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Biochemistry

क्रिस्टलीकरण और हार्वेल और बीमलाइन VMXi, डायमंड लाइट सोर्स में क्रिस्टलीकरण सुविधा का उपयोग करके स्वस्थानी कमरे के तापमान डेटा संग्रह में

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/65964
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,2
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

हम हार्वेल में रिसर्च कॉम्प्लेक्स में क्रिस्टलीकरण सुविधा का उपयोग करके प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बाद में डायमंड के बहुमुखी मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी इन सीटू (वीएमएक्सआई) बीमलाइन में प्लेटों के भीतर क्रिस्टल से सीटू एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक डेटा संग्रह में सीटू करते हैं। हम नमूना आवश्यकताओं, क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल और डेटा संग्रह दिशानिर्देशों का वर्णन करते हैं।

Abstract

हार्वेल में क्रिस्टलीकरण सुविधा का उपयोग करके रोबोट प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटोकॉल और डायमंड लाइट सोर्स बीमलाइन वीएमएक्सआई में क्रिस्टलीकरण प्लेटों से सीटू कमरे के तापमान डेटा संग्रह में वर्णित हैं। यह दृष्टिकोण उच्च गुणवत्ता वाले कमरे-तापमान क्रिस्टल संरचनाओं को कई क्रिस्टल से सीधे तरीके से निर्धारित करने में सक्षम बनाता है और क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के परिणामों के साथ-साथ धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी को सक्षम करने के लिए बहुत तेजी से प्रतिक्रिया प्रदान करता है। प्रोटीन संरचना, लिगैंड बाइंडिंग और गतिशीलता को समझने में कमरे के तापमान संरचनाओं का मूल्य संरचनात्मक जीव विज्ञान समुदाय में तेजी से पहचाना जा रहा है। यह पाइपलाइन पहुंच के कई उपलब्ध तरीकों के साथ दुनिया भर के उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ है। क्रिस्टलीकरण प्रयोगों है कि स्थापित कर रहे हैं imaged और क्रिस्टल स्वचालित रूप से एक मशीन सीखने के उपकरण का उपयोग कर पहचान के साथ दूर से देखा जा सकता है. डेटा को एक प्लेट में उपयोगकर्ता-चयनित क्रिस्टल से 60 ° रोटेशन डेटासेट के साथ एक कतार-आधारित प्रणाली में मापा जाता है। किसी विशेष कुएं या नमूना समूह के भीतर सभी क्रिस्टल से डेटा स्वचालित रूप से xia2.multiplex का उपयोग करके विलय कर दिया जाता है, जिसमें आउटपुट सीधे वेब ब्राउज़र इंटरफ़ेस के माध्यम से एक्सेस किया जाता है।

Introduction

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन संरचना और कार्य को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनी हुई है, जो प्रोटीन या उनके परिसरों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को प्रदान करती है, उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट या दवा उम्मीदवार। कई मामलों में, हालांकि, वांछनीय गुणों के साथ क्रिस्टल प्राप्त करना - अत्यधिक विवर्तनशील, क्रिस्टल रूप भिगोने के लिए उत्तरदायी और ट्विनिंग जैसे क्रिस्टल विकृति के बिना - एक काफी अड़चन बनी हुई है1. प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए उपयुक्त रासायनिक स्थितियों के रूप में, सामान्य रूप से, भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है, हजारों संभावित रासायनिक मिश्रणों की खोज करने वाली क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग मानक है, अक्सर निगरानी के लिए स्क्रीन और क्रिस्टल होटल स्थापित करने में स्वचालन / रोबोटिक्स द्वारा सहायता प्राप्त होती है, अक्सर दूर से, क्रिस्टलीकरण ड्रॉप छवियां जो दर्ज की जाती हैं।

जब क्रिस्टल दिखाई देते हैं, तो आमतौर पर उन्हें नायलॉन या कैप्टन लूप का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण वातावरण से काटा जाना चाहिए और फिर, तरल नाइट्रोजन में डुबकी-ठंड से पहले क्रायोप्रोटेक्शन एजेंट (जिसके लिए खोज एक अतिरिक्त चर है) युक्त एक छोटी बूंद में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। क्रिस्टलीकरण और एक्स-रे डेटा संग्रह के बीच इन अतिरिक्त चरणों में क्रिस्टलीकरण ड्रॉप का निर्जलीकरण शामिल हो सकता है जब इसका सील वातावरण टूट जाता है, क्रिस्टल पर यांत्रिक तनाव जब इसे संभाला जाता है, और क्रायोप्रोटेक्शन एजेंटों से क्रिस्टल जाली को नुकसान होता है (आमतौर पर मोज़ेक प्रसार में वृद्धि होती है) अन्य कारकोंके बीच 2. इसके अलावा, क्रिस्टल कटाई समय और श्रम-गहन है और नमूनों के बीच असमानता का कारण बन सकती है, खासकर जब कटाई प्रक्रिया के दौरान त्वचा बूंदों पर बनती है। VMXi बीमलाइन क्रिस्टल से उपयोग करने योग्य डेटा तक पहुंच प्रदान करती है जो प्लेट से चिपके होते हैं, जिसे अन्यथा डेटा संग्रह के लिए छोड़ दिया जाएगा।

एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाओं के विशाल बहुमत को उपरोक्त दृष्टिकोण का उपयोग करके 100K पर निर्धारित किया जाता है, जिससे सीधे क्रिस्टल परिवहन और हैंडलिंग को सक्षम किया जाता है और परिमाण के आदेशों द्वारा एक्स-रे बीम में क्रिस्टल जीवनकाल बढ़ जाता है। हालांकि, गैर-क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत संरचनाओं का निर्धारण करने में रुचि बढ़ रही है, अर्थात, प्रोटीन फ़ंक्शन 2,3,4 के लिए प्रासंगिक शारीरिक स्थितियों के बहुत करीब है। यह प्रोटीन की गतिशील संरचना की एक बेहतर सराहना को सक्षम बनाता है, अमीनो एसिड अनुरूपताओं या छोरों को कार्यात्मक रूप से गैर-प्रासंगिक राज्यों में जमे हुए होने से बचाता है5, और लिगैंड बाइंडिंग को सेल और जीव6 के भीतर प्रोटीन के प्राकृतिक वातावरण में उन लोगों के बहुत करीब की स्थितियों के तहत पता लगाने में सक्षम बनाता है।

डायमंड लाइट सोर्स सिंक्रोट्रॉन, यूके में वर्सटाइल मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी इन सीटू (VMXi) बीमलाइन पर लागू एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, पर्यावरण के भीतर क्रिस्टल से सीधे विवर्तन डेटा को मापना है जिसमें वे बढ़े हैं (यानी, क्रिस्टलीकरण प्लेट के भीतर), परिवेश की परिस्थितियों में और बिना किसी गड़बड़ी के 7,8. यह क्रिस्टलीकरण स्क्रीन और अनुकूलन से बहुत तेजी से प्रतिक्रिया को सक्षम बनाता है ताकि उपयोगकर्ता को उनकी आवश्यकताओं के लिए इष्टतम क्रिस्टल फॉर्म में मार्गदर्शन किया जा सके। यह उच्च गुणवत्ता वाले कमरे-तापमान संरचनाओं को स्वचालित तरीके से उत्पादित करने में सक्षम बनाता है9.

यह प्रोटोकॉल मानता है कि एक उपयोगकर्ता के पास क्रिस्टलीकरण के लिए तैयार एक अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन नमूना है। हम प्रोटीन क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए हार्वेल में क्रिस्टलीकरण सुविधा तक पहुंचने वाले उपयोगकर्ता अनुभव का वर्णन करते हैं और फिर डेटा संग्रह (चित्रा 1) के लिए बीमलाइन वीएमएक्सआई का उपयोग करते हैं।

हार्वेल में क्रिस्टलीकरण सुविधा

हार्वेल (सीएफ) में क्रिस्टलीकरण सुविधा डायमंड लाइट सोर्स से सटे हार्वेल (आरसीएएच) में रिसर्च कॉम्प्लेक्स में स्थित है। यह सुविधा उपयोगकर्ताओं को मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलीकरण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्वचालित प्रयोगशाला प्रदान करती है, जिसमें क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग, क्रिस्टल अनुकूलन, क्रिस्टल इमेजिंग और लक्षण वर्णन के लिए रोबोटिक्स का उपयोग किया जाता है। अत्यधिक स्वचालित वीएमएक्सआई बीमलाइन के साथ घनिष्ठ एकीकरण के माध्यम से, कमरे के तापमान संरचनाओं को निर्धारित करने की गति बहुत तेज हो गई है और उपन्यास प्रोटीन संरचनाओं, प्रोटीन-लिगैंड और डीएनए-लिगैंड परिसरों के साथ-साथ स्वचालित टुकड़ा स्क्रीनिंग (चित्रा 1) के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है, सभी गैर-क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत।

सीएफ पाइपलाइन घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण के लिए नैनोलीटर क्रिