Summary
نقدم بروتوكولا لتبلور البروتينات باستخدام مرفق التبلور في مجمع الأبحاث في هارويل وما بعده من جمع بيانات البلورات بالأشعة السينية في الموقع من البلورات داخل الألواح في خط شعاع دايموند متعدد الاستخدامات للجزيئات الكبيرة في الموقع (VMXi). نحن نصف متطلبات العينة وبروتوكولات التبلور وإرشادات جمع البيانات.
Abstract
تم وصف بروتوكولات بلورة البروتين الروبوتية باستخدام مرفق التبلور في هارويل وجمع بيانات درجة حرارة الغرفة في الموقع من ألواح التبلور في خط شعاع مصدر ضوء الماس VMXi. يتيح هذا النهج تحديد الهياكل البلورية عالية الجودة في درجة حرارة الغرفة من بلورات متعددة بطريقة مباشرة ويوفر ملاحظات سريعة جدا حول نتائج تجارب التبلور بالإضافة إلى تمكين علم البلورات التسلسلي. أصبحت قيمة هياكل درجة حرارة الغرفة في فهم بنية البروتين ، وربط الرباط ، والديناميكيات معترف بها بشكل متزايد في مجتمع البيولوجيا الهيكلية. يمكن الوصول إلى خط الأنابيب هذا للمستخدمين من جميع أنحاء العالم مع العديد من طرق الوصول المتاحة. يمكن تصوير تجارب التبلور التي تم إعدادها وعرضها عن بعد باستخدام البلورات التي يتم تحديدها تلقائيا باستخدام أداة التعلم الآلي. يتم قياس البيانات في نظام قائم على قائمة الانتظار مع مجموعات بيانات دوران تصل إلى 60 درجة من بلورات مختارة من قبل المستخدم في لوحة. يتم دمج البيانات من جميع البلورات داخل بئر معين أو مجموعة عينات تلقائيا باستخدام xia2.multiplex مع الوصول إلى المخرجات مباشرة عبر واجهة متصفح الويب.
Introduction
يظل علم البلورات بالأشعة السينية أداة رئيسية لفهم بنية البروتين ووظيفته ، حيث يوفر هياكل عالية الدقة للبروتينات أو مجمعاتها ، على سبيل المثال ، ركائز أو أدوية مرشحة. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، فإن الحصول على بلورات ذات خصائص مرغوبة - حيود للغاية ، شكل بلوري قابل للنقع وبدون أمراض بلورية مثل التوأمة - يظل عنق زجاجة كبير1. نظرا لأنه لا يمكن التنبؤ بالظروف الكيميائية المناسبة لإنتاج بلورات البروتين بشكل عام ، فإن فحص التبلور الذي يستكشف الآلاف من المخاليط الكيميائية المحتملة هو المعيار ، وغالبا ما يساعده الأتمتة / الروبوتات في إعداد الشاشات والفنادق البلورية للمراقبة ، غالبا عن بعد ، صور إسقاط التبلور التي يتم تسجيلها.
عندما تظهر البلورات ، يجب عادة حصادها من بيئة التبلور باستخدام حلقة نايلون أو كابتون ثم نقلها إلى قطرة تحتوي على عامل حماية بالتبريد (البحث عنه متغير إضافي) قبل الغطس في التجميد إلى نيتروجين سائل. يمكن أن تتضمن هذه الخطوات الإضافية بين التبلور وجمع بيانات الأشعة السينية جفاف قطرة التبلور عند كسر بيئتها المغلقة ، والضغوط الميكانيكية على البلورة عند التعامل معها ، والضرر الناجم عن عوامل الحماية من التبريد إلى الشبكة البلورية (مما يؤدي عادة إلى زيادة انتشار الفسيفساء) من بين عواملأخرى 2. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حصاد الكريستال يتطلب وقتا طويلا وعمالة ويمكن أن يؤدي إلى عدم التجانس بين العينات ، خاصة عندما يتشكل الجلد على قطرات أثناء عملية الحصاد. يتيح خط شعاع VMXi الوصول إلى البيانات القابلة للاستخدام من البلورات العالقة في اللوحة ، والتي سيتم التخلص منها لجمع البيانات.
يتم تحديد الغالبية العظمى من الهياكل البلورية للأشعة السينية عند 100 كلفن باستخدام النهج أعلاه ، مما يتيح النقل والمناولة البلورية المباشرة وزيادة عمر البلورة في شعاع الأشعة السينية بأوامر من الحجم. ومع ذلك ، هناك اهتمام متزايد بتحديد الهياكل في ظل الظروف غير المبردة ، أي أقرب بكثير إلى الظروف الفسيولوجية ذات الصلة بوظيفة البروتين2،3،4. وهذا يتيح تقديرا أفضل بكثير للبنية الديناميكية للبروتينات ، ويتجنب تجميد توافقات أو حلقات الأحماض الأمينية في حالات غير ذات صلة وظيفيا5 ، ويمكن من استكشاف ارتباط الليجند في ظل ظروف أقرب بكثير إلى تلك الموجودة في البيئة الطبيعية للبروتين داخل الخلية والكائنالحي 6.
هناك نهج بديل ، تم تنفيذه في خط شعاع علم البلورات الجزيئية متعدد الاستخدامات في الموقع (VMXi) في سنكروترون مصدر ضوء الماس ، المملكة المتحدة ، وهو قياس بيانات الحيود مباشرة من البلورات داخل البيئة التي نمت فيها (أي داخل لوحة التبلور) ، في ظل الظروف المحيطة ودون إزعاج 7,8. يتيح ذلك ردود فعل سريعة جدا من شاشات التبلور والتحسينات لتوجيه المستخدم إلى شكل بلوري مثالي لمتطلباته. كما أنه يتيح إنتاج هياكل عالية الجودة لدرجة حرارة الغرفة بطريقة آلية9.
يفترض هذا البروتوكول أن المستخدم لديه عينة بروتين عالية النقاء جاهزة للتبلور. نصف تجربة المستخدم في الوصول إلى مرفق التبلور في هارويل لإنتاج بلورات البروتين ثم استخدام خط الشعاع VMXi لجمع البيانات (الشكل 1).
مرفق التبلور في هارويل
يقع مرفق التبلور في هارويل (CF) في مجمع الأبحاث في هارويل (RCaH) بجوار مصدر ضوء الماس. يوفر المرفق للمستخدمين مختبرا آليا عالي الإنتاجية لبلورة الجزيئات الكبيرة ، باستخدام الروبوتات لفحص التبلور ، وتحسين البلورات ، والتصوير البلوري ، والتوصيف . من خلال التكامل الوثيق مع خط شعاع VMXi المؤتمت للغاية ، تسارعت وتيرة تحديد هياكل درجة حرارة الغرفة بشكل كبير وتمكن من توصيف هياكل البروتين الجديدة ، ومجمعات البروتين والليجند والحمض النووي ، بالإضافة إلى فحص الشظايا الآلي (الشكل 1) ، كل ذلك في ظل ظروف غير مبردة.
خط أنابيب CF عبارة عن مجموعة من الأجهزة التي تشمل روبوتات بلورة نانولتر9 لتبلور البروتينات القابلة للذوبان والأغشية ، وروبوتات مناولة السوائل لإعداد شاشات التبلور التجارية وشاشات التحسين المخصصة المعقدة ، وأربعة أدوات تصوير (واحدة عند 4 درجات مئوية وثلاثة عند 20 درجة مئوية لتصوير لوحات التبلور (انظر جدول المواد). جهاز تصوير واحد قادر على تصوير الألواح الزجاجية ذات الطور المكعب الدهني (LCP) وجهاز تصوير واحد مجهز ببصريات متعددة التألق (كلاهما عند 20 درجة مئوية).
يستخدم المرفق الآن على نطاق واسع من قبل مجموعة واسعة من المستخدمين الأكاديميين والصناعيين ، بما في ذلك مختبر البروتين الغشائي (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html) ، ومرفق فحص شظايا XChem 10 ، وخطوط شعاع MX ، ومحور XFEL ، بالإضافة إلى معهد روزاليند فرانكلين (RFI). وقد مكن هذا الخط الراسخ والمحسن من إجراء تجارب التبلور عبر مجموعة واسعة من مشاريع البيولوجيا الهيكلية. تصف هذه الورقة خط أنابيب البلورات المخصصة لجمع البيانات في VMXi ، على الرغم من أنه يمكن أيضا حصاد البلورات وتبريدها بالتبريد أو توجيهها إلى خط أنابيب XChem.
