stadio di larve di 2° stadio. Continua a monitorare la loro crescita e il loro sviluppo durante questo periodo.
- Dopo 9-12 giorni, oltre l'80% delle uova si è sviluppato in larve di 3° stadio (Figura 4B). Ciò indica il successo della crescita e dello sviluppo delle larve.
4. Validazione di larve axeniche con saggi coltura-dipendenti
- Seleziona in modo casuale tre larve axeniche di 3° stadio dalla provetta da centrifuga.
- Mettere le larve in una capsula di Petri di 94 mm x 16 mm contenente alcol al 75% per la pulizia. Dopodiché, trasferiscili in un contenitore con acqua sterile per un ulteriore risciacquo.
- Utilizzare una pinza da dissezione disinfettata che è stata sterilizzata con una soluzione di EtOH al 75% per afferrare le larve (la testa e la coda sono mostrate nella Figura 5A). Utilizzare le forbici da dissezione per rimuovere le estremità della testa e della coda (Figura 5B). Tenere la coda delle larve con la pinza e utilizzare un'altra pinza per premere delicatamente dalla coda alla testa ed estrarre gli organi interni (il risultato mostrato nella Figura 5C). Mettere gli organi interni in acqua deionizzata e staccare delicatamente l'intestino premendo sul tessuto adiposo con una pinza, quindi mettere l'interno estratto (Figura 5D) in acqua sterile per un ulteriore utilizzo.
- Mettere l'intestino in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 500 μL di tampone PBS 1x sterilizzato e utilizzare un pestello monouso per macinare il tessuto intestinale in un omogenato.
- Prelevare 100 μL di omogenato e aggiungerlo a un terreno di agar nutritivo. Utilizzare uno spandiconcime a forma di L (vedi Tabella dei materiali) per striare la piastra di agar.
- Porre la capsula di Petri in un incubatore biochimico a 28 °C e incubare per 72 ore per osservare la crescita delle colonie.
5. Validazione di larve axeniche con saggi indipendenti dalla coltura
- Estrarre il DNA totale dal tessuto intestinale delle larve axeniche utilizzando un kit per l'estrazione del DNA (vedere la tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
- Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV.
- Eseguire la reazione PCR utilizzando primer universali per l'rRNA batterico 16S (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Il volume totale di reazione è di 25 μL ed è costituito da 1 μL di DNA stamp, 0,5 μL di primer diretto, 0,5 μL di primer inverso, 10,5 μL ddH2O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (vedi Tabella dei materiali). Impostare le condizioni di reazione della PCR come segue: denaturazione iniziale a 94 °C per 3 min; 35 cicli di denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura a 55 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 90 s; prolungamento finale a 72 °C per 10 min. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per ulteriori analisi.
- Eseguire la reazione PCR utilizzando primer ITS fungini universali (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Il volume totale della reazione è di 25 μL ed è costituito da 1 μL di DNA stampo, 0,5 μL di primer diretto, 0,5 μL di primer inverso, 10,5 μL ddH2O e 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Impostare le condizioni della PCR a 95 °C per 5 min; 35 cicli di 95 °C per 30 s, 55 °C per 1 min e 72 °C per 90 s; seguito da 72 °C per 10 min. Conservare i prodotti PCR a 4 °C per ulteriori analisi.
- Utilizzare il colorante per acidi nucleici Super Green (vedere la tabella dei materiali) per miscelare uniformemente con ciascuno dei due tipi di prodotti per PCR e analizzarli mediante elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE (diluito da 50x TAE, vedere la tabella dei materiali). Utilizzare 3 μL di marcatore di DNA (vedi Tabella dei materiali) come riferimento.
- Utilizzare un transilluminatore UV per osservare il gel e individuare il frammento bersaglio.
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Representative Results
Le fasi di vita di D. antiqua sono illustrate nella Figura 4. Il ciclo vitale completo comprende uova, larve, pupe (Figura 4C) e adulti (Figura 4D). Sono coltivati in provette da centrifuga sterili e il loro aspetto e il loro tasso di sopravvivenza sono indistinguibili da D. antiqua allevati in condizioni non axeniche. I tempi di crescita e sviluppo per ogni stadio di D. antiqua sono riportati nella Figura 6. Lo stadio di uovo di D. antiqua allevato non assinicamente è di 2,83 ± 0,29 giorni, e quello di D. antiqua allevato assinicamente è di 2,83 ± 0,29 giorni, senza differenze significative tra i due (test t indipendente, t = 0,00, p = 1,00). Lo stadio larvale normale dura 13,83 ± 0,76 giorni, mentre lo stadio larvale axenico dura 14,50 ± 0,50 giorni, senza differenze significative tra i due ( test t indipendente, t = 1,27, p = 0,27). Lo stadio pupale di D. antiqua allevato normalmente è di 17,33 ± 0,76 giorni, e quello di D. antiqua allevato assinicamente è di 18,00 ± 0,50 giorni, senza differenze significative tra i due (test t indipendente, t = 1,27, p = 0,27). Il tempo di sopravvivenza degli adulti è di 81,50 ± 1,00 giorni per l'allevamento normale e di 80,33 ± 0,76 giorni per l'allevamento axenico, senza differenze significative tra i due (Independent t-test, t = 1,61, p = 0,18). Si può osservare che non c'è alcuna differenza significativa nel tempo di sviluppo tra l'axenico D. antiqua e quelli allevati in condizioni normali.
