Summary
我们提出了一种使用哈韦尔研究综合体中的结晶设施进行蛋白质结晶的方案，以及随后在 Diamond 的多功能大分子晶体原位 （VMXi） 光束线中从板内晶体中收集的原位 X 射线晶体学数据。我们描述了样品要求、结晶方案和数据收集指南。
Abstract
描述了使用Harwell的结晶设施进行机器人蛋白质结晶的方案，以及从金刚石光源光束线VMXi的结晶板 中原位 室温数据收集的方案。这种方法能够以直接的方式从多个晶体中确定高质量的室温晶体结构，并对结晶试验的结果提供非常快速的反馈，并实现连续晶体学。室温结构在理解蛋白质结构、配体结合和动力学方面的价值在结构生物学界越来越得到认可。来自世界各地的用户可以通过多种可用的访问模式访问此管道。设置的结晶实验可以进行成像和远程查看，并使用机器学习工具自动识别晶体。数据在基于队列的系统中进行测量，该系统具有来自孔板中用户选择的晶体的多达 60° 旋转数据集。来自特定孔或样品组中所有晶体的数据使用 xia2.multiplex 自动合并，输出可通过 Web 浏览器界面直接访问。
Introduction
X射线晶体学仍然是了解蛋白质结构和功能的关键工具，可提供蛋白质或其复合物的高分辨率结构，例如底物或候选药物。然而，在许多情况下，获得具有理想特性的晶体 - 高度衍射，适合浸泡的晶体形式，并且没有晶体病理，如孪晶 - 仍然是一个相当大的瓶颈1。由于通常无法预测生产蛋白质晶体的合适化学条件，因此探索数千种潜在化学混合物的结晶筛选是标准的，通常由自动化/机器人辅助设置屏幕和晶体酒店，以监测，通常是远程，记录的结晶液滴图像。
当晶体出现时，通常必须使用尼龙或卡普顿环从结晶环境中收集晶体，然后转移到含有冷冻保护剂的液滴中（搜索是一个额外的变量），然后再冷冻到液氮中。结晶和 X 射线数据收集之间的这些额外步骤可能涉及当其密封环境破裂时结晶液滴的脱水、处理晶体时晶体上的机械应力以及冷冻保护剂对晶格的损坏（通常导致镶嵌扩散增加）等因素2.此外，晶体采集是时间和劳动密集型的，并可能导致样品之间的不均匀性，尤其是在采集过程中液滴上形成皮肤时。VMXi 光束线可以从粘附在板上的晶体访问可用数据，否则这些数据将被丢弃以进行数据收集。
绝大多数 X 射线晶体结构都是使用上述方法在 100K 下确定的，从而实现了直接的晶体传输和处理，并将 X 射线束中的晶体寿命提高了几个数量级。然而，人们越来越关注在非低温条件下确定结构，即更接近与蛋白质功能相关的生理条件2,3,4。这样可以更好地理解蛋白质的动态结构，避免氨基酸构象或环在功能不相关的状态下被冻结5，并使配体结合能够在更接近细胞和生物体内蛋白质自然环境中的条件下进行探索6。
在英国金刚石光源同步加速器的多功能大分子晶体原位 （VMXi） 光束线上实施的另一种方法是，在环境条件下，在没有干扰的情况下，直接从晶体生长的环境（即结晶板内）测量晶体的衍射数据 7,8.这样可以非常快速地从结晶筛选和优化中获得反馈，以指导用户获得满足其要求的最佳晶体形式。它还能够以自动化方式生产高质量的室温结构9.
该协议假设用户具有准备结晶的高纯度蛋白质样品。我们描述了访问Harwell结晶设施以生产蛋白质晶体，然后使用光束线VMXi进行数据收集的用户体验（图1）。
哈韦尔的结晶设施
Harwell （CF） 的结晶设施位于 Harwell 研究综合体 （RCaH），毗邻金刚石光源。该设施为用户提供了一个用于大分子结晶的高通量自动化实验室，使用机器人技术进行结晶筛选、晶体优化、晶体成像和表征。通过与高度自动化的VMXi光束线紧密集成，确定室温结构的速度大大加快，并能够在非低温条件下表征新型蛋白质结构、蛋白质-配体和DNA-配体复合物，以及自动片段筛选（图1）。
CF管道是一套仪器，包括用于可溶性和膜蛋白结晶的纳升结晶机器人9 ，用于制备商业结晶筛和复杂定制优化筛的液体处理机器人，以及四台成像仪器（一台在4°C，三台在20°C下用于结晶板的成像（参见 材料表).一台成像仪能够对脂质立方相 （LCP） 玻璃板进行成像，一台成像仪配备多荧光光学元件（均在 20 °C 下）。
该设施现在被广泛的学术和工业用户广泛使用，包括膜蛋白实验室（MPL;https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html）、XChem 片段筛选设施 10、MX 光束线、XFEL 集线器以及罗莎琳德富兰克林研究所 （RFI）。这种成熟和优化的管道使结晶实验能够在广泛的结构生物学项目中进行。本文描述了用于 VMXi 数据收集的晶体管道，尽管晶体也可以被收集和冷冻冷却或定向到 XChem 管道。
用户访问通过钻石MX提案系统（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html）分配，工业用户通过钻石行业联络小组获得支持。所有用户都可以带着他们的样品或板来到现场，这些样品或板可以手工运输。不建议通过快递发送板，因为我们的经验表明，液滴可能会从分配位置移开，或者液滴可能会被结晶储液器损坏。或者，通过安排，用户可以将他们的蛋白质样品送到CF，在那里工作人员代表他们进行结晶实验。对于CF而言，用户可以通过登录Rock Maker Web或通过ISPyB（对于VMXi）来远程监控实验。CF的访问可以基于Diamond收集的X射线衍射结果以迭代方式进行。
金刚石光源的光束线VMXi
光束线VMXi（以下简称“光束线”）是一种独特的、最近开发的仪器，完全致力于室温、高度自动化的X射线晶体学，重点是测量合适结晶板内晶体的数据。光束线提供微焦点 （10 x 10 μm）、粉红色光束（带通 <5 × 10-2ΔE/E），高通量为 ~2 × 1013 个光子/秒（16 KeV）7。这种高通量光束与快速检测器相结合，可实现非常高的样品通量，并可从尺寸超过 10 μm 的样品中收集数据。
结晶板通过存储在样品存储系统中进入光束线，并根据用户提供的时间表进行成像，同时使用 ISPyB11 接口 SynchWeb12 对板进行配准。通常，建议用户选择斐波那契数列的时间点进行成像（0、12、24、36、60...从进入系统的板起 7,320 小时）。一旦对板进行成像，用户就会收到电子邮件通知。可见光和紫外光成像均可按需提供给用户。通过机器学习算法分析样品存储系统拍摄的图像;这会自动定位和定义类似于晶体的对象的兴趣点，并注册兴趣点，以便用户将其添加到队列中以进行数据收集。用户也可以手动单击可见光图像以注册兴趣点，也可以单击并拖动要通过光栅扫描进行分析的区域。用户可以将这些点与自动定位的点一起添加到队列中。
一旦所有样品都具有用于数据收集的适当参数，板就会进入队列。当板到达队列的顶部时，它会自动分配到光束线。结晶板由机械臂自动从晶体酒店加载到光束线中，在图像匹配之后，根据用户定义的说明从每个选定的晶体测量高达60°旋转的晶体学数据集。板内的所有液滴都可用于光束线上的这些实验。数据从多个晶体合并，以自动方式生成同构的、最佳合并的数据集 7,9。收集所有排队的数据集后，用户将收到一封电子邮件，其中包含一个链接，可以查看 ISPyB11 中的数据集，就像在其他 Diamond MX 光束线中一样。用户也会被定向到光束线网页 （https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html）。
Protocol
1. 使用哈韦尔的结晶设施在 原位 板内生产晶体
注意：许多不同的途径都支持对 CF 的访问，具体取决于项目的应用和用户类型（学术或行业）。XChem 和 MPL 项目通过用户管理系统 （UAS） 拥有自己的提案申请系统，可以通过标准访问途径（包括 iNEXT Discovery 和 EUbOPEN）或 BAG Access 提交。以下协议特定于 VMXi 用户。
- 提案提交和访问准备
- 向 BAG 提案申请提供有关项目的信息，或将其添加到活动的 BAG 提案中。通常有一个 BAG 协调员，负责组织文书工作。或者，提交快速访问建议以访问光束线。
- 确保样品在通过快递或亲自到达现场之前已在 UAS 中注册并进行了安全验证。
- 确保用户已注册（使用 FedID 和密码）。
- 确保 BAG 协调员已将用户作为 UAS 中的关联添加到 MX 提案中。
- 填写光束线结晶样品详细信息表，并将表格发送给 VMXi@diamond.ac.uk。
- 与光束线工作人员就实验要求和光束线可用性进行沟通。
- 如果运送蛋白质样品，请仅通过事先安排发送样品。有关详细信息，请参阅第 1.2 节。
- 如果用户要到现场在 CF 中设置结晶板，请与设施工作人员联系是否有时间段来使用设施仪器，并遵循第 1.2.1 节。
- 如果用户将板带到现场，请确保将样品分配到正确的板类型中，并将结晶液滴放置在正确的位置和正确的数量。按照第 1.2.2 节操作。光束线仅 接受特定的原 位结晶板（Greiner CrystalQuickX 和 MiTeGen In Situ-1）;确保滴剂不大于 200 nL。
- 在CF中进行的结晶实验
注：该设施提供了多种高通量大分子结晶方法，例如蒸汽扩散以及油和LCP下的批量结晶。建议从70-100μL纯蛋白质开始，使用100nL蛋白质溶液和100nL结晶储液的比例进行三次筛选，并在20°C下孵育板，对可溶性蛋白质进行蒸汽扩散实验。 该设施内有许多商业屏幕。湿度和温度控制可用，最常用的是 4 °C 和 20 °C。访问CF的用户将接受标准化培训，并支持操作结晶仪器，并将使用本文所述的设置。- 运送样品以在 CF 设置
注意：在到达现场之前，蛋白质样品必须已根据 UAS 系统内的提案进行验证。一旦蛋白质样品到达现场，工作人员将按照之前与用户沟通中的指示进行结晶实验。确认将通过电子邮件发送，其中包含实验结晶板的条形码信息。用户将被要求将结晶板作为容器添加到相关提案中。完成此操作后，板可以存储在结晶设施或光束线的自动成像仪中。ISPyB 将是用于光束线交互的接口。- 提供浓度为 25 μL 等分试样的倍数结晶的蛋白质样品溶液。清楚地标记含有蛋白质样品的样品管。
- 如果需要，提供蛋白质缓冲溶液、配体溶液或储液库溶液。
