Summary
En enkel procedur för uppfödning av axenisk Delia antiqua med halvfermenterade sterila dieter beskrivs. Endast en Wolbachia-stam detekterades i varje stjärna av axenisk D. antiqua med hjälp av PCR.
Abstract
Axeninsekter erhålls från sterila artificiella uppfödningssystem med sterila medier. Dessa insekter, som kännetecknas av sin lilla storlek, korta tillväxtcykel och låga foderbehov, är idealiska för att studera förhållandet mellan mikroorganismer och värdar. Tarmmikrobiotan påverkar i hög grad de fysiologiska egenskaperna hos insektsvärdar, och att introducera specifika stammar i axeninsekter ger en metod för att verifiera tarmmikrobiella funktioner. Delia antiqua, en hotfull skadegörare i ordningen Diptera, familjen Anthomyiidae och släktet Delia, livnär sig främst på lök, vitlök, purjolök och andra grönsaker av familjen Liliaceae. Dess larver livnär sig på lökarna och orsakar ruttnande, vissnande och till och med död av hela växter. Genom att föda upp axenlarver kan uppföljande studier genomföras för att observera effekterna av tarmmikrofloran på tillväxt och utveckling av D. antiqua. Till skillnad från metoden som involverar antibiotikaeliminering av associerade mikrober, presenterar denna artikel en billig och högeffektiv metod för att höja axenic D. antiqua. Efter ytsterilisering av D. antiqua-ägg användes halvfermenterade sterila dieter för att föda upp larver, och det axeniska tillståndet hos D. antiqua verifierades genom odlingsberoende och odlingsoberoende analyser. Sammanfattningsvis har kombinationen av sterilisering av insektsägg och beredning av steril föda för larvodling möjliggjort utvecklingen av en effektiv och enkel metod för att erhålla axenisk D. antiqua. Denna metod ger ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera interaktioner mellan insekter och mikroflora.
Introduction
Axeniska djur, definierade som djur där inga livsdugliga mikroorganismer eller parasiter kan detekteras, är värdefulla experimentella modeller för att studera värd-mikroorganisminteraktioner 1,2. Insekter, den största gruppen ryggradslösa djur, kan bilda symbios med mikroorganismer3. Axeniska insekter kan användas för att studera värd-symbiontinteraktioner i symbiotiska system4. Till exempel etablerade Nishide et al.5 en praktisk steril uppfödningsprocedur för illaluktande mask Plautia stali, vilket möjliggör tillförlitlig och rigorös analys av värd-symbiontinteraktioner i modellsymbiotiska system. Axeninsekter kan framställas genom att sterilisera äggstadiet och ge steril föda till larverna och de vuxna 6,7. Axeninsekter har stor betydelse och används flitigt inom biologisk forskning. Till exempel visade en studie utförd av Somerville et al.8 att diamantfjärilar som inokulerats med Enterobacter cloacae förbättrade anpassningsförmågan hos transgena hanar.
Delia antiqua Meigen är en ekonomiskt viktig skadegörare på lök och andra Liliaceae-grödor över hela världen, med sina larver som skadar lökarna på lök och andra Liliaceae-grödor9. D. antiqua finns främst i tempererade klimat och är utbredd i lökodlingsområden i Amerika, Europa och Asien. Om den inte kontrolleras på rätt sätt kan den orsaka skördeförluster i lök (Allium cepa L.), vitlök (Allium sativum L.), schalottenlök (Allium fistulosum L.) och purjolök (Alliumchoenoprasum L.) på mellan 50 % och 100 %10,11. Larverna livnär sig på de underjordiska delarna av växterna, och denna utfodring gör att plantorna vissnar och så småningom dör. Dessutom kan skadade växter tillåta patogener att komma in, vilket leder till lökröta12. Även om växterna inte äts upp helt av larverna, gör skadorna de orsakar lökplantorna osäljbara och resulterar i ekonomiska förluster.