I saggi colturali hanno mostrato che non sono state rilevate colonie nell'intestino larvale (Figura 7). Inoltre, l'analisi PCR basata sull'rRNA batterico 16S ha rivelato la presenza di una banda a circa 1500 bp (Figura 8A), identificata come Wolbachia (Il numero di accesso GenBank per questa sequenza nucleotidica è: OR564190), un batterio endosimbiotico. Tuttavia, non sono state osservate bande nell'analisi PCR mirata alle regioni ITS fungine (Figura 8B). Ciò indica che le larve hanno raggiunto lo stato axenico. Le larve axeniche sono di grande importanza per lo studio dei meccanismi di interazione tra D. antiqua e microrganismi, nonché per prevenire e controllare i danni causati da D. antiqua.
Figura 1: I dispositivi di allevamento e il mangime per D. antiqua. (A) La parte bianca dello scalogno per le larve. (B) Distributore d'acqua per adulti. (C) Alimenti per adulti. (D) Dispositivo di raccolta delle uova. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Componenti della preparazione delle diete. (A) Scalogno macinato. (B) Scalogno fermentato. (C) Residuo e filtrato di scalogno fermentato. (D) Diete preparate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il processo di trasferimento degli ovuli. (A) Uova nel setaccio cellulare. (B) Pipetta da 1 mL senza il puntale terminale. (C) Pipetta da 1 mL con uova. (D) Uova trasferite nelle diete. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Stadi vitali di D. antiqua axenico. (A) Uova. (B) Larve. (C) Pupa. (D) Adulti di sesso femminile e maschile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il processo di dissezione dell'intestino larvale. (A) La testa e la coda della larva. (B) La larva senza testa e coda. (C) Separazione dei tessuti intestinali e corporei. (D) Un intestino intatto dopo la dissezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Tempo di sviluppo di ogni stadio di crescita di D. antiqua allevato normalmente e assinicamente. Nessuna differenza significativa nel tempo di sviluppo tra D. antiqua allevato assialmente e normalmente allevato. Test t indipendente, p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Conferma della sterilità di D. antiqua selezionando in modo casuale tre larve e incubando omogenati intestinali su piastre di agar TSA e PDA. Non sono stati osservati batteri nelle larve alimentate con diete sterili. (A) Larve axeniche su TSA. (B) Larve normali su TSA. (C) Larve axeniche su PDA. (D) Larve normali su PDA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Conferma della sterilità di D. antiqua mediante analisi PCR utilizzando primer universali per rRNA 16S e primer ITS fungini. La banda bersaglio del gene rRNA 16S è ~1.500 bp. Una banda di circa 1500 bp è stata osservata e identificata come il batterio endosimbiotico Wolbachia. La banda bersaglio del gene ITS è 500-750 bp. Nei gruppi AF non è stata osservata alcuna banda bersaglio. (A) Elettroferogramma dell'rRNA 16S. (B) Elettroferogramma ITS. Abbreviazioni: M = marcatore; NC = controllo negativo; NF = alimentazione normale; AF = alimentazione axenica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli insetti possiedono un microbiota intestinale altamente complesso 20,21, che richiede l'uso di insetti axenici inoculati con ceppi microbici intestinali specifici per studiare le interazioni insetto-microrganismo. La preparazione di insetti axenici è fondamentale per tali attività di ricerca. Il trattamento antibiotico è un metodo utilizzato per eliminare il microbiota intestinale. Ad esempio, Jung e Kim22 hanno nutrito Spodoptera exigua con penicillina, mentre Raymond23 ha nutrito P. xylostella con una dieta artificiale contenente rifampicina per eliminare i batteri intestinali. Tuttavia, il trattamento antibiotico non può eliminare completamente i batteri intestinali e ha molti effetti collaterali sugli insetti ospiti. Questi includono cambiamenti nell'attività enzimatica metabolica, compromissione della funzione intestinale, inibizione della crescita, dello sviluppo e della riproduzione, nonché aumento dei tassi di mortalità 23,24,25. Di conseguenza, la funzionalità del microbiota intestinale dell'insetto può essere mascherata dopo il trattamento antibiotico. Fortunatamente, questo problema può essere superato disinfettando chimicamente la superficie delle uova, consentendo la produzione di insetti axenici con relativa facilità16. In confronto, la combinazione di disinfezione superficiale delle uova seguita da alimentazione con diete sterili è più efficace e fattibile del trattamento antibiotico26,27.