- 告知设施工作人员应使用哪些筛网和掉落率。
- 结晶板设置
注意：我们要求 Greiner CrystalQuickX 和 MiTeGen 原位 1 板中的结晶液滴位于特定位置;在其他地方设置的盘子应使用此处描述的以下 Mosquito13 设置。- 要调整 MiTeGen In Situ-1 的孔板定义，请打开 Mosquito SPT 软件，然后单击标准 MiTeGen In Situ-1 孔板定义页面，单击设置 | 96孔 |MiTeGen原位-1（96×2滴）（图2A）。单击编辑按钮并修改子孔 2 位置的值：X 偏移量为 - 1.2，Y 偏移量为 1.8，子孔 3 位置的值：X 偏移量为 1.3，Y 偏移量为 1.8（图 2B，C）。
- 要调整 Greiner CrystalQuickX 的孔板定义，请打开 Mosquito SPT 软件，然后单击设置 | 96孔 |Greiner CrystalQuickX（图2D）。单击编辑按钮并修改子孔 1 位置的值：X 偏移量为 - 1.95，Y 偏移量为 1.45，子孔 2 位置的值：X 偏移量为 1.95，Y 偏移量为 1.45（图 2E，F）。
- 运送样品以在 CF 设置
2. 使用金刚石光源的光束线
注意： 用户与光束线的所有交互均使用 ISPyB11 接口远程进行。不需要在光束线上实际存在，并且使用基于队列的系统收集数据，而不是在特定时间安排数据。用户将获得与其钻石光源访问权限关联的提案。在光束线上，每个结晶板都被分配了一个唯一的访问，并被定义为ISPyB11 中的一个“容器”，类似于一个包含100 K样品的冰球。 优化屏幕不能使用SynchWeb界面创建，因此，信息通常被添加到注释部分（参见步骤2.1.4）。注册车牌的个人需要检查电子邮件地址，因为车牌所有者将收到有关成像的电子邮件以及车牌完成的通知。
- 套准车牌
- 使用适当的 Diamond FedID 登录 ISPyB，然后选择提案。通过在搜索栏中滚动或键入提案编号来搜索感兴趣的提案。从建议编号（图 3A）下的下拉菜单中选择“装运”，这将打开“装运”窗口，其中包含该建议中的货件。单击右上角的“+添加货件”（图 3B）以打开“添加新货件”窗口，为货件指定名称，单击“自动/成像器”，然后单击左下角的“添加货件”按钮（图 3C）。
- 在装运窗口（图3D）中，单击 “+添加集装箱”，然后将显示 “添加集装箱 ”页面视图（图3E）。在 容器类型 下拉菜单中选择任何一种相关的板类型。页面将更改以反映所选的容器类型。根据特定于实验板的光束线工作人员的电子邮件说明输入 条形码 和 容器名称 。请注意，它区分大小写。
- 从“请求的成像器”下拉菜单中选择VMXi 20°C成像仪，从“成像计划”下拉菜单中选择斐波那契成像计划，从“结晶屏幕”下拉菜单中选择结晶屏幕，从“所有者”下拉菜单中选择用户名，单击“查看”按钮，然后在“电子邮件”框中输入正确的联系人电子邮件地址（图3F）。
- 在 “注释 ”框中输入有关该板的更多详细信息。从 蛋白质 下拉菜单中选择相关样品，并在实验提案中使用在 UAS 中注册并经 Diamond 批准的首字母缩略词。在“ 样品名称” 框中输入相同的名称;将剩余的框留空。
- 单击 +Plate 图标以在整个板上复制样品，并用绿色方块填充整个容器。单击页面底部的 +Add Container 以注册板。要求光束线的工作人员将板转移到适当的成像仪，在那里它将被存储和成像。当容器存储在成像仪中时，将生成访问，用户将收到一封电子邮件，其中包含指向板及其图像的链接。
- 查看成像结果
- 导航到感兴趣的提案（步骤 2.1.1），从提案编号下方的下拉菜单中选择容器，然后观察提案的可用容器列表。如果存在其他样品架类型，请选择过滤板。若要进一步缩小搜索范围，请选中“我的容器”框，以仅显示与当前登录用户 ID 关联的最相关的容器。 通过将光标移到单个行上并单击鼠标左键来单击相应的容器。
- 选择容器后，将显示一个新视图，显示板的概览（图4A）。单击显示屏左侧板表示中的一个水滴，以显示相应水滴的最新图像。使用箭头键在掉落点之间导航，或使用鼠标/光标选择单个掉落点。
- 要查看液滴的历史图像，请单击 H 按钮并等待弹出的图像库出现在当前油滴图像上。将光标悬停在各个图像上以更新主投影图像。
- 按 0 - 9 按钮对图像进行评分以指示每次跌落的状态。要查看各个类别，请打开下拉图像左上角的 “得分 ”。在每个墨滴图像中寻找蓝色十字，这是经过训练以在图像中寻找“晶体”的算法 （CHiMP） 的结果。
- 单击投影右上角名为 “测量” 的第三个图标按钮以访问测量工具。要使用此工具，请单击并拖动 一条线，标尺将延伸并给出以 μm 为单位的距离。
- 要请求其他成像会话，请从页面底部的“操作”（Actions） 旁边的下拉框中单击“可见”（Visible） 或“UV”（UV）。然后，单击“请求板成像”按钮。
- 晶体选择/CHiMP
- 要手动添加用于数据收集的点，请按 +标记点 按钮。将光标悬停在所需的兴趣点上并选择。等待红叉出现。