Insekter är nära förknippade med tarmmikrobiota, och de flesta insekttarmar innehåller en mängd olika symbiotiska bakterier som trivs på de näringsämnen som värden ger13,14. Jing et al.15 visade att den primära funktionen hos tarmens symbiotiska samhälle är att tillhandahålla viktiga näringsämnen, följt av funktioner relaterade till matsmältning och avgiftning. I vissa fall kan tarmbakterier fungera som en mikrobiell resurs för skadedjursbekämpning. Därför är det önskvärt att studera de enskilda tarmbakteriernas prestationer och specifika funktioner i kroppen av D. antiqua. Därför är det särskilt viktigt att förbereda axenlarver för att studera samspelet mellan specifika bakteriestammar och insekter16. För närvarande är en vanlig metod för att eliminera insektstarmbakterier användningen av en antibiotikakombination för att utrota associerade mikrober 17,18,19. Till skillnad från att enbart använda antibiotika, som bara kan minska antalet mikrobiella ämnen, möjliggör axenuppfödning av insekter kontroll över sammansättningen och mängden mikroorganismer, vilket möjliggör en mer exakt validering av tarmmikrobiotans funktionalitet.
I denna artikel introduceras därför ett protokoll för beredning och uppfödning av axenic D. antiqua. Axenic larvfoder erhålls genom att använda högtemperatursterilisering av naturliga dieter i kombination med halvfermenterade livsmedel. Äggen steriliseras enligt ett experimentellt protokoll för att erhålla axeniska ägg, och slutligen odlas axenlarver från axenäggen. Axenuppfödningssystemet genomfördes endast under en generation för försöket. Detta kommer att göra det lättare att studera interaktionen mellan insekter och tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua erhålls från fältet Fanzhen, Taian.
1. Beredning av steril föda
- Skala av de yttre lagren av salladslöken och släng de gröna bladen. Behåll den vita delen av salladslöken (Figur 1A) och tvätta dem med sterilt vatten, upprepa sköljningen tre gånger. Skär den vita delen av salladslöken i 1-2 cm stora tärnade bitar med en sax (se Materialförteckning) steriliserad med 75 % EtOH-lösning (nämns i steg 2.5) för senare användning.
- Väg upp 50 g tärnad salladslök och lägg den i en matberedare (se Materialförteckning). Tillsätt 50 ml steriliserat vatten och mal dem fem gånger i 2 minuter vardera. Alla tärnade salladslökar ska malas till en pastaliknande konsistens (Figur 2A).
- Använd en pincett för att överföra 10 stycken 3:e stjärnlarver av D. antiqua till ett 10 ml centrifugrör som innehåller 10 ml 1x PBS, och mal dem med en engångsstöt (se materialtabell) i cirka 5 minuter för att få en larvslipvätska.
- Häll den degiga salladslöksvätskan och malningsvätskan i en ren 500 ml E-kolv (se materialförteckning). Linda in E-kolvens mynning med två lager genomskinlig förseglingsfilm och placera sedan kolven i en skakinkubator (se materialtabell) för jäsning vid 25 °C och 180 varv per minut i 12 timmar (figur 2B).
- Klipp ut sju lager fyrkantig gasväv med 10 cm tjocka sidor (inget behov av sterilitet) med en sax och stapla dem på varandra för att bilda en enkel filteranordning. Häll långsamt den fermenterade salladslöksvätskan på gasbindan och pressa ut den filtrerade vätskan i en ny 500 ml E-kolv. Linda in de återstående salladslöddresterna på gasbindan i aluminiumfolie för senare användning.
- Filtrera filtratet som erhölls i föregående steg med hjälp av en vakuumpump (se materialförteckning) och en Buchner-tratt. Lägg filterpapperet fuktat med avjoniserat vatten på Buchner-tratten och häll sedan filtratet och utför sugfiltrering tre gånger med olika filterpapper. Samla upp det slutliga filtratet i E-kolven på 500 ml.
- Utför ytterligare en filtrering med en 0.22 μM filterflaska och en vakuumpump. Skruva fast locket till sugfilterkolven i en ultraren bänk (se materialtabell) för vidare användning. Vid denna tidpunkt erhålls de jästa salladslöksresterna och filtratet (figur 2C).
OBS: Den filtrerade vätskan som erhålls från detta steg kommer att vara steril. (0,22 μM filterflaska är ett sterilt vakuumfiltreringssystem för sterilisering av filtratet). - Upprepa de föregående stegen för att få ojästa salladslöddrester och filtrat. Här är skillnaden att jäsningen inte behövs.
- Väg upp 0,24 g kolinklorid och 0,56 g L-askorbinsyra (se materialförteckning) i ett 10 ml centrifugrör. Tillsätt 3 ml avjoniserat vatten och skaka kraftigt tills de är helt upplösta. I den ultrarena bänken, använd en ny 5 ml spruta och fäst tre 0.22 μM sprutfilter (se Materialtabell) för att sterilisera lösningen och placera den i ett sterilt 10 ml centrifugrör för senare användning.
OBS: Kolinklorid är en viktig signalsubstans för tillväxt av insekter, medan L-askorbinsyra fungerar som konserveringsmedel. - Väg upp 2 g agarpulver och 6 g TSB (se materialförteckning) och häll dem i en 500 ml E-kolv. Tillsätt sedan 100 ml avjoniserat vatten för att förbereda odlingsmediet. Efter att ha sköljt glasstaven med avjoniserat vatten, använd den för att röra om blandningen tills den är väl blandad. Försegla sedan E-kolven med två lager genomskinlig förseglingsfilm.
- Linda in den fermenterade salladslöken och den ojästa salladslöken (som nämns i steg 1.5 och steg 1.8) i aluminiumfolie och sterilisera dem tillsammans med odlingsmediet i en autoklav vid 121 °C i 20 minuter.
- Häll den steriliserade kolinkloriden, L-askorbinsyran och det sterila filtratet i odlingsmediet i den ultrarena bänken medan du försiktigt snurrar för att blanda dem ordentligt. Tillsätt slutligen den fermenterade och ojästa salladslöken och skaka kraftigt för hand för att få fram den sterila kosten. Häll fodret i 50 ml centrifugrören (sterilt; ventilationslock med ett 0.22 μM PVDF hydrofobt membran) (se materialförteckning) i en vinkel (Figur 2D).
OBS: Efter sterilisering bör temperaturen på odlingsmediet hållas mellan 65-80 °C för att förhindra snabb kylning och stelning vid tillsats av salladslök eller andra ingredienser. Dessutom häller du cirka 10-15 ml foder i varje rör. När fodret har stelnat, förvara rören i kylskåp vid 4 °C, om det inte ska användas omedelbart.
2. Förvärv av axenägg
- Uppfödningssystem för D. antiqua
- Placera en uppfödningsbur i en 25 °C invändigt belyst kuvös (24 timmar per cykel, förhållandet mellan ljus och mörker är 16:8) för att föda upp vuxna hanar och honor, så att de kan para sig och lägga ägg. Fyll vattendispensern (Figur 1B) med vatten och försegla den med fuktad bomullsull för att ge vatten till de vuxna.
- Placera fyra 35 mm x 12 mm petriskålbottnar i ett 94 mm x 16 mm petriskålslock. Blöt bomullen med joniserat vatten och lägg sedan fuktig bomull på två av petriskålens bottnar, och tillsätt en matsked sackaros ovanpå bomullen.
- Fyll de andra två petriskålbottnarna med två matskedar sackaros och jästextrakt (se materialtabellen), som fungerar som föda för de vuxna insekterna (Figur 1C).
OBS: Sackaros- och jästextraktet som nämns i steg 2.1.2 och steg 2.1.3 behöver inte steriliseras. - Lägg en 94 mm x 16 mm petriskålbotten som innehåller fuktad sand och en bit orotad, skalad vitlöksklyfta (Figur 1D) inuti flugburen för att samla upp ägg. Honan lockas av lukten av vitlök och lägger ägg runt den.
- Insamling av ägg
- Ta ut äggläggningsanordningen, som är en 94 mm x 16 mm petriskål som innehåller sand och vitlök som nämns ovan (steg 2.14), från buren. Häll sanden tillsammans med vitlöken i en 500 ml bägare och använd kranvatten för att spola ner resten av äggen från vitlöken i bägaren. Vid det här laget flyter äggen i vattnet.
- Ta en sil med 100 mesh (se materialförteckning) och fukta den med kranvatten. Häll sedan vattnet med de flytande äggen från bägaren på silen. Äggen kommer att ligga kvar på silen.
- När äggen har torkat naturligt på silen, använd en borste för att försiktigt svepa äggen på en petriskål.
- Den första dagen spolar du äggläggaren för att samla in äggen utan desinfektion eller sterilisering. Den andra dagen klockan fyra på eftermiddagen spolar du äggen igen och samlar in dem genom att sikta dem med rent vatten.
OBS: Att samla in äggen den andra dagen är för att säkerställa en jämn tillväxthastighet i de efterföljande stadierna. Klockan fyra på eftermiddagen är äggläggningstoppen för D. antiqua. Därför är det idealiskt att samla in äggen vid denna tidpunkt. - Placera de insamlade äggen på en steril cellsil (se materialtabell) i den ultrarena bänken (Figur 3A).
- Förbered lösningen för äggsterilisering
- Ta 5 ml 5,2 % NaClO (se materialförteckning) och överför den till en steriliserad 250 ml E-kolv. Tillsätt 95 ml steriliserat vatten för att skapa en total volym på 100 ml, vilket resulterar i en 0,26 % NaClO-lösning.
- För att bereda en 75 % EtOH-lösning, ta 75 ml 99,7 % EtOH och överför den till en steriliserad 250 ml E-kolv. Tillsätt 25 ml steriliserat vatten för att skapa en total volym på 100 ml, vilket resulterar i en 75 % EtOH-lösning.
- Häll 30 ml NaClO i en petriskål och häll 30 ml EtOH i en annan petriskål. Placera cellsilen med ägg som nämns i steg 2.4 i skålen som innehåller NaClO. Blötlägg den i 0,26 % NaClO-lösningen i 0,5 min. Överför sedan silen till skålen som innehåller EtOH och låt den dra i 75 % EtOH-lösningen i ytterligare 0,5 minuter.
- Upprepa denna process tre gånger, alternerande mellan 0,26 % NaClO och 75 % EtOH var 0,5:e minut. Därefter kommer axeniska ägg att erhållas. Vid denna tidpunkt bör silen som innehåller äggen sänkas ner i EtOH.
OBS: För att säkerställa noggrann sterilisering, använd en 1 ml pipett för att aspirera NaClO och EtOH och dispergera äggen. Upprepa sköljningsprocessen flera gånger. Detta steg kommer att ytterligare rengöra äggens yta från kvarvarande bakterier och föroreningar, vilket säkerställer en ren och steril yta.
3. Uppfödning av axenlarver
- För att överföra de steriliserade äggen, använd en sax som har steriliserats med en alkohollampa för att klippa ändspetsen på en 1 ml pipett (Figur 3B). Se till att ändöppningen på den skurna pipetten är större än äggens diameter (ca 2 mm). Använd sedan pipetten för att överföra äggen från EtOH-lösningen (ägg tillsammans med lösningen) (Figur 3C) till ett centrifugrör som innehåller det sterila fodret, och varje rör ska innehålla cirka 20-50 ägg (Figur 3D). Upprepa denna process tills alla ägg har överförts.
OBS: Diametern på pipettspetsen bör vara så stor som möjligt för att undvika att äggen går sönder under överföringen, vilket kan leda till att de dör. - Använd en pipett för att ta bort överflödig etanol från röret. Placera centrifugröret stängt med lock inuti en självförslutande påse och placera en bit bomull vid påsens öppning för att möjliggöra luftcirkulation. Placera slutligen påsen i en 25 °C inkubator (relativ luftfuktighet: 50%-70%; fotoperiod: 16 timmar ljus: 8 timmar mörkt) för observation och odling.
- Ungefär tre dagar senare börjar axenäggen i dieten att kläckas (Figur 4A). De kläckta larverna kommer att vara aktiva och ytan på den sterila kosten kommer inte längre att vara slät. Larverna kommer att börja livnära sig på dieten.
- Fortsätt att observera larverna tills de når stadiet 2:a stjärnlarver. Fortsätt att övervaka deras tillväxt och utveckling under denna period.
- Efter 9-12 dagar har mer än 80 % av äggen utvecklats till 3:e stjärnlarver (Figur 4B). Detta tyder på framgångsrik tillväxt och utveckling av larverna.
4. Validering av axenlarver med odlingsberoende analyser
- Välj slumpmässigt ut tre axeniska 3:e stjärnlarver från centrifugröret.
- Lägg larverna i en petriskål med måtten 94 x 16 mm som innehåller 75 % alkohol för rengöring. Överför dem sedan till en behållare med sterilt vatten för ytterligare sköljning.
- Använd en desinficerad dissekerande pincett som har steriliserats med 75 % EtOH-lösning för att ta tag i larverna (huvudet och svansen visas i figur 5A). Använd dissekeringssax för att ta bort huvudet och bakändarna (Figur 5B). Håll i svansen på larverna med pincetten och använd en annan pincett för att försiktigt klämma från svansen till huvudet och dra ut de inre organen (resultatet visas i figur 5C). Placera de inre organen i avjoniserat vatten och dra försiktigt av tarmen genom att trycka på fettvävnaden med en pincett och placera det extraherade inre (Figur 5D) i sterilt vatten för vidare användning.
- Placera tarmen i ett sterilt 1,5 ml centrifugrör, tillsätt 500 μL steriliserad 1x PBS-buffert och använd en engångsstöt för att mala tarmvävnaden till ett homogenat.
- Ta 100 μl av homogenatet och tillsätt det till ett näringsagarmedium. Använd en L-formad spridare (se materialförteckning) för att stryka agarplattan.
- Placera petriskålen i en biokemisk inkubator vid 28 °C och inkubera i 72 timmar för att observera koloniernas tillväxt.
5. Validering av axenlarver med odlingsoberoende analyser
- Extrahera totalt DNA från tarmvävnaden hos axenlarver med hjälp av ett DNA-extraktionskit (se materialförteckning) enligt tillverkarens instruktioner.
- Mät DNA-koncentrationen med en UV-spektrofotometer.
- Utför PCR-reaktion med universella bakteriella 16S rRNA-primrar (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Den totala reaktionsvolymen är 25 μL, och den består av 1 μL DNA-mall, 0,5 μL främre primer, 0,5 μL omvänd primer, 10,5 μL ddH2O och 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix (se materialtabell). Ställ in PCR-reaktionsbetingelserna enligt följande: initial denaturering vid 94 °C i 3 minuter; 35 cykler av denaturering vid 94 °C i 30 s, glödgning vid 55 °C i 30 s och förlängning vid 72 °C i 90 s. slutlig förlängning vid 72 °C i 10 min. Förvara PCR-produkterna vid 4 °C för vidare analys.
- Utför PCR-reaktion med hjälp av universella svamp-ITS-primers (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'). Den totala reaktionsvolymen är 25 μL, och den består av 1 μL DNA-mall, 0,5 μL främre primer, 0,5 μL omvänd primer, 10,5 μL ddH2O och 12,5 μL 2x Taq PCR Master Mix. Ställ in PCR-förhållandena på 95 °C i 5 minuter. 35 cykler med 95 °C i 30 s, 55 °C i 1 min och 72 °C i 90 s. följt av 72 °C i 10 min. Förvara PCR-produkterna vid 4 °C för vidare analys.
- Använd Super Green nukleinsyrafärgämne (se materialförteckning) för att blanda med var och en av de två typerna av PCR-produkter jämnt och analysera dem genom elektrofores på en 1% agarosgel i 1x TAE-buffert (utspädd från 50x TAE, se materialtabell). Använd 3 μL DNA-markör (se materialtabell) som referens.
- Använd en UV-transilluminator för att observera gelen och lokalisera målfragmentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Livsstadierna för D. antiqua visas i figur 4. Hela livscykeln omfattar ägg, larver, puppor (Figur 4C) och vuxna (Figur 4D). De odlas i sterila centrifugrör, och deras utseende och överlevnadsgrad skiljer sig inte från D. antiqua som odlas under icke-axeniska förhållanden. Tillväxt- och utvecklingstiderna för varje stadium av D. antiqua finns i figur 6. Äggstadiet för icke-axeniskt uppfödd D. antiqua är 2,83 ± 0,29 dagar, och för axeniskt uppfödd D. antiqua är 2,83 ± 0,29 dagar, utan någon signifikant skillnad mellan de två (Independent t-test, t = 0,00, p = 1,00). Det normala larvstadiet varar i 13,83 ± 0,76 dagar, medan det axeniska larvstadiet varar i 14,50 ± 0,50 dagar, utan någon signifikant skillnad mellan de två (oberoende t-test, t = 1,27, p = 0,27). Puppstadiet för normalt uppfödda D. antiqua är 17,33 ± 0,76 dagar, och för axeniskt uppfödda D. antiqua är 18,00 ± 0,50 dagar, utan någon signifikant skillnad mellan de två (Independent t-test, t = 1,27, p = 0,27). Överlevnadstiden för vuxna är 81,50 ± 1,00 dagar för normal uppfödning och 80,33 ± 0,76 dagar för axenuppfödning, utan någon signifikant skillnad mellan de två (oberoende t-test, t = 1,61, p = 0,18). Det kan observeras att det inte finns någon signifikant skillnad i utvecklingstid mellan axenic D. antiqua och de som föds upp under normala förhållanden.
Odlingsberoende analyser visade att inga kolonier påvisades i larvens tarmar (Figur 7). Dessutom avslöjade PCR-analys baserad på bakteriellt 16S rRNA närvaron av ett band vid cirka 1500 bp (Figur 8A), identifierat som Wolbachia (GenBank-anslutningsnumret för denna nukleotidsekvens är: OR564190), en endosymbiotisk bakterie. Inga band observerades dock i PCR-analysen som var inriktad på ITS-regioner med svampar (figur 8B). Detta tyder på att larverna har uppnått axeniskt tillstånd. Axenlarver är av stor betydelse för att studera mekanismerna för interaktion mellan D. antiqua och mikroorganismer, samt för att förebygga och kontrollera de skador som orsakas av D. antiqua.
Figur 1: Uppfödningsanordningar och foder för D. antiqua. (A) Den vita delen av salladslöken för larver. (B) Vattenautomat för vuxna. C) Livsmedel för vuxna. D) Uppsamlingsanordning för äggen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beståndsdelar i dietberedning. (A) Mald salladslök. B) Salladslök. C) Jästa rester och filtrat av salladslök. (D) Färdiglagad kost. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Processen för äggöverföring. (A) Ägg i cellsikten. (B) 1 ml pipett utan ändspets. C) 1 ml pipett med ägg. D) Ägg som överförts till foder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Livsstadier hos axenic D. antiqua. (A) Ägg. b) Larver. (C) Puppa. D) Vuxna kvinnor och hanar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Processen att dissekera larvtarmar. A) Larvens huvud och svans. B) Larven med huvud och svans borttagna. C) Separerade tarm- och kroppsvävnader. (D) En intakt tarm efter dissektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Utvecklingstid för varje tillväxtstadium hos D. antiqua som föds upp normalt och axeniskt. Ingen signifikant skillnad i utvecklingstid mellan axenuppfödd och normalt uppfödd D. antiqua. Oberoende t-test, p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bekräftelse av steriliteten hos D. antiqua genom slumpmässigt urval av tre larver och inkubering av tarmhomogenat på TSA- och PDA-agarplattor. Inga bakterier observerades hos larver som utfodrades med steril föda. (A) Axenlarver på TSA. (B) Normala larver på TSA. (C) Axenlarver på PDA. (D) Normala larver på PDA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Bekräftelse av steriliteten hos D. antiqua genom PCR-analys med användning av universella 16S rRNA-primrar och svamp-ITS-primrar. Målbandet för 16S rRNA-genen är ~1 500 bp. Ett band på cirka 1500 bp observerades och identifierades som den endosymbiotiska bakterien Wolbachia. Målbandet för ITS-genen är 500-750 bp. Inget målband observerades i AF-grupperna. (A) 16S rRNA-elektroferogram. B) ITS-elektroferogram. Förkortningar: M = markör; NC = negativ kontroll; NF = normal utfodring; AF = axenmatning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insekter har en mycket komplex tarmmikrobiota20,21, vilket gör det nödvändigt att använda axeninsekter som inokulerats med specifika tarmmikrobiella stammar för att studera interaktioner mellan insekter och mikroorganismer. Beredningen av axeninsekter är avgörande för sådana forskningsinsatser. Antibiotikabehandling är en metod som används för att eliminera tarmmikrobiota. Till exempel matade Jung och Kim22 Spodoptera exigua med penicillin, medan Raymond23 matade P. xylostella med en konstgjord diet som innehöll rifampicin för att rensa tarmbakterierna. Antibiotikabehandling kan dock inte helt eliminera tarmbakterier och har många biverkningar på värdinsekter. Dessa inkluderar förändringar i metabolisk enzymaktivitet, försämrad tarmfunktion, hämning av tillväxt, utveckling och reproduktion, samt ökad dödlighet 23,24,25. Följaktligen kan funktionaliteten hos insektens tarmmikrobiota maskeras efter antibiotikabehandling. Lyckligtvis kan detta problem övervinnas genom att kemiskt desinficera äggens yta, vilket möjliggör produktion av axeniska insekter relativt enkelt16. Jämförelsevis är kombinationen av ytdesinfektion av äggen följt av utfodring med sterilt foder mer effektiv och genomförbar än antibiotikabehandling26,27.