L'ottenimento di D. antiqua axenico si basa principalmente sull'utilizzo di uova axeniche e diete sterili. Rispetto ad altre specie di insetti, le uova di D. antiqua sono relativamente piccole. I metodi di disinfezione utilizzati in precedenza, come immergere brevemente le uova in sodio dodecilbenzensolfonato allo 0,1% seguito da un trattamento di 5 minuti con una soluzione di perossido di idrogeno al 2% per ottenere uova di scarafaggio axenico28, o utilizzare una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per 10 minuti per disinfettare in superficie le uova del punteruolo rosso delle palme29, non sono adatti per la disinfezione di D. antiqua uova. Esistono studi precedenti sulla disinfezione delle uova delle specie Ditteri, come l'utilizzo di soluzioni di perossido di idrogeno utilizzate come disinfettante per le mani e perossido di idrogeno come disinfettante per superfici per sterilizzare le uova di Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. Pertanto, diventa necessario ottimizzare la scelta del disinfettante e dei tempi di disinfezione. Dopo la sperimentazione, è stato riscontrato che utilizzando lo 0,26% di NaClO e il 75% di EtOH, disinfettando le uova per 0,5 minuti e ripetendo il processo tre volte si può ottenere la sterilizzazione delle uova di D. antiqua .
Dopo aver ottenuto le uova axeniche, un altro aspetto cruciale dell'allevamento di D. antiqua axenica è fornire loro diete sterili per le larve in vitro. Sebbene le diete artificiali non possano replicare completamente il cibo naturale, gli studi 31,32,33 hanno dimostrato la fattibilità dell'allevamento di insetti utilizzando diete artificiali. Il contenuto nutrizionale delle diete artificiali può influenzare il sistema immunitario e l'adattabilità degli insetti34. Pertanto, è importante che le diete preparate artificialmente contengano componenti nutrizionali simili agli alimenti naturali. Ciò contribuirà a garantire che gli insetti allevati ricevano i nutrienti necessari per il loro sviluppo, la risposta immunitaria e la salute generale. In questo studio, lo scalogno funge da componente principale delle diete sterili per D. antiqua. Le diete semifermentate forniscono nutrienti migliori per D. antiqua, contribuendo alla loro crescita e sviluppo. Inoltre, la miscelazione dell'omogenato larvale con le diete mira a facilitare la pre-digestione delle diete da parte del microbiota intestinale al di fuori del corpo. Questo perché i batteri intestinali hanno un effetto sull'alimentazione e sulla digestione degli insetti35. L'utilizzo di questo metodo per preparare diete sterili per D. antiqua semplifica il processo e migliora significativamente l'efficienza della preparazione della dieta.
I simbionti batterici trasmessi per via materna all'interno delle cellule sono ampiamente presenti negli insetti36. La Wolbachia, un batterio intracellulare trasmesso per via materna, è presente in numerosi insetti37. Wolbachia è più comunemente noto per il suo ruolo nella manipolazione riproduttiva, in quanto può influenzare il rapporto tra i sessi della prole dell'ospite verso la produzione di più femmine infette38. Dopo aver verificato lo stato axenico delle larve di D. antiqua , si è scoperto che le larve erano essenzialmente axeniche dopo la disinfezione, ad eccezione del batterio endosimbionte Wolbachia, presente nel citoplasma delle cellule del tessuto ovarico in D. antiqua e trasmesso verticalmente attraverso le generazioni attraverso il citoplasma delle cellule uovo. Per quanto riguarda il metodo di eliminazione di Wolbachia, il trattamento antibiotico è un approccio comune. In sintesi, questo articolo presenta un metodo per l'allevamento di D. antiqua axenico. Secondo il protocollo, l'axenico D. antiqua può essere allevato con successo. Inoltre, questo metodo si caratterizza per la sua semplicità e il basso costo, fornendo un nuovo approccio per l'allevamento di altri insetti axenici e aumentando la fattibilità dello studio delle interazioni tra insetti e microbiota intestinale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32272530), dal progetto New Twenty Policies for University in Jinan (2021GXRC040), dai principali progetti di innovazione scientifica e tecnologica nella provincia di Shandong (2021TZXD002) e dal progetto di integrazione scientifica e didattica della Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