注意：每次放置最多可以创建 100 个对象。 - 标记完所有点后，单击 “+完成 ”按钮。请记住，在尝试测量对象之前，还要单击 “+完成 ”按钮。要添加区域以通过网格扫描进行数据收集，请单击 +标记区域 按钮。单击 左上角的点 并向下和向右拖动以创建一个将在光束线上进行栅格扫描的区域。与点一样，在创建所有所需区域后单击 +Finish 按钮。
注意：最好创建一个更大的区域，而不是创建许多小区域。 - 观察墨滴图像上已有的蓝色十字，这是旨在自动定位晶体物体 （CHiMP） 的算法的结果。要可视化结晶液滴的 CHiMP 评估，请单击“ 显示自动分数 ”复选框，然后更改 “类”的下拉菜单。通常，这里最有用的设置是 晶体 选项（图4B）。
注意：这是一项新功能，不能保证找到所有晶体，也可能找到其他不是晶体的物体。 - 在相应的放置中标记了所有点和区域后，单击页面底部的 准备数据收集 按钮。
- 要手动添加用于数据收集的点，请按 +标记点 按钮。将光标悬停在所需的兴趣点上并选择。等待红叉出现。
- 准备用于数据收集的样本
- 观察包含上一步选择的点或区域或自动定位的样品列表（图4C）。按 + 按钮添加单个点或区域，或通过单击 “将当前页面添加到队列” 按钮添加所有显示的样本。
- 过滤器可用于仅显示 点、区域、自动点 或 手动 点。要仅显示那些尚未拍摄（即暴露于 X 射线）的样品，请单击滤镜按钮上方的“ 无数据 ”和 “未完成 ”选项。
- 通过单击相应的行选择单个样品，并更新屏幕右侧的图像以显示正确的液滴和单个点。如果列表中有许多样本，则通过选择下拉菜单来增加每页显示 的样本数 ，默认为 10 个，最多 100 个作为显示的最大样本数。
- 将所有点和区域添加到队列后，确保所有实验数据收集参数都与每个实验相关联。
- 使用 “点”、“区域”、“手动”和 “自动”的过滤器。单击 “点 ”过滤器，然后单击过滤器按钮下方的“ 全选 ”复选框，以同时将参数应用于当前 “排队样品 ”列表中可见的所有样品。
- 从屏幕右侧的下拉菜单中选择实验参数，在投影照片下方（图4D）。对于 区域，请选择 网格扫描数字万用表 10 微米步长，100% 传输选项。对于所有其他 点 实验，请根据需要从下拉菜单中选择其他选项。
- 对于振荡数据收集，请单击 Omega Scan DMM 60 度 5% 透射 率选项，以从单个样本中收集最大数量的数据。对非常小的晶体或对辐射敏感的样品应用小旋转，并根据特定晶体形式的先前经验改变透射率。正确应用所有样品的实验参数后，单击页面底部的“ 队列容器 ”按钮。
- 一旦板到达队列的顶部，它将被呈现给光束线，收集数据集，然后它将再次返回光束线内的样品存储。从板中收集数据后，查找带有链接的电子邮件以访问相关数据。
- 创建示例组
注意：可以创建样品组以对多个液滴或板中的相似样品进行分组。一旦被 DIALS 处理，这些样本组中的所有数据集都将使用 xia2.multiplex14 管道进行处理。这在收集许多非常小的数据楔形时很有用，也可能有助于增加配体结合实验的信噪比。- 从建议编号下的下拉菜单中选择“示例组管理”。查找组列表（如果组已由其他用户创建）。要生成新组，请单击“+创建样品组”按钮。从“创建样品组”页面的下拉菜单中单击装运以查看样品查看器（图5A）。单击包含填充列表中相关示例的容器。
- 单击容器后，查找显示板概览的图形。
- 通过单击单个放置来单独单击放置（图5B），或通过单击相关的行字母或列号单击行或列中的放置。选择与单个组关联的所有孔后，在 “样品组名称 ”框中输入该组的名称，然后单击 “保存样品组 ”按钮。单击此页面上的 “查看样品组” 按钮，返回到与提案关联的已生成样品组的列表（图 5C）。
- 编辑示例组
- 单击 “示例组管理”（Sample Group Management ） 页面上组列表中的示例组。
- 单击组信息下方显示的容器旁边的 +Edit Sample Group 按钮（图 5C）。
- 观察已与样品组关联的液滴，在板概览上突出显示。
- 像以前一样，通过单击液滴、孔或色谱柱，向样品组添加更多液滴。
注意：不能从样品组中去除液滴。 - 添加其他液滴后，编辑“ 样品组名称 ”，然后保存它，或者只需单击“ 保存样品组 ”按钮即可保存。
- 可视化和分析样本组的输出
- 单击样品组列表中的单个组，以显示与该组关联的一个或多个容器的板概览。该组中包含的液滴将在此显示屏上突出显示（图5D）。
- 如果在此组中收集了数据，请查找包含按时间顺序排列的最后三个多路复用作业的列表。
- 单击多路复用运行的行以更新下面的处理结果。
- 观察 快速链接 按钮，该按钮显示与组关联的数据集数。单击此按钮可打开一个新的 “数据集合” 页面，其中显示各个数据集集合。
3. 访问自动数据处理
注意：收集数据后，它们将通过多个自动数据处理管道传递。Diamond MX 光束线上使用的四条标准管道也基于光束线收集的数据运行。它们是“fast_dp”、“xia2 dials”、“xia2 3dii”和“autoPROC”15。“fast_dp”将提供快速的数据缩减，以快速评估质量。其他三个管道将需要更多的计算时间，并运行各种不同的数据缩减软件包进行比较。因此，输出的质量通常高于“fast_dp”输出。在光束线上收集的数据集还将通过自动多晶合并软件“xia2.multiplex”14运行，该软件将合并定义组内的所有数据集。请注意，虽然网格扫描当前不会自动处理，但可以使用“xia2.ssx”管道手动处理数据。可以使用以下协议在 ISPyB11 中找到自动处理管道的结果。
- 查找数据集
- 如上所述登录 ISPyB，然后选择 “提案”。
- 通过在搜索栏中滚动或输入提案编号来搜索 感兴趣的提案 。
- 从屏幕上显示的列表中单击 所需的访问 ，以访问该访问的 “数据收集 ”窗口。
- 应用任何所需的过滤器。
注意：一种流行的筛选器是“自动集成”筛选器，它仅显示已通过一个或多个处理管道成功运行的数据集。这将排除网格扫描，因为这些扫描目前不是通过 ISPyB 自动处理的。 - 向下滚动页面以查找感兴趣的数据集。
注：每个数据集将显示样品ID、使用的实验参数、衍射图像查看器、晶体图像查看器和每图像分析图，以便快速观察数据质量。
- 访问自动处理结果
- 单击特定实验数据摘要下方的 “自动处理 ”选项卡，以检查自动数据缩减的结果（图6A）。
- 单击与不同管道对应的不同选项卡，查看每个输出的详细摘要。
注意：如果已定义样品组，则将有两个选项卡对应于多路复用作业。一个将对应于该点之前组中所有数据集的合并，而另一个将对应于仅该放置内数据集的合并。 - 单击“日志和文件”按钮以下载生成的 .mtz 文件（如果处理成功）以及任何关联的日志文件。单击“自动处理”部分下方的“下游处理”选项卡，查看 DIMPLE 的输出。
注意：仅当在示例提交期间提供了 PDB 文件时，DIMPLE 才会运行。 - 单击 “日志和文件 ”按钮，从DIMPLE下载任何结果输出。
- 要访问组多重结果，请打开屏幕顶部的下拉菜单，上面写有提案编号，然后单击样品组管理。单击与正确容器中所需组相对应的行。向下滚动以找到与该组对应的多路复用输出列表，如板图所示。
- 从给定的列表中单击 所需的多路复用输出 。单击 xxx 数据集 按钮，其中 xxx 是合并数据集的数量（图 6B）。
注意：这将打开 “数据收集 ”屏幕，但仅显示所选多路复用作业中的数据集。 - 单击顶部实验的“ 自动处理 ”选项卡。
- 单击与正确数量的合并数据集相对应的 “多路复用处理 ”选项卡。
- 单击 “日志和文件 ”按钮以下载 .mtz 和相应的日志文件（如步骤 3.2.3 所示）。
- 从给定的列表中单击 所需的多路复用输出 。单击 xxx 数据集 按钮，其中 xxx 是合并数据集的数量（图 6B）。
- 访问网格扫描结果
- 导航到所需访问的 “数据收集 ”屏幕。网格扫描数据结果将与收集的任何旋转数据一起显示。
注意：不会有自动处理结果。 - 晶滴的图像将使网格与表示衍射存在的热图重叠。单击 正方形 可查看网格中该位置的衍射图像。单击 晶体井图像顶部的 下拉菜单以更改热图所表示的内容。默认值为总衍射 强度 ，但可以更改为 总光斑、估计分辨率或 无冰帧。
- 导航到所需访问的 “数据收集 ”屏幕。网格扫描数据结果将与收集的任何旋转数据一起显示。
4. 数据再处理
注意：可以通过 ISPyB11 接口使用相同的处理管道对选定的数据集进行重新处理，这些管道使用用户定义的更改设置自动运行。可以应用分辨率截止;如果晶体的对称性/单元是已知的，那么也可以定义这一点，以确保处理管道在正确的设置下运行。还可以使用可用的多晶管道合并特定数据集中的选定图像范围。如果系统辐射损伤导致衍射图像的后半部分质量较差，这可能被证明是有利的。用户还可以选择使用上述协议下载他们的数据集并在本地运行他们想要的再处理软件，其教程可在其他地方免费获得 （https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ）。
- 重新处理多个单独的数据集
- 登录 ISPyB 并导航到感兴趣的数据集（步骤 3.1）。
- 单击数据集并单击数据集标题栏中的齿轮图标（图 6）以打开重新处理窗口。
- 配置任何所需的设置，并选择将包含在重新处理中的帧。
注：可以通过在标记框中键入范围或通过单击并拖动每图像分析图中的所需区域来定义图像范围（图7A）。 - 可选：要添加另一个数据集以进行单个再处理，请单击其 齿轮 图标，它将显示在第一个数据集下方的再处理窗口中。勾选 单独处理 框。
- 单击 “集成” 按钮。
- 重新处理多晶数据
- 从任何数据集打开重新处理窗口。
- 单击 “多晶” 按钮以打开一个新屏幕。
- 向下滚动以查找访问期间实验中的一系列每图像分析图。
- 从下拉菜单中选择 处理管道 。
- 可选：定义任何 分辨率限制 或 已知的晶胞参数。
- 单击并拖动以定义要包含在多晶再处理中的图像范围（图 7）。
注意：这应该在多个不同的图上完成，以便合并来自多个不同晶体的数据集。 - 单击 “集成 ”按钮（图7B）。
- 访问重新处理的数据
- 导航到特定访问的 “数据收集 ”页面（步骤 3.1.1-3.1.3）。