ويخصص وصول المستعملين من خلال نظام الاقتراحات Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) ويدعم المستعملون الصناعيون من خلال فريق الاتصال المعني بصناعة الماس. يمكن لجميع المستخدمين القدوم إلى الموقع مع عينتهم (عيناتهم) أو لوحاتهم ، والتي يمكن نقلها يدويا. لا ينصح بإرسال اللوحات عن طريق البريد لأن تجربتنا تشير إلى أن القطرات يمكن أن تبتعد عن الموقع الذي تم صرفها فيه ، أو قد تتلف القطرات بسبب خزان التبلور. بدلا من ذلك ، من خلال الترتيب ، يمكن للمستخدمين إرسال عينات البروتين الخاصة بهم إلى التليف الكيسي ، حيث يقوم أعضاء فريق العمل بإعداد تجارب التبلور نيابة عنهم. يمكن مراقبة التجارب عن بعد من قبل المستخدم إما عن طريق تسجيل الدخول إلى Rock Maker Web في حالة CF أو عبر ISPyB في حالة VMXi. يمكن الوصول إلى CF بطريقة تكرارية بناء على نتائج حيود الأشعة السينية التي تم جمعها في Diamond.
خط الشعاع VMXi في مصدر ضوء الماس
Beamline VMXi (المشار إليها فيما يلي باسم "خط الشعاع") هي أداة فريدة تم تطويرها مؤخرا مخصصة بالكامل لعلم البلورات بالأشعة السينية المؤتمت بدرجة عالية في درجة حرارة الغرفة مع التركيز على قياس البيانات من البلورات داخل لوحات التبلور المناسبة. يوفر خط الشعاع تركيزا دقيقا (10 × 10 ميكرومتر) ، شعاعا ورديا (تمرير نطاق <5 × 10-2ΔE / E) مع تدفق عال يبلغ ~ 2 × 1013 فوتونا / ثانية (عند 16 KeV) 7. يتيح هذا الشعاع عالي التدفق ، إلى جانب كاشف سريع ، إنتاجية عالية جدا للعينات وجمع البيانات من عينات يزيد حجمها عن 10 ميكرومتر.
تدخل لوحات التبلور إلى خط الشعاع من خلال تخزينها في نظام تخزين العينات وتصويرها بناء على الجدول الزمني الذي يقدمه المستخدم أثناء تسجيل اللوحات باستخدام واجهة ISPyB11 SynchWeb12. عادة ، ينصح المستخدمون بتحديد تسلسل فيبوناتشي للنقاط الزمنية للتصوير (0 ، 12 ، 24 ، 36 ، 60 ... 7,320 ساعة من اللوحة التي يتم إدخالها في النظام). يتم إبلاغ المستخدم عن طريق البريد الإلكتروني بمجرد تصوير اللوحة. يتوفر كل من التصوير بالضوء المرئي والأشعة فوق البنفسجية للمستخدمين عند الطلب. يتم تحليل الصور التي تم التقاطها بواسطة نظام تخزين العينات بواسطة خوارزمية التعلم الآلي ؛ يقوم هذا تلقائيا بتحديد موقع وتعريف نقاط الاهتمام للكائنات التي تشبه البلورات ويسجل نقاط الاهتمام الجاهزة للمستخدم لإضافتها إلى قائمة انتظار لجمع البيانات. يمكن للمستخدمين أيضا النقر يدويا على صور الضوء المرئي لتسجيل نقاط الاهتمام أو يمكنهم النقر فوق منطقة وسحبها ليتم تحليلها بواسطة المسح النقطية. تتوفر هذه النقاط للمستخدمين لإضافتها إلى قائمة الانتظار إلى جانب النقاط الموجودة تلقائيا.
بمجرد أن تحتوي جميع العينات على المعلمات المناسبة لجمع البيانات ، تدخل اللوحة في قائمة انتظار. عندما تصل اللوحة إلى أعلى قائمة الانتظار ، يتم توزيعها تلقائيا على خط الشعاع. يتم تحميل لوحات التبلور من الفنادق البلورية إلى خط الشعاع تلقائيا بواسطة ذراع آلي ، وبعد مطابقة الصورة ، يتم قياس مجموعات البيانات البلورية التي تصل إلى دوران 60 درجة من كل بلورة مختارة وفقا للتعليمات التي يحددها المستخدم. يمكن استخدام جميع القطرات داخل اللوحة لهذه التجارب على خط الشعاع. يتم دمج البيانات من بلورات متعددة لإنتاج مجموعات بيانات متماثلة الشكل ومدمجة على النحو الأمثل بطريقة آلية 7,9. بمجرد جمع جميع مجموعات البيانات في قائمة الانتظار ، يتم إرسال بريد إلكتروني للمستخدم يحتوي على رابط للمتابعة لعرض مجموعات البيانات في ISPyB11 ، كما هو الحال في خطوط شعاع Diamond MX الأخرى. يتم توجيه المستخدمين أيضا إلى صفحة الويب beamline (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).
Protocol
1. إنتاج بلورات داخل الألواح في الموقع باستخدام مرفق التبلور في هارويل
ملاحظة: يتم دعم الوصول إلى CF من خلال عدد من الطرق المختلفة ويعتمد على تطبيق المشروع ونوع المستخدم (أكاديمي أو صناعي). تمتلك مشاريع XChem و MPL نظام تطبيق الاقتراح الخاص بها عبر نظام إدارة المستخدم (UAS) ويمكن تقديمها إما من خلال مسار الوصول القياسي (بما في ذلك iNEXT Discovery و EUbOPEN) أو BAG Access. البروتوكول أدناه خاص بمستخدمي VMXi.
- تقديم المقترحات والتحضير للزيارة
- قدم معلومات حول المشروع إلى تطبيق اقتراح BAG أو أضفه إلى اقتراح BAG نشط. عادة ما يكون هناك منسق BAG ، الذي ينظم الأوراق. بدلا من ذلك ، قدم اقتراح الوصول السريع للوصول إلى خط الشعاع.
- تأكد من تسجيل العينة والتحقق من سلامتها في أنظمة الطائرات بدون طيار بناء على اقتراح قبل الوصول إلى الموقع إما عن طريق البريد أو شخصيا.
- تأكد من تسجيل المستخدم (باستخدام FedID وكلمة المرور).
- تأكد من إضافة المستخدم إلى اقتراح MX كمساعد في UAS بواسطة منسق BAG.
- أكمل نموذج تفاصيل نموذج تبلور خط الشعاع وأرسل النموذج إلى VMXi@diamond.ac.uk.
- تواصل مع موظفي خط الشعاع حول متطلبات التجربة وتوافر خط الشعاع.
- إذا تم شحن عينات البروتين ، فأرسل العينات فقط بترتيب مسبق. راجع القسم 1.2 للحصول على التفاصيل.
- إذا كان المستخدم سيأتي إلى الموقع لإعداد لوحات التبلور في CF ، فتحقق مع موظفي المنشأة حول توفر فترة زمنية لاستخدام أجهزة المرفق واتبع القسم 1.2.1.
- إذا أحضر المستخدم ألواحا إلى الموقع ، فتأكد من توزيع العينة في نوع اللوحة الصحيح وضع قطرات التبلور في الموقع الصحيح والكمية الصحيحة. اتبع القسم 1.2.2. لا يقبل خط الشعاع سوى لوحات تبلور محددة في الموقع (Greiner CrystalQuickX و MiTeGen In Situ-1) ؛ تأكد من أن القطرات لا تزيد عن 200 nL.
- تجربة التبلور التي أجريت في التليف الكيسي
ملاحظة: يقدم المرفق عددا من طرق التبلور الجزيئي عالي الإنتاجية مثل نشر البخار وكذلك بلورة الدفعات تحت الزيت و LCP. يوصى بالبدء ب 70-100 ميكرولتر من البروتين النقي وإجراء تجارب انتشار البخار للبروتينات القابلة للذوبان بثلاث شاشات باستخدام نسبة 100 nL من محلول البروتين و 100 nL من محلول خزان التبلور واحتضان الألواح عند 20 درجة مئوية. يتوفر عدد من الشاشات التجارية داخل المنشأة. تتوفر الرطوبة والتحكم في درجة الحرارة مع 4 درجات مئوية و 20 درجة مئوية الأكثر استخداما. يتلقى المستخدمون الذين يزورون CF تدريبا موحدا ويدعمون تشغيل أجهزة التبلور وسيستخدمون الإعدادات الموضحة هنا.- عينات الشحن للإعداد في CF
ملاحظة: قبل الوصول إلى الموقع ، يجب التحقق من صحة عينة البروتين بناء على اقتراح داخل نظام UAS. بمجرد وصول عينة البروتين إلى الموقع ، سيقوم الموظفون بإعداد تجارب التبلور وفقا للتعليمات في الاتصالات السابقة مع المستخدم. سيتم إرسال التأكيد عبر البريد الإلكتروني مع معلومات الباركود للوحات التبلور التجريبية. سيطلب من المستخدم إضافة ألواح التبلور كحاويات إلى الاقتراح ذي الصلة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يمكن تخزين الألواح في أجهزة تصوير آلية في مرفق التبلور أو عند خط الحزمة. سيكون ISPyB هو الواجهة المستخدمة للتفاعل عند خط الشعاع.- توفير محلول عينة البروتين عند تركيز التبلور بمضاعفات 25 ميكرولتر من القسامة. قم بتسمية أنابيب العينة التي تحتوي على عينة البروتين بوضوح.