Att få axenic D. antiqua är främst beroende av att använda axeniska ägg och steril kost. Jämfört med andra insektsarter är äggen av D. antiqua relativt små. Tidigare använda desinfektionsmetoder, såsom att kortvarigt blötlägga äggen i 0,1 % natriumdodecylbensensulfonat följt av en 5 minuters behandling med en 2 % väteperoxidlösning för att erhålla axeniska kackerlacksägg28, eller att använda en 10 % natriumhypokloritlösning i 10 minuter för att ytdesinficera ägg av den röda palmviveln29, är inte lämpliga för desinficering av D. antiqua ägg. Det finns tidigare studier om desinfektion av ägg av Diptera-arter, såsom användning av väteperoxidlösningar som används som handdesinfektionsmedel och väteperoxid som ytdesinfektionsmedel för att sterilisera ägg av Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. Därför blir det nödvändigt att optimera valet av desinfektionsmedel och desinfektionstid. Efter experiment har det visat sig att man med hjälp av 0,26 % NaClO och 75 % EtOH, desinficerar äggen i 0,5 minuter och upprepar processen tre gånger för att uppnå sterilisering av D. antiqua-ägg .
Efter att ha fått axenägg är en annan viktig aspekt av uppfödningen av axenic D. antiqua att ge dem steril föda för larverna in vitro. Även om konstgjorda dieter inte helt kan replikera naturlig mat, har studier 31,32,33 visat att det är möjligt att föda upp insekter med hjälp av konstgjorda dieter. Näringsinnehållet i konstgjord kost kan påverka insekternas immunförsvar och anpassningsförmåga34. Därför är det viktigt att artificiellt framställda dieter innehåller liknande näringskomponenter som naturlig mat. Detta kommer att bidra till att säkerställa att de uppfödda insekterna får de nödvändiga näringsämnena för sin utveckling, sitt immunförsvar och sin allmänna hälsa. I denna studie fungerar salladslök som den primära komponenten i steril kost för D. antiqua. Halvfermenterade dieter ger bättre näringsämnen för D. antiqua, vilket bidrar till deras tillväxt och utveckling. Att blanda larvhomogenatet med foderstaten syftar dessutom till att underlätta försmältningen av foderstaten av tarmmikrobiotan utanför kroppen. Detta beror på att tarmbakterier har en effekt på insekternas föda och matsmältning35. Att använda denna metod för att förbereda sterila dieter för D. antiqua förenklar processen och förbättrar avsevärt effektiviteten i kostberedningen.
Bakteriella symbionter som överförs moderligt inom celler finns i stor utsträckning hos insekter36. Wolbachia, en intracellulär bakterie som överförs moderligt, finns hos många insekter37. Wolbachia är mest känd för sin roll i reproduktiv manipulation, eftersom den kan påverka könsfördelningen hos värdens avkomma till att producera fler infekterade honor38. Efter att ha verifierat det axeniska tillståndet hos D. antiqua-larver fann man att larverna i huvudsak var axeniska efter desinfektion, med undantag för den endosymbiotiska bakterien Wolbachia, som finns i cytoplasman hos äggstocksvävnadsceller i D. antiqua och överförs vertikalt över generationer genom äggcellernas cytoplasma. När det gäller metoden för att eliminera Wolbachia är antibiotikabehandling ett vanligt tillvägagångssätt. Sammanfattningsvis presenteras i denna artikel en metod för uppfödning av axenic D. antiqua. Enligt protokollet kan axenic D. antiqua framgångsrikt odlas. Dessutom kännetecknas denna metod av sin enkelhet och låga kostnad, vilket ger ett nytt tillvägagångssätt för att föda upp andra axeninsekter och ökar möjligheten att studera interaktionerna mellan insekter och tarmmikrobiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (32272530), New Twenty Policies for University in Jinan Project (2021GXRC040), Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong-provinsen (2021TZXD002) och Science and Education Integration Project vid Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