- 单击屏幕顶部的 “重新处理 ”按钮。
- 向下滚动以找到 所需的作业。
- 单击右列中的 文件路径 ，打开重新处理的数据的 “数据收集 ”屏幕。
- 打开 “自动处理 ”选项卡并按前面所述下载数据（步骤 3.2）。
注意：任何重新处理的作业都可以通过管道名称旁边的 圆形箭头 符号来识别。
Representative Results
结晶设施和 VMXi 光束线已用于各种项目类型和用例。以下是一些示例来说明用户可能希望追求的内容。
案例研究 1： 标准数据收集
光束线能够从结晶板内的少量晶体中快速确定室温晶体结构。晶体的最小数量取决于空间群和晶体取向，但通常为1-4个，尽管可以通过合并来自几十个晶体的数据来提高数据质量。最近的一个例子是光束线标准之一，thaumatin。如 图8A所示，多个晶体被标记为手动收集数据，如协议第2.3节所述。如协议第2.4节所述，将这些晶体添加到队列中，并从下拉列表中选择实验参数。一旦应用了实验参数，板就会排队等待数据收集。数据集使用 xia2.multiplex 管道收集、自动缩放和合并，如协议第 3 节所述。SynchWeb 的输出示例如 图 8A 中间所示。五个合并的数据集产生了分辨率为 1.66 Å 的数据集。对于孔中大约五个晶体的标准数据收集，数据集在 2.5 分钟内收集。
案例研究 2：配体结合 – 使用 Mac1 蛋白的片段实验
使用光束线可以直接在室温下产生蛋白质-配体复合物的结构。配体可以添加到结晶板上的液滴中（手动或通过声滴注入），并在适当的孵育时间后测量数据。在此描述的示例中，将一系列片段分配到含有结晶板中蛋白质 nsp3 （Mac-1） 的 SARS-CoV-2 第一大结构域晶体的孔中。如方案步骤2.5所述，将含有相同片段的两个孔分配为一组。如方案步骤2.3和2.4所述，标记多个晶体（42）以进行数据收集，并使用标准参数（60°旋转，0.1°步长，0.00178秒曝光，5%透射率，每个晶体16 KeV）收集数据集（图8B）。来自两个井的数据集使用 xia2.dials 管道自动处理，随后，启动 xia2.multiplex 管道以自动合并其中的 22 个数据集。然后，在这些管道的输出上运行DIMPLE，并生成地图，清楚地显示了绑定片段的证据。碎片模型被内置到未占用的密度中并进一步细化（图8B 右）。使用这一系列步骤可以很容易地确定室温配体结合结构，为基于结构的药物设计过程提供宝贵的信息和反馈。对于跨多个孔的 42 个晶体的数据收集，数据集在 10 分钟内收集。
案例研究 3：具有低对称空间群和优选取向的结构解 使用c型气体结合细胞色素进行结晶实验，产生具有板状形态的多个晶体堆叠（图8C）。通过在X射线束中只有一个晶体的堆栈边缘选择几个位置，通过合并来自四个晶体的楔块，可以获得分辨率为1.75 Å的高质量数据集，尽管存在单斜晶系（C2）空间群。这使得项目能够快速推进，而无需进一步优化结晶条件。这个结果在前面已经描述过9.对于孔中四个晶体的数据收集，在 2 分钟内收集了数据集。
案例研究 4：使用连续晶体学从板中的微晶中获取信息和室温结构
通常，当微晶以液滴形式出现时，或者当用户寻求批量优化微结晶方案时，作为同步加速器或XFEL源连续晶体学实验的前体，使用最少的材料获得有关不同试验的衍射特性和晶胞尺寸的快速反馈非常有帮助。在此用例中，将批量生长的溶菌酶微晶移液到结晶板（每滴200 nL体积）中，并使用步长为10μm的网格扫描从8液滴中收集数据（图9）。使用串行晶体学软件处理得到的 25,906 张静止图像，从而形成一个数据集，其中 9,891 个衍射图被索引并合并，生成一个分辨率为 2.0 Å 的数据集，该数据集根据已发表的室温结构进行了很好的改进（使用 PDB 8A9D 时，R功 = 19.6%，无 R = 23.6%）（表 1).这允许对晶胞分布进行详细分析和微晶室温结构测定，从而可以用于复杂的连续晶体学实验，包括时间分辨研究。所需微晶悬浮液的总体积为 1.6 μL。对于使用网格扫描在八个孔中收集微晶的数据，在 40 分钟内收集了数据集。
图 1：蛋白质到结构管道的示意图，该管道集成了结晶筛选、结晶设施的优化、VMXi 的室温自动数据收集和处理（无需样品采集）、XChem 片段筛选以及其他 MX 光束线的数据收集。 用户可以通过提供样品或将板带到 VMXi 光束线来启动管道。缩写：Versatile Macromolecular Crystallography in situ。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：用于设置结晶板的 Mosquito SPT Labtech 界面。 （一） （1） MiTeGen 原位 1 设置视图。通过转到 （2） 96 孔板类型并选择 （3） MiTeGen 板 2 滴板来选择 MiTeGen 2 滴标准板。要更改 VMXi 所需的删除 1 和删除 2 的定义参数，请单击 （4） 编辑图标。这将打开一个新窗口 （B），其中 （5） X 和 Y 偏移需要更改，如图所示。