- إذا لزم الأمر ، قم بتوفير محلول عازل للبروتين أو محلول ليجند أو محلول خزان.
- أبلغ موظفي المنشأة بالشاشات ونسب الإسقاط التي يجب استخدامها.
- إعدادات لوحة التبلور
ملاحظة: نطلب أن تكون قطرات التبلور في لوحة Greiner CrystalQuickX و MiTeGen In Situ-1 في موقع معين ؛ يجب أن تستخدم اللوحات التي تم إعدادها في مكان آخر إعدادات Mosquito13 التالية الموضحة هنا.- لضبط تعريف اللوحة ل MiTeGen In Situ-1 ، افتح برنامج Mosquito SPT وانقر فوق صفحة تعريف لوحة MiTeGen In Situ-1 القياسية بالنقر فوق إعداد | 96 بئر | MiTeGen في الموقع -1 (96 × 2 قطرات) (الشكل 2 أ). انقر فوق زر التحرير وقم بتعديل قيم موقع البئر الفرعي 2: X إزاحة إلى - 1.2 وإزاحة Y إلى 1.8 وموقع البئر الفرعي 3: X إزاحة إلى 1.3 وإزاحة Y إلى 1.8 (الشكل 2B ، C).
- لضبط تعريف اللوحة ل Greiner CrystalQuickX ، افتح برنامج Mosquito SPT وانقر فوق صفحة تعريف لوحة Greiner CrystalQuickX القياسية بالنقر فوق إعداد | 96 بئر | غرينر كريستال كويك إكس (الشكل 2 د). انقر فوق زر التحرير وقم بتعديل قيم موقع البئر الفرعي 1: X إزاحة إلى - 1.95 وإزاحة Y إلى 1.45 ولموقع البئر الفرعي 2: X إزاحة إلى 1.95 وإزاحة Y إلى 1.45 (الشكل 2E ، F).
- عينات الشحن للإعداد في CF
2. استخدام خط الشعاع في مصدر ضوء الماس
ملاحظة: يتم إجراء جميع التفاعلات مع خط الشعاع من قبل المستخدمين عن بعد باستخدام واجهة ISPyB11 . لا يلزم وجود مادي على خط الشعاع ويتم جمع البيانات باستخدام نظام قائم على قائمة الانتظار بدلا من جدولتها في وقت معين. سيكون لدى المستخدمين اقتراح مرتبط بوصولهم إلى مصدر ضوء الماس. عند خط الشعاع ، يتم تخصيص زيارة فريدة لكل لوحة تبلور ويتم تعريفها على أنها "حاوية" داخل ISPyB11 مماثلة لقرص يحتوي على عينات عند 100 K. لا يمكن إنشاء شاشات التحسين باستخدام واجهة SynchWeb وعلى هذا النحو ، تتم إضافة المعلومات عادة إلى قسم التعليقات (انظر الخطوة 2.1.4.). سيحتاج الشخص الذي يسجل اللوحة إلى التحقق من عنوان البريد الإلكتروني حيث سيتلقى مالك اللوحة رسائل بريد إلكتروني بخصوص التصوير بالإضافة إلى إشعارات اللوحة المكتملة.
- تسجيل اللوحات
- قم بتسجيل الدخول إلى ISPyB باستخدام Diamond FedID المناسب وحدد المقترحات. ابحث عن الاقتراح محل الاهتمام عن طريق التمرير أو كتابة رقم الاقتراح في شريط البحث. حدد شحنة من القائمة المنسدلة تحت رقم العرض (الشكل 3 أ) ، والذي سيفتح نافذة الشحنات مع الشحنات في هذا الاقتراح. انقر فوق + إضافة شحنة في أعلى الجانب الأيمن (الشكل 3 ب) لفتح نافذة إضافة شحنة جديدة ، وقم بتسمية الشحنة ، وانقر فوق آلي / مصور ، ثم انقر فوق إضافة شحنة زر في أسفل اليسار (الشكل 3 ج).
- في نافذة الشحن (الشكل 3D) ، انقر فوق + إضافة حاوية، والتي ستعرض بعد ذلك عرض صفحة إضافة حاوية (الشكل 3E). اختر في القائمة المنسدلة نوع الحاوية أيا من أنواع اللوحات ذات الصلة. ستتغير الصفحة لتعكس نوع الحاوية الذي تم اختياره. أدخل الرمز الشريطي واسم الحاوية وفقا لتعليمات البريد الإلكتروني من موظفي خط الشعاع الخاصة باللوحات التجريبية. لاحظ أنه حساس لحالة الأحرف.
- حدد جهاز تصوير VMXi 20 °C من القائمة المنسدلة للتصوير المطلوب ، وجدول تصوير فيبوناتشي من القائمة المنسدلة جدول التصوير ، وشاشة التبلور من القائمة المنسدلة شاشة التبلور ، واسم المستخدم من القائمة المنسدلة المالك ، انقر فوق الزر "عرض " ، وأدخل عنوان البريد الإلكتروني الصحيح لجهة الاتصال في مربع البريد الإلكتروني (الشكل 3F).
- أدخل المزيد من التفاصيل حول اللوحة في مربع التعليقات . حدد العينة ذات الصلة من القائمة المنسدلة البروتين ، واستخدم الاختصار المسجل في UAS والمعتمد من قبل Diamond ضمن الاقتراح التجريبي. أدخل نفس الاسم في ملف اسم العينة صندوق؛ اترك الصناديق المتبقية فارغة.
- انقر فوق رمز + لوحة لتكرار العينة على اللوحة بأكملها وملء الحاوية بأكملها بمربعات خضراء. انقر على +إضافة حاوية في أسفل الصفحة لتسجيل اللوحة. اطلب من أحد الموظفين في خط الشعاع نقل اللوحة إلى جهاز التصوير المناسب ، حيث سيتم تخزينها وتصويرها. سيتم إنشاء زيارة عند تخزين الحاوية في أجهزة التصوير وسيتلقى المستخدم بريدا إلكترونيا يحتوي على رابط إلى اللوحة وصورها.
- عرض نتائج التصوير
- انتقل إلى اقتراح الاهتمام (الخطوات 2.1.1) ، وحدد الحاويات من القائمة المنسدلة أسفل رقم الاقتراح ، ولاحظ قائمة الحاويات المتاحة للاقتراح. حدد لوحات المرشح في حالة وجود أنواع أخرى من حاملات العينات. لتضييق نطاق البحث بشكل أكبر، حدد المربع حاوياتي لعرض الحاويات الأكثر صلة فقط المقترنة بمعرف المستخدم الحالي الذي تم تسجيل دخوله. انقر فوق الحاوية المناسبة عن طريق تحريك المؤشر فوق السطر الفردي والنقر بزر الماوس الأيسر.
- عند اختيار الحاوية ، سيتم تقديم منظر جديد ، يعرض نظرة عامة على اللوحة (الشكل 4 أ). انقر فوق قطرة في تمثيل اللوحة على الجانب الأيسر من الشاشة لإظهار أحدث صورة من تلك القطرة المعنية. استخدم مفاتيح الأسهم للتنقل بين القطرات ، أو حدد قطرات فردية باستخدام الماوس / المؤشر.
- لعرض الصور التاريخية للقطرة ، انقر فوق الزر H وانتظر حتى يظهر معرض منبثق للصور فوق صورة إسقاط البئر الحالية. مرر المؤشر فوق الصور الفردية لتحديث صورة الإفلات الرئيسية.
- سجل الصور للإشارة إلى حالة كل قطرة بالضغط على الأزرار 0 - 9 . للاطلاع على الفئات الفردية، افتح القائمة المنسدلة "النتيجة " في أعلى يسار الصورة المسقطة. ابحث عن الصلبان الزرقاء في كل صورة من صور الإسقاط ، والتي هي نتيجة لخوارزمية (CHiMP) مدربة على البحث عن "بلورات" داخل الصور.
- انقر فوق زر الرمز الثالث المسمى قياس في أعلى الجانب الأيمن من صورة الإسقاط للوصول إلى أداة قياس. لاستخدام هذه الأداة ، انقر فوق خط واسحبه ، وستمتد المسطرة وتعطي المسافة بالميكرومتر.
- لطلب جلسة تصوير إضافية، انقر فوق مرئي أو فوق بنفسجي من المربع المنسدل المجاور للإجراءات باتجاه أسفل الصفحة. ثم ، انقر فوق الزر طلب تصوير اللوحة .
- اختيار الكريستال / CHiMP
- لإضافة نقاط لجمع البيانات يدويا، اضغط على الزر +وضع علامة على النقطة . مرر المؤشر فوق نقطة الاهتمام المطلوبة وحدد. انتظر ظهور صليب أحمر.
ملاحظة: يمكن إنشاء ما يصل إلى 100 كائن لكل قطرة. - عند وضع علامة على جميع النقاط ، انقر فوق الزر +إنهاء . تذكر أيضا النقر فوق الزر + إنهاء قبل محاولة قياس الكائنات. لإضافة مناطق لجمع البيانات عبر عمليات فحص الشبكة، انقر فوق الزر +وضع علامة على المنطقة . انقر فوق النقطة العلوية اليسرى واسحب لأسفل ويمينا لإنشاء منطقة سيتم مسحها ضوئيا على خط الشعاع. كما هو الحال مع النقاط ، انقر فوق الزر + إنهاء عند إنشاء جميع المناطق المطلوبة.
ملاحظة: من الأفضل إنشاء منطقة واحدة أكبر من العديد من المناطق الصغيرة. - لاحظ الصلبان الزرقاء الموجودة بالفعل على صور الإسقاط ، والتي هي نتيجة خوارزمية مصممة لتحديد موقع الأجسام البلورية تلقائيا (CHiMP). لتصور تقييم CHiMP لقطرات التبلور ، انقر فوق مربع الاختيار إظهار النتائج التلقائية ثم قم بتغيير القائمة المنسدلة للفصل. عادة ما يكون الإعداد الأكثر فائدة هنا هو الخيار البلوري (الشكل 4 ب).
ملاحظة: هذه ميزة جديدة وليس من المضمون العثور على جميع البلورات وقد تجد أيضا كائنات أخرى ليست بلورات. - عندما يتم وضع علامة على جميع النقاط والمناطق في القطرات المعنية ، انقر فوق الزر التحضير لجمع البيانات في أسفل الصفحة.
- لإضافة نقاط لجمع البيانات يدويا، اضغط على الزر +وضع علامة على النقطة . مرر المؤشر فوق نقطة الاهتمام المطلوبة وحدد. انتظر ظهور صليب أحمر.
- إعداد العينات لجمع البيانات
- راقب قائمة العينات التي تحتوي على النقاط أو المناطق المحددة في الخطوة السابقة ، أو الموجودة تلقائيا (الشكل 4C). أضف نقاطا أو مناطق فردية بالضغط على الزر + أو أضف جميع النماذج المعروضة بالنقر فوق الزر إضافة الصفحة الحالية إلى قائمة الانتظار .
- تتوفر الفلاتر لعرض النقاط أو المنطقة أو النقاط التلقائية أو النقاط اليدوية فقط. لإظهار تلك العينات التي لم يتم تصويرها فقط (أي المعرضة للأشعة السينية)، انقر فوق الخيارين بدون بيانات وغير مكتمل أعلى أزرار التصفية.
- حدد عينات فردية من خلال النقر على الخط المعني وتحديث الصورة على الجانب الأيمن من الشاشة لإظهار الانخفاض الصحيح والنقطة الفردية. إذا كان هناك العديد من العينات في القائمة، فقم بزيادة عدد العينات المعروضة لكل صفحة عن طريق تحديد القائمة المنسدلة مع 10 كإعداد افتراضي وما يصل إلى 100 كحد أقصى لعدد العينات المعروضة.
- بمجرد إضافة جميع النقاط والمناطق إلى قائمة الانتظار، تأكد من أن جميع معلمات جمع البيانات التجريبية مرتبطة بكل تجربة.
- استخدم عوامل تصفية للنقطة والمنطقة واليدوي والتلقائي. انقر فوق عامل تصفية النقطة وانقر فوق خانة الاختيار تحديد الكل أسفل أزرار التصفية لتطبيق المعلمات في نفس الوقت على جميع العينات المرئية في قائمة العينات الحالية في قائمة الانتظار .
- حدد المعلمات التجريبية من القائمة المنسدلة على الجانب الأيمن من الشاشة أسفل الصورة المسقطة (الشكل 4D). بالنسبة للمناطق، حدد خيار خطوات مسح الشبكة DMM 10 ميكرون، نقل بنسبة 100 بالمائة. بالنسبة إلى جميع تجارب النقاط الأخرى، حدد خيارات أخرى من القائمة المنسدلة حسب الاقتضاء.
- لمجموعات بيانات التذبذب ، انقر فوق خيار نقل Omega Scan DMM 60 درجة بنسبة 5 بالمائة لجمع أكبر قدر ممكن من البيانات من عينة فردية. تطبيق دورات صغيرة على بلورات صغيرة جدا أو عينات حساسة للإشعاع وتغيير الإرسال بناء على الخبرة السابقة مع شكل بلوري معين. بمجرد تطبيق المعلمات التجريبية على جميع العينات بشكل صحيح، انقر فوق الزر حاوية قائمة الانتظار في أسفل الصفحة.
- بمجرد وصول اللوحة إلى أعلى قائمة الانتظار ، سيتم تقديمها إلى خط الشعاع ، وسيتم جمع مجموعات البيانات ، ثم ستعود مرة أخرى إلى تخزين العينة داخل خط الشعاع. بمجرد اكتمال جمع البيانات من لوحة ، ابحث عن بريد إلكتروني يحتوي على رابط لمتابعته للوصول إلى البيانات ذات الصلة.
- إنشاء مجموعات عينة
ملاحظة: يمكن إنشاء مجموعات عينات لتجميع عينات متشابهة عبر قطرات أو ألواح متعددة. ستتم معالجة جميع مجموعات البيانات داخل مجموعات العينات هذه باستخدام خط أنابيب xia2.multiplex14 بمجرد معالجته بواسطة DIALS. يمكن أن يكون هذا مفيدا عند جمع العديد من الأوتاد الصغيرة جدا من البيانات وقد يكون مفيدا أيضا لزيادة الإشارة إلى الضوضاء لتجارب ربط الليجند.- حدد نموذج إدارة المجموعة من القائمة المنسدلة أسفل رقم الاقتراح. ابحث عن قائمة بالمجموعات إذا تم إنشاؤها بالفعل بواسطة مستخدمين آخرين. لإنشاء مجموعة جديدة، انقر فوق الزر +إنشاء مجموعة نموذجية . انقر فوق شحنة من القائمة المنسدلة في صفحة إنشاء مجموعة عينة لرؤية عارض العينة (الشكل 5 أ). انقر فوق الحاوية التي تحتوي على العينات ذات الصلة من القائمة التي تم ملؤها.
- عند النقر فوق حاوية، ابحث عن رسم يوضح نظرة عامة على اللوحة.
- انقر فوق قطرات بشكل فردي بالنقر فوق القطلة الفردية (الشكل 5B) أو انقر فوق القطرات في الصفوف أو الأعمدة بالنقر فوق حرف الصف أو رقم العمود ذي الصلة. عند تحديد كل الآبار المقترنة بمجموعة فردية، أدخل اسما للمجموعة في المربع نموذج اسم المجموعة ، وانقر فوق الزر حفظ مجموعة العينة . انقر فوق الزر عرض مجموعات العينة في هذه الصفحة للعودة إلى قائمة مجموعات العينات التي تم إنشاؤها بالفعل والمرتبطة بالاقتراح (الشكل 5C).
- تحرير مجموعات العينات
- انقر فوق مجموعة عينة من قائمة المجموعات في الصفحة إدارة مجموعة العينات .
- انقر فوق الزر + تحرير مجموعة العينة بجوار الحاويات التي تظهر أسفل معلومات المجموعة (الشكل 5C).
- لاحظ القطرات ، المرتبطة بالفعل بمجموعة عينة ، مميزة في نظرة عامة على اللوحة.
- أضف المزيد من القطرات إلى مجموعة العينة بالنقر فوق قطرات أو آبار أو أعمدة كما كان من قبل.
ملاحظة: لا يمكن إزالة القطرات من مجموعة عينة. - بمجرد إضافة قطرات إضافية ، قم بتحرير نموذج اسم المجموعة ثم احفظه ، أو احفظه فقط بالنقر فوق الزر حفظ مجموعة العينة .