选择 （B） 子孔 2 和 （C） 子孔 3 并相应地更改值。（D） CrystalQuickX 设置视图。通过转到 96 孔板类型并选择 MiTeGen 板 2 滴板来选择 CrystalQuickX 2 滴标准板。要更改 VMXi 所需的放置 1 和放置 2 的定义参数，请单击与上述相同的编辑图标。这将打开一个新窗口，其中 （E，F） X 和 Y 偏移需要更改，如图所示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：SynchWeb 界面显示了如何创建 VMXi 货件、注册铭牌和查看联系方式。 （A）下拉菜单，（B，C）注册新货件，（D）注册新集装箱，（E）输入车牌信息，（F）检查联系方式，以及（G）提案中已注册的集装箱列表，显示了将信息上传到SynchWeb界面的各个阶段的屏幕截图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：使用 SynchWeb 选择和准备用于数据收集的样本。 将显示一系列屏幕截图，其中显示了使用 SynchWeb 界面准备用于数据收集的样品的各个阶段。（A） 从液滴概览中选择感兴趣的点和区域。在这个面板的下半部分，有一个按时间顺序排列的一滴照片系列。（B） 一块板的 CHiMP 输出示例，突出显示了“晶体”类别的结果。（C） 从选定点和区域列表中将样本添加到队列中，以及 （D） 从光束线创建的实验设置的下拉列表中将数据收集参数应用于排队的样本。注意没有实验参数的样品（红色）与正确应用参数的样品（顶部和底部）之间的差异。该面板的底部是 “排队容器 ”按钮，用于将要在光束线上收集的板排队。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：在 SynchWeb 中创建示例组。 一系列屏幕截图，显示了创建示例组的各个阶段。（A） 从相关货物中选择含有样品的板，以及 （B） 选择板内的液滴。这些可以是单独的水滴，也可以按行和/或列选择。（C） 已创建的样本组列表。（D） 列出最后三个多路复用处理作业的输出，并可以选择这些输出以显示处理管道中的统计信息。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：数据处理和数据缩减。 （A） ISPyB11 中已处理数据集的屏幕截图。用于访问再处理功能的按钮将突出显示。样品ID和实验参数显示在左上角，衍射图像查看器显示在中间。单击此图像将打开一个交互式窗口来检查不同的图像。晶体图像查看器显示在右侧，单击此图像还将打开一个交互式窗口，用于比较光束线和 Formulatrix 存储图像。每张图像的分析图显示在最右侧，单击此图像将打开此输出的放大版本。单击“ 自动处理 ”选项卡将使自动处理可见，并使不同管道的结果之间的比较变得容易。单击选项卡可在不同的处理管道之间切换，并查看所选管道的详细输出。用于数据下载的 “日志和文件 ”按钮将突出显示。单击“ 下游处理” 选项卡将展开，并在适当的情况下为通过数据缩减后管道运行的任何数据集提供结果。（B） 样品组管理 屏幕的屏幕截图。用户定义的组名称位于顶部，所包含井的视觉描述如下。绿色孔表示从该液滴中测量的所有晶体都将包含在该组中。可以看到对该组执行的不同多路复用作业的摘要，下面是多路复用的详细输出。“ 数据集 ”按钮将突出显示，用于检查包含的实验。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：数据再处理窗口。 （A） 单个和 （B） 多晶数据集。将显示两个单独的数据集，其中选择了数据区域。选中“ 单独处理 ”复选框后，将按 “集成 ”按钮单独处理所选的衍射图像。单击 “多晶” 按钮将打开各个数据集的显示。要重新处理来自多个数据集的衍射图像，需要选择显示的图像区域，然后单击突出显示的 “集成” 按钮来启动重新处理。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：VMXi 管道的代表性结果。 （A） 结晶液滴中蛋白质索马汀的标记晶体（左图）、数据处理结果（中图）和电子密度（右图）。（B） 收集多个晶体以确定片段与 SARS-CoV-2 宏结构域的结合。使用标准实验设置，在存在来自EU-OPENSCREEN片段屏幕的片段的情况下，在多个晶体上收集数据集。这些数据集合的示例显示在 SynchWeb 的摘录中。碎片被构建成相应的密度，并进一步细化，如右侧最远处所示。（C） 用于数据收集的具有挑战性的结晶命中的堆栈中标记的单斜晶体。绿色十字和红色数字表示使用 10 μm 光束和 60° 旋转测量数据的位置。将得到的四个楔块合并，以生成分辨率为 1.75 Å 的数据集。血红素基团周围的电子密度显示在右侧。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：结晶板中的连续晶体学。 （A） 结晶液滴的光学图像，白色框代表感兴趣的区域。（B） 网格扫描点的定义。（C） 表示衍射的热图。（D） 由超过 9,000 个静止衍射图谱的连续晶体学数据集产生的电子密度图。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 分辨率 （Å） | 完整性 （%） | 多样性 | I/σ（I） | R拆分 | CC1/2 （英语） | 独特的观察结果 |