- تصور وتحليل مخرجات مجموعات العينة
- انقر فوق مجموعة فردية من قائمة مجموعات العينات لعرض نظرة عامة على اللوحة للحاوية أو الحاويات المقترنة بالمجموعة. سيتم تمييز القطرات المضمنة في المجموعة على هذه الشاشة (الشكل 5 د).
- ابحث عن قائمة تحتوي على آخر ثلاث وظائف متعددة الإرسال مرتبة ترتيبا زمنيا إذا تم جمع البيانات في هذه المجموعة.
- انقر فوق السطر لتشغيل تعدد الإرسال لتحديث نتائج المعالجة أدناه.
- لاحظ زر الارتباط السريع ، الذي يعرض عدد مجموعات البيانات المرتبطة بالمجموعة. انقر فوق هذا الزر لفتح صفحة مجموعات بيانات جديدة تعرض مجموعات البيانات الفردية.
3. الوصول إلى المعالجة التلقائية للبيانات
ملاحظة: بمجرد جمع البيانات، يتم تمريرها عبر العديد من خطوط أنابيب معالجة البيانات التلقائية. يتم أيضا تشغيل خطوط الأنابيب القياسية الأربعة المستخدمة عبر خطوط شعاع MX في Diamond على البيانات التي تم جمعها في خط الشعاع. هم "fast_dp" و "أقراص xia2" و "xia2 3dii" و "autoPROC" 15. سيوفر "fast_dp" تقليلا سريعا للبيانات لتقييم الجودة بسرعة. ستتطلب خطوط الأنابيب الثلاثة الأخرى مزيدا من وقت الحساب وتشغيل مجموعة متنوعة من حزم برامج تقليل البيانات المختلفة للمقارنة. وفقا لذلك ، عادة ما يكون الناتج أعلى جودة من الناتج "fast_dp". سيتم أيضا تشغيل مجموعات البيانات التي تم جمعها على خط الشعاع من خلال برنامج الدمج التلقائي متعدد البلورات "xia2.multiplex"14 ، والذي سيدمج جميع مجموعات البيانات ضمن مجموعة محددة. لاحظ أنه على الرغم من أن عمليات فحص الشبكة لا تتم معالجتها تلقائيا حاليا ، يمكن معالجة البيانات يدويا باستخدام خط أنابيب "xia2.ssx". يمكن العثور على نتائج خطوط أنابيب المعالجة التلقائية في ISPyB11 باستخدام البروتوكول التالي.
- تحديد موقع مجموعات البيانات
- قم بتسجيل الدخول إلى ISPyB كما هو موضح أعلاه وحدد المقترحات.
- ابحث عن اقتراح الاهتمام عن طريق التمرير أو كتابة رقم الاقتراح في شريط البحث.
- انقر فوق الزيارة المطلوبة من القائمة التي تظهر على الشاشة للوصول إلى نافذة مجموعات البيانات لتلك الزيارة.
- قم بتطبيق أي مرشحات مطلوبة.
ملاحظة: عامل التصفية الشائع هو عامل التصفية "المتكامل تلقائيا" ، والذي سيعرض فقط مجموعات البيانات التي تم تشغيلها بنجاح من خلال واحد أو أكثر من خطوط أنابيب المعالجة. سيؤدي هذا إلى استبعاد عمليات فحص الشبكة حيث لا تتم معالجتها حاليا تلقائيا من خلال ISPyB. - قم بالتمرير لأسفل الصفحة للعثور على مجموعة البيانات التي تهمك.
ملاحظة: ستعرض كل مجموعة بيانات معرف العينة والمعلمات التجريبية المستخدمة وعارض صور الحيود وعارض الصور البلورية ومخطط تحليل لكل صورة للمراقبة السريعة لجودة البيانات.
- للوصول إلى نتائج المعالجة التلقائية
- انقر على علامة التبويب المعالجة التلقائية أسفل ملخص البيانات لتجربة معينة لفحص نتائج التقليل التلقائي للبيانات (الشكل 6 أ).
- انقر فوق علامات التبويب المختلفة المقابلة لخطوط الأنابيب المختلفة لمشاهدة ملخص مفصل لكل مخرجات.
ملاحظة: إذا تم تعريف مجموعات العينات، سيكون هناك علامتي تبويب تقابلان مهام تعدد الإرسال. سيتوافق أحدهما مع دمج جميع مجموعات البيانات في المجموعة حتى تلك النقطة ، بينما يتوافق الآخر مع دمج مجموعات البيانات داخل هذا الانخفاض فقط. - انقر فوق الزر Logs & Files لتنزيل ملفات .mtz الناتجة إذا كانت المعالجة ناجحة وأي ملفات سجل مرتبطة. انقر فوق علامة التبويب معالجة المصب أسفل قسم المعالجة التلقائية لعرض الإخراج من DIMPLE.
ملاحظة: سيتم تشغيل DIMPLE فقط إذا تم توفير ملف PDB أثناء إرسال العينة. - انقر فوق الزر Logs &Files لتنزيل أي إخراج ناتج من DIMPLE.
- للوصول إلى نتائج تعدد إرسال المجموعة، افتح القائمة المنسدلة في الجزء العلوي من الشاشة مع كتابة رقم الاقتراح عليها وانقر فوق نموذج إدارة المجموعة. انقر فوق الصف المقابل للمجموعة المطلوبة داخل الحاوية الصحيحة. قم بالتمرير لأسفل للعثور على قائمة مخرجات تعدد الإرسال المقابلة للمجموعة كما يتم تمثيلها بصريا بواسطة رسم تخطيطي للوحة.
- انقر فوق إخراج تعدد الإرسال المطلوب من القائمة المقدمة. انقر فوق الزر xxx Data Sets ، حيث xxx هو عدد مجموعات البيانات المدمجة (الشكل 6B).
ملاحظة: سيؤدي هذا إلى فتح شاشة مجموعات البيانات ، ولكن سيتم عرض مجموعات البيانات فقط من مهمة تعدد الإرسال المحددة. - انقر فوق علامة التبويب المعالجة التلقائية في التجربة العليا.
- انقر فوق علامة التبويب Multiplex Processing التي تتوافق مع العدد الصحيح لمجموعات البيانات المدمجة.
- انقر فوق الزر Logs &Files لتنزيل .mtz وملفات السجل المقابلة (كما في الخطوة 3.2.3.)
- انقر فوق إخراج تعدد الإرسال المطلوب من القائمة المقدمة. انقر فوق الزر xxx Data Sets ، حيث xxx هو عدد مجموعات البيانات المدمجة (الشكل 6B).
- للوصول إلى نتائج فحص الشبكة
- انتقل إلى شاشة مجموعات البيانات للزيارة المطلوبة. سيتم عرض نتائج بيانات مسح الشبكة جنبا إلى جنب مع أي بيانات دوران تم جمعها.
ملاحظة: لن تكون هناك نتائج معالجة تلقائية. - ستحتوي صورة القطرة البلورية على الشبكة مغطاة بخريطة حرارية تمثل وجود الحيود. انقر فوق مربع لعرض صورة الحيود لهذا الموضع في الشبكة. انقر فوق القائمة المنسدلة أعلى صورة البئر البلوري لتغيير ما تمثله الخريطة الحرارية. الافتراضي هو الكثافة الكلية للحيود ولكن يمكن تغييره إلى إجمالي النقاط أو الدقة المقدرة أو الإطارات بدون ثلج.
- انتقل إلى شاشة مجموعات البيانات للزيارة المطلوبة. سيتم عرض نتائج بيانات مسح الشبكة جنبا إلى جنب مع أي بيانات دوران تم جمعها.
4. إعادة معالجة البيانات
ملاحظة: يمكن إعادة معالجة مجموعات البيانات المحددة من خلال واجهة ISPyB11 باستخدام نفس خطوط أنابيب المعالجة التي يتم تشغيلها تلقائيا مع الإعدادات التي تم تغييرها كما هو محدد من قبل المستخدم. يمكن تطبيق حد نهائي للقرار ؛ إذا كان تناظر / خلية البلورة معروفا ، فيمكن أيضا تحديد ذلك لضمان تشغيل خطوط أنابيب المعالجة في الإعداد الصحيح. يمكن أيضا دمج نطاقات الصور المحددة عبر مجموعات بيانات محددة باستخدام خطوط الأنابيب متعددة البلورات المتاحة. قد يكون هذا مفيدا إذا تسبب الضرر الإشعاعي المنتظم في أن يكون الجزء الأخير من صور الحيود ذا جودة رديئة. إنه أيضا خيار للمستخدم لتنزيل مجموعات البيانات الخاصة به باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه وتشغيل برنامج إعادة المعالجة المطلوب محليا ، والبرامج التعليمية المتاحة مجانا في مكان آخر (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html # ).
- لإعادة معالجة مجموعات بيانات فردية متعددة
- قم بتسجيل الدخول إلى ISPyB وانتقل إلى مجموعات البيانات ذات الأهمية (الخطوة 3.1).
- انقر فوق مجموعة بيانات وانقر فوق رمز الترس في شريط عنوان مجموعة البيانات (الشكل 6) لفتح نافذة إعادة المعالجة.
- قم بتكوين أي إعدادات مطلوبة وحدد الإطارات التي سيتم تضمينها في إعادة المعالجة.
ملاحظة: يمكن تحديد نطاق الصورة إما عن طريق كتابة نطاق في المربعات المسماة أو عن طريق النقر وسحب المنطقة المطلوبة في مخطط التحليل لكل صورة (الشكل 7 أ). - اختياري: لإضافة مجموعة بيانات أخرى لإعادة المعالجة الفردية ، انقر فوق رمز الترس الخاص بها وسيظهر في نافذة إعادة المعالجة أسفل مجموعة البيانات الأولى. ضع علامة في مربع العملية بشكل فردي .
- انقر فوق الزر تكامل .
- لإعادة معالجة البيانات متعددة البلورات
- افتح نافذة إعادة المعالجة من أي مجموعة بيانات.
- انقر فوق الزر Multi-Crystal لفتح شاشة جديدة.
- قم بالتمرير لأسفل للعثور على سلسلة من مخططات التحليل لكل صورة من التجارب أثناء الزيارة.
- اختر مسار معالجة من القائمة المنسدلة.
- اختياري: حدد أي حدود دقة أو معلمات خلية وحدة معروفة.
- انقر واسحب لتحديد نطاقات الصور المراد تضمينها في إعادة المعالجة متعددة البلورات (الشكل 7).
ملاحظة: يجب أن يتم ذلك عبر مخططات مختلفة متعددة بحيث يتم دمج مجموعات البيانات من بلورات مختلفة متعددة. - انقر فوق الزر "تكامل " (الشكل 7 ب).
- للوصول إلى البيانات المعاد معالجتها
- انتقل إلى صفحة مجموعات البيانات للزيارة المحددة (الخطوات 3.1.1-3.1.3).
- انقر فوق الزر "إعادة المعالجة " في الجزء العلوي من الشاشة.
- قم بالتمرير لأسفل لتحديد الوظيفة المطلوبة.
- انقر فوق مسار الملف في العمود الأيسر لفتح شاشة مجموعات البيانات للبيانات المعاد معالجتها .
- افتح علامة التبويب المعالجة التلقائية وقم بتنزيل البيانات كما هو موضح سابقا (الخطوة 3.2).
ملاحظة: يمكن التعرف على أي مهام معاد معالجتها من خلال رمز الأسهم الدائرية بجوار اسم خط الأنابيب.
Representative Results
تم استخدام مرفق التبلور وخط شعاع VMXi لمجموعة متنوعة من أنواع المشاريع وحالات الاستخدام. فيما يلي عدد قليل من الأمثلة لتوضيح ما قد يرغب المستخدمون في متابعته.
دراسة الحالة الإفرادية 1: جمع البيانات الموحدة
يتيح خط الشعاع التحديد السريع للهياكل البلورية في درجة حرارة الغرفة من عدد صغير من البلورات داخل لوحة التبلور. يعتمد الحد الأدنى لعدد البلورات على المجموعة الفضائية والاتجاهات البلورية ولكنه غالبا ما يكون 1-4 على الرغم من أنه يمكن تحقيق جودة بيانات محسنة عن طريق دمج البيانات من عدة عشرات من البلورات. مثال حديث هو أحد معايير خط الشعاع ، ثوماتين. تم ترميز بلورات متعددة ، كما هو موضح في الشكل 8A ، لجمع البيانات يدويا كما هو موضح في قسم البروتوكول 2.3. تمت إضافة هذه البلورات إلى قائمة الانتظار كما هو موضح في قسم البروتوكول 2.4 وتم اختيار المعلمات التجريبية من القائمة المنسدلة. بمجرد تطبيق المعلمات التجريبية ، تم وضع اللوحة في قائمة الانتظار لجمع البيانات. تم جمع مجموعات البيانات وتحجيمها تلقائيا ودمجها باستخدام خط أنابيب xia2.multiplex كما هو موضح في قسم البروتوكول 3. يظهر مثال على الإخراج من SynchWeb في منتصف الشكل 8A . أدت خمس مجموعات بيانات مدمجة إلى ظهور مجموعة بيانات بدقة 1.66 Å. لجمع البيانات القياسية لما يقرب من خمس بلورات في بئر ، تم جمع مجموعات البيانات في غضون 2.5 دقيقة.
دراسة الحالة 2: ربط الليجند - تجربة الشظايا باستخدام بروتين Mac1
يمكن تحقيق إنتاج هياكل معقدات البروتين ليجند في درجة حرارة الغرفة بشكل مباشر باستخدام خط الشعاع. يمكن إضافة الروابط إلى القطرات على ألواح التبلور (إما يدويا أو عن طريق الحقن بالقطرات الصوتية) والبيانات المقاسة بعد وقت حضانة مناسب. في المثال الموصوف هنا ، تم توزيع سلسلة من الشظايا في الآبار التي تحتوي على بلورات من المجال الكلي الأول ل SARS-CoV-2 للبروتين nsp3 (Mac-1) في لوحة تبلور. تم تخصيص اثنين من الآبار التي تحتوي على نفس الجزء كمجموعة كما هو موضح في الخطوة 2.5 من البروتوكول. تم تمييز بلورات متعددة (42) لجمع البيانات كما هو موضح في خطوتي البروتوكول 2.3 و 2.4 ، وتم جمع مجموعات البيانات باستخدام المعلمات القياسية (دوران 60 درجة ، خطوة 0.1 درجة ، تعرض 0.00178 ثانية ، انتقال 5٪ ، 16 كيلو فولت - لكل بلورة) (الشكل 8 ب). تمت معالجة مجموعات البيانات من البئرين تلقائيا باستخدام خط أنابيب xia2.dials وبعد ذلك ، تم بدء خط أنابيب xia2.multiplex لدمج 22 من مجموعات البيانات هذه تلقائيا. ثم تم تشغيل DIMPLE على إخراج خطوط الأنابيب هذه وأسفرت عن خرائط أظهرت بوضوح دليلا على الجزء المرتبط. تم بناء نموذج الشظايا في الكثافة غير المشغولة وتم تحسينه بشكل أكبر (الشكل 8B على اليمين). يمكن بسهولة تحديد الهياكل المرتبطة بدرجة حرارة الغرفة باستخدام هذه السلسلة من الخطوات لتوفير معلومات وتعليقات لا تقدر بثمن لعملية تصميم الأدوية القائمة على الهيكل. لجمع البيانات هذا من 42 بلورة عبر عدد من الآبار ، تم جمع مجموعات البيانات في غضون 10 دقائق.
دراسة الحالة 3: حل الهيكل مع مجموعة فضاء منخفضة التماثل والاتجاهات المفضلة تم إنتاج كومة من البلورات المتعددة ذات التشكل الشبيه بالصفائح من تجارب التبلور باستخدام السيتوكروم المرتبط بالغاز من النوع c (الشكل 8C). من خلال اختيار عدة مواضع حول حافة المكدس حيث كانت بلورة واحدة فقط في حزمة الأشعة السينية ، كان من الممكن الحصول على مجموعة بيانات عالية الجودة بدقة 1.75 Å عن طريق دمج أسافين من أربع بلورات ، على الرغم من مجموعة الفضاء أحادية الميل (C2). وقد سمح ذلك بالتقدم السريع للمشروع دون الحاجة إلى زيادة تحسين ظروف التبلور. تم وصف هذه النتيجة سابقا9. لجمع البيانات هذه لأربع بلورات في بئر ، تم جمع مجموعات البيانات في غضون 2 دقيقة.
دراسة الحالة 4: الحصول على المعلومات وبنية درجة حرارة الغرفة من البلورات الدقيقة في لوحة باستخدام علم البلورات المتسلسل
في كثير من الأحيان عندما تظهر البلورات الدقيقة في قطرة أو عندما يسعى المستخدمون إلى تحسين بروتوكولات التبلور الدقيق دفعة واحدة كمقدمة لتجارب علم البلورات التسلسلي في مصادر السنكروترون أو XFEL ، من المفيد جدا الحصول على ردود فعل سريعة حول خصائص الحيود وأبعاد خلية الوحدة للتجارب المختلفة باستخدام الحد الأدنى من المواد. في حالة الاستخدام هذه ، تم سحب بلورات الليزوزيم الدقيقة التي تنمو دفعة في لوحة تبلور (حجم 200 نانولتر لكل قطرة) والبيانات التي تم جمعها من ثماني قطرات باستخدام مسح شبكي بحجم خطوة 10 ميكرومتر (الشكل 9). تمت معالجة الصور الثابتة الناتجة البالغ عددها 25,906 باستخدام برنامج علم البلورات التسلسلي مما أدى إلى مجموعة بيانات ، حيث تمت فهرسة 9,891 نمط حيود ودمجها لإنتاج مجموعة بيانات بدقة 2.0 Å تم تحسينها جيدا مقابل بنية درجة حرارة الغرفة المنشورة (R work = 19.6٪ ، Rfree = 23.6٪ باستخدام PDB 8A9D) (الجدول 1). وقد سمح ذلك بإجراء تحليل مفصل لتوزيع خلية الوحدة وتحديد بنية درجة حرارة الغرفة الدقيقة التي يمكن أن تغذي تجارب علم البلورات التسلسلية المعقدة بما في ذلك الدراسات التي تم حلها بمرور الوقت. كان الحجم الإجمالي للتعليق البلوري المطلوب 1.6 ميكرولتر. لجمع البيانات هذه من البلورات الدقيقة عبر ثمانية آبار باستخدام المسح الشبكي ، تم جمع مجموعات البيانات في غضون 40 دقيقة.
الشكل 1: رسم تخطيطي لخط أنابيب البروتين إلى الهيكل الذي يدمج فحص التبلور ، والتحسين في مرفق التبلور ، وجمع البيانات الآلية في درجة حرارة الغرفة ومعالجتها دون حصاد العينات في VMXi ، وفحص شظايا XChem ، وجمع البيانات في خطوط شعاع MX الأخرى. يمكن للمستخدمين بدء خط الأنابيب عن طريق توفير عينة أو عن طريق إحضار اللوحات إلى خط شعاع VMXi. اختصار: علم البلورات الجزيئية متعدد الاستخدامات في الموقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: واجهة Mosquito SPT Labtech لإعداد ألواح التبلور. (أ) (1) عرض إعداد MiTeGen في الموقع -1. اختر اللوحة القياسية MiTeGen 2 بالانتقال إلى (2) نوع اللوحة ذات 96 بئرا واختيار (3) لوحة MiTeGen 2 لوحة السقوط. لتغيير معلمات التعريف للإسقاط 1 والإفلات 2 ، وهو أمر مطلوب ل VMXi ، انقر فوق رمز التحرير (4). يؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة (B) حيث (5) يجب تغيير إزاحة X و Y كما هو موضح. حدد (B) البئر الفرعي 2 و (C) البئر الفرعي 3 وقم بتغيير القيم وفقا لذلك. (د) طريقة عرض إعداد CrystalQuickX. اختر اللوحة القياسية CrystalQuickX 2 بالانتقال إلى نوع اللوحة ذات 96 بئرا واختيار لوحة إسقاط MiTeGen 2. لتغيير معلمات التعريف لإسقاط 1 وإسقاط 2 ، وهو أمر مطلوب ل VMXi ، انقر فوق رمز التحرير كما هو موضح أعلاه. يؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة حيث يجب تغيير إزاحة X و Y (E ، F) كما هو موضح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توضح واجهة SynchWeb كيفية إنشاء شحنة VMXi وتسجيل لوحة والتحقق من تفاصيل الاتصال. يتم عرض لقطات شاشة للمراحل المختلفة لتحميل المعلومات في واجهة SynchWeb من (A) القائمة المنسدلة ، (B ، C) تسجيل شحنة جديدة ، (D) تسجيل حاوية جديدة ، (E) إدخال معلومات اللوحة ، (F) التحقق من تفاصيل الاتصال ، و (G) قائمة بالحاويات المسجلة ضمن الاقتراح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اختيار العينات وإعدادها لجمع البيانات باستخدام SynchWeb. يتم عرض سلسلة من لقطات الشاشة التي توضح المراحل المختلفة لإعداد العينات لجمع البيانات باستخدام واجهة SynchWeb. (أ) يتم تحديد النقاط ومناطق الاهتمام من نظرة عامة على الإسقاط. في القسم السفلي من هذه اللوحة ، توجد سلسلة زمنية من الصور الفوتوغرافية لقطرة واحدة. (B) مثال على إخراج CHiMP للوحة واحدة يسلط الضوء على نتائج الفئة "البلورية". (ج) إضافة عينات إلى قائمة الانتظار من قائمة النقاط والمناطق المحددة و (د) تطبيق معلمات جمع البيانات على العينات الموضوعة في قائمة الانتظار من القائمة المنسدلة لإعدادات التجربة التي تم إنشاؤها بواسطة خط الشعاع. لاحظ الفرق بين العينات التي لا تحتوي على معلمات تجريبية (باللون الأحمر) مقابل تلك التي طبقت المعلمات بشكل صحيح (أعلى وأسفل). يوجد في الجزء السفلي من هذه اللوحة زر حاوية قائمة الانتظار ، والذي يضع اللوحة في قائمة الانتظار ليتم جمعها على خط الشعاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نموذج إنشاء المجموعة في SynchWeb. سلسلة من لقطات الشاشة توضح المراحل المختلفة لإنشاء مجموعات العينات. (أ) يتم اختيار اللوحة (اللوحات) التي تحتوي على عينات من الشحنة ذات الصلة و (ب) يتم اختيار القطرات داخل اللوحة. قد تكون هذه قطرات فردية أو قد يتم تحديدها حسب الصف و / أو العمود. ج: قائمة بمجموعات العينات التي تم إنشاؤها بالفعل. (د) يتم سرد مخرجات آخر ثلاث وظائف معالجة متعددة الإرسال ويمكن اختيارها لإظهار الإحصائيات من خط أنابيب المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: معالجة البيانات وتقليل البيانات. (أ) لقطة شاشة لمجموعة بيانات معالجة في ISPyB11. يتم تمييز زر الوصول إلى ميزات إعادة المعالجة. يتم عرض معرف العينة والمعلمات التجريبية في أعلى اليسار وعارض صور الحيود في المنتصف. سيؤدي النقر فوق هذه الصورة إلى فتح نافذة تفاعلية لفحص الصور المختلفة. يظهر عارض الصور البلورية على اليمين وسيؤدي النقر فوق هذه الصورة أيضا إلى فتح نافذة تفاعلية لمقارنة صور تخزين Beamline و Formulatrix. يتم عرض مخطط تحليل لكل صورة في أقصى اليمين وسيؤدي النقر فوق هذه الصورة إلى فتح نسخة مكبرة من هذا الإخراج. سيؤدي النقر فوق علامة التبويب المعالجة التلقائية إلى جعل المعالجة التلقائية مرئية وجعل المقارنة بين نتائج خطوط الأنابيب المختلفة سهلة. انقر فوق علامات التبويب للتبديل بين خطوط أنابيب المعالجة المختلفة وعرض الإخراج التفصيلي من خط الأنابيب المحدد. يتم تمييز زر السجلات والملفات لتنزيل البيانات. سيؤدي النقر فوق علامة التبويب معالجة المصب إلى توسيع وتقديم نتائج لأي مجموعات بيانات يتم تشغيلها عبر خطوط أنابيب ما بعد تقليل البيانات عند الاقتضاء. (B) لقطة شاشة من شاشة نموذج إدارة المجموعة . يوجد اسم المجموعة المعرفة من قبل المستخدم في الأعلى ويمكن رؤية الوصف المرئي للآبار المضمنة أدناه. يشير البئر الأخضر إلى أن جميع البلورات المقاسة من هذا القطرة ستدرج في المجموعة. يمكن رؤية ملخص لوظائف تعدد الإرسال المختلفة التي يتم إجراؤها على تلك المجموعة وتحتها يوجد الإخراج التفصيلي من تعدد الإرسال. يتم تمييز زر مجموعات البيانات لفحص التجارب المضمنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: نوافذ إعادة معالجة البيانات. (أ) مجموعات البيانات الفردية و (ب) متعددة البلورات. يتم عرض مجموعتي بيانات فرديتين حيث تم تحديد مناطق البيانات. مع تحديد خانة الاختيار المعالجة بشكل فردي ، ستتم معالجة صور الحيود المحددة بشكل فردي بالضغط على زر التكامل . سيؤدي النقر فوق الزر متعدد البلورات إلى فتح عرض مجموعات البيانات الفردية. لإعادة معالجة صور الحيود من مجموعات بيانات متعددة، يتم تحديد مناطق من الصور كما هي معروضة، وتبدأ إعادة المعالجة بالنقر فوق زر التكامل كما تم تمييزه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: النتائج التمثيلية من خط أنابيب VMXi. (أ) بلورات ملحوظة لبروتين ثوماتين داخل قطرة التبلور (اللوحة اليسرى) ، ونتائج معالجة البيانات (اللوحة المركزية) ، وكثافة الإلكترون (اللوحة اليمنى). (ب) الجمع على بلورات متعددة لتحديد ارتباط الشظية بمجال SARS-CoV-2 Macro. تم جمع مجموعات البيانات على بلورات متعددة في وجود جزء من شاشة جزء EU-OPENSCREEN باستخدام الإعدادات التجريبية القياسية. يتم عرض أمثلة على مجموعات البيانات هذه في هذا المقتطف من SynchWeb. تم بناء الجزء في الكثافة المقابلة وتم تحسينه بشكل أكبر كما هو موضح في أقصى اليمين. (ج) بلورات أحادية الميل ملحوظة في كومة من ضربة تبلور صعبة تستخدم لجمع البيانات. تشير الصلبان الخضراء والأرقام الحمراء إلى مكان قياس البيانات باستخدام شعاع 10 ميكرومتر ودوران 60 درجة. تم دمج أربعة من الأوتاد الناتجة لإنتاج مجموعة بيانات بدقة 1.75 Å. كثافة الإلكترونات حول مجموعة الهيم معروضة على اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: علم البلورات التسلسلي في لوحة التبلور. (أ) صورة بصرية لقطرة التبلور، مع مربع أبيض يمثل المنطقة محل الاهتمام. (ب) تعريف نقاط مسح الشبكة. (ج) خريطة حرارية تشير إلى الحيود. د: خريطة الكثافة الإلكترونية الناتجة عن مجموعة بيانات علم البلورات التسلسلي من أكثر من 9000 نمط حيود ثابت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| القرار (Å) | الاكتمال (٪) | تعدد | I/σ(I) | R انقسام | CC1/2 | ملاحظات فريدة |