| 整体 | 100 | 95.5 | 20.8 | 0.063 | 0.998 | 8422 |
| 最低价 （55.55 - 5.43） | 100 | 147.1 | 81.7 | 0.028 | 0.999 | 488 |
| 最高价 （2.03 -2.00） | 100 | 75.3 | 1.2 | 1.092 | 0.410 | 411 |
表 1：VMXi RT 串行数据集的数据统计信息。缩写： I = 比例观测值的平均强度;R分裂 = 测量强度差异的量度;CC 1/2 = 数据集的两个随机半部分之间的相关系数。
Discussion
我们已经描述了从蛋白质样品到达CF到用户下载最终数据以供进一步应用的完整过程。关键步骤是生产高质量的蛋白质样品和适当的晶体筛选，要么使用商业稀疏基质筛选，要么使用基于既定条件的优化筛选。这个过程可以在CF中进行，或者用户可以在家庭实验室中进行结晶程序，并将合适的结晶板带到光束线上。对于某些样品，确定合适的数据收集参数可能很重要，特别是在辐射损伤是一个问题的情况下。在大多数情况下，自动数据处理完全足以回答科学问题，尽管用户保留了使用光束线工具进行重新处理的能力，例如，空间群不明确或仅使用收集数据的初始部分来最大限度地减少辐射损伤影响。
如果初始结晶试验中没有产生合适的晶体，则可以探索蛋白质浓度、纯度或结晶筛选的变化，也可以使用晶体晶种。如果晶体在光束线上没有衍射到有用的分辨率，则可以将网格扫描与未衰减的光束一起使用，以评估晶体的固有衍射极限和晶胞，以指导优化工作。太小而无法在板内收集数据的晶体（例如，<10 μm）可能适用于连续晶体学或纳米焦点实验（例如，在金刚石光束线VMXm处）。使用 VMXi 数据求解结构通常通过分子替换变得简单明了，特别是自从 Alphafold16 出现以提供有效的搜索模型以来。如果这不成功，可以从板中收集晶体并冷冻冷却，以实现常规的单波长异常衍射、多波长异常衍射或长波长相位实验。
这种方法的优点包括能够直接从结晶板获得快速、高质量的数据集和反馈，而无需干扰晶体生长的环境。结构生物学中所谓的“室温复兴”重视在非低温条件下获得的结构，以便探索更多的生理相关性和蛋白质动力学2.通常，与优化的低温冷却晶体相比，其分辨率略低，但前提是已经建立了合适的冷冻条件，并且晶体对机械处理和结晶液滴3 的打开具有鲁棒性。该管线非常适合的即将到来的应用是在药物发现中在室温下大规模筛选蛋白质-配体复合物或片段活动。配体或片段可以共结晶，也可以在室温数据收集之前通过移液器或声滴喷射添加。另一个应用是以高效的方式快速测量来自数百或数千个晶体的数据，然后使用 DIALS17 multiplex14 软件提取可能代表不同生物实体的同晶簇，或建立以不同方式处理或暴露于不同配体或信号的晶体群体之间的统计学显着差异。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢许多钻石光源科学家和支持团队成员，他们为 VMXi 光束线的设计、建造和运营做出了贡献。我们感谢光束线用户，他们后来为结晶和数据收集管道的开发贡献了想法。哈韦尔的结晶设施得到了钻石光源有限公司、罗莎琳德富兰克林研究所和医学研究委员会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
| Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
| Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
| Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
| MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
| Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
| Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request | Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
| Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 | Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |
References
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