| العام | 100 | 95.5 | 20.8 | 0.063 | 0.998 | 8422 |
| الادنى (55.55 - 5.43) | 100 | 147.1 | 81.7 | 0.028 | 0.999 | 488 |
| مرتفع (2.03 -2.00) | 100 | 75.3 | 1.2 | 1.092 | 0.410 | 411 |
الجدول 1: إحصائيات البيانات لمجموعة البيانات التسلسلية VMXi RT. الاختصارات: I = يعني شدة الملاحظات المقاسة. Rsplit = مقياس التناقض في الشدة المقاسة ؛ CC 1/2 = معامل الارتباط بين نصفين عشوائيين من مجموعة البيانات.
Discussion
لقد وصفنا الإجراء الكامل من وصول عينة البروتين في التليف الكيسي إلى تنزيل البيانات النهائية من قبل المستخدم لمزيد من التطبيقات. تتمثل الخطوات الحاسمة في إنتاج عينة بروتين عالية الجودة وشاشات بلورية مناسبة ، إما باستخدام شاشات مصفوفة متفرقة تجارية أو شاشات تحسين بناء على الظروف المحددة. قد تتم هذه العملية في CF ، أو يمكن للمستخدمين تنفيذ إجراءات التبلور في المختبرات المنزلية وإحضار لوحات التبلور المناسبة إلى خط الحزمة. وقد يكون تحديد بارامترات مناسبة لجمع البيانات أمرا مهما بالنسبة لبعض العينات، لا سيما عندما يكون الضرر الإشعاعي مصدر قلق. وفي معظم الحالات، تكون المعالجة الآلية للبيانات كافية تماما للإجابة على السؤال العلمي على الرغم من أن المستعملين يحتفظون بالقدرة على إعادة المعالجة باستخدام أدوات خط الحزمة، على سبيل المثال، عندما تكون المجموعة الفضائية غامضة أو عندما يستخدم الجزء الأولي فقط من البيانات المجمعة لتقليل آثار الضرر الإشعاعي إلى أدنى حد.
إذا لم يتم إنتاج بلورات مناسبة من تجارب التبلور الأولية ، فيمكن استكشاف التغييرات في تركيز البروتين أو نقائه أو شاشات التبلور ، وكذلك استخدام البذر البلوري. إذا لم تنحرف البلورات إلى دقة مفيدة عند خط الشعاع ، فيمكن استخدام عمليات المسح الشبكي مع حزمة غير موهنة لتقييم حد الحيود المتأصل وخلية الوحدة في البلورات لتوجيه جهود التحسين. قد تكون البلورات الصغيرة جدا لجمع البيانات داخل الألواح (على سبيل المثال ، <10 ميكرومتر) مناسبة بدلا من ذلك لتجارب علم البلورات التسلسلي أو التركيز النانوي (على سبيل المثال ، في Diamond beamline VMXm). يعد حل الهياكل باستخدام بيانات VMXi أمرا بسيطا بشكل عام عن طريق الاستبدال الجزيئي ، خاصة منذ ظهور Alphafold16 لإعطاء نماذج بحث فعالة. إذا لم ينجح ذلك ، فقد يتم حصاد البلورات وتبريدها بالتبريد من الألواح لتمكين الحيود الشاذ أحادي الطول الموجي التقليدي ، أو الحيود الشاذ متعدد الطول الموجي ، أو تجارب مراحل الطول الموجي الطويل.
تشمل مزايا هذه الطريقة القدرة على الحصول على مجموعات بيانات سريعة وعالية الجودة وردود فعل مباشرة من لوحات التبلور دون الحاجة إلى إزعاج البلورات من البيئات التي نمت فيها. يضع ما يسمى ب "نهضة درجة حرارة الغرفة" في البيولوجيا الهيكلية علاوة على الهياكل التي يتم الحصول عليها في ظل ظروف غير مبردة لتمكين استكشاف المزيد من الأهمية الفسيولوجية وديناميكيات البروتين2. عادة ، يتم تحقيق دقة أقل قليلا من البلورة المبردة بالتبريد المحسنة ولكن فقط عندما يتم إنشاء ظروف التبريد المناسبة وإذا كانت البلورات قوية للمعالجة الميكانيكية وفتح قطرة التبلور3. التطبيق القادم الذي يناسب خط الأنابيب هذا تماما هو فحص واسع النطاق لمجمعات البروتين أو حملات الشظايا في درجة حرارة الغرفة في اكتشاف الأدوية. يمكن إما تبلور الروابط أو الشظايا أو إضافتها بواسطة ماصة أو طرد قطرة صوتية قبل جمع بيانات درجة حرارة الغرفة. تطبيق آخر هو القياس السريع للبيانات من عدة مئات أو آلاف من البلورات بطريقة عالية الكفاءة ثم استخدام برنامج DIALS17 multiplex14 لاستخراج مجموعات متماثلة الشكل قد تمثل كيانات بيولوجية مختلفة أو لإنشاء اختلافات ذات دلالة إحصائية بين مجموعات البلورات التي عولجت بطريقة مختلفة أو تعرضت لروابط أو إشارات مختلفة.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نقدر العديد من علماء Diamond Light Source وأعضاء فريق الدعم الذين ساهموا في تصميم وبناء وتشغيل خط شعاع VMXi. نحن ممتنون لمستخدمي خطوط الشعاع ، الذين ساهموا بأفكار لاحقا في تطوير خطوط أنابيب التبلور وجمع البيانات. يتم دعم مرفق التبلور في هارويل من قبل Diamond Light Source Ltd ومعهد روزاليند فرانكلين ومجلس البحوث الطبية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
| Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
| Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
| Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
| MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
| Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
| Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request | Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
| Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 | Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |
References
- Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).
- Fischer, M.
- Helliwell, J. R. What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).
- Thorne, R. E. Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).
- Keedy, D. A., et al. Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr. Structure. 22 (6), 899-910 (2014).
- Huang, C. Y., et al. Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).
- Sanchez-Weatherby, J., et al. Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).
- Jacquamet, L., et al. Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam. Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).
- Mikolajek, H., et al. Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi. IUCrJ. 10, 420-429 (2023).
- Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source. Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).
- Delageniere, S., et al. Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. Synchweb: A modern interface for ispyb. Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).
- Jenkins, J., Cook, M. Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology. JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).
- Gildea, R. J., et al. Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).
- Winter, G., Mcauley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
- Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with alphafold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
- Winter, G., et al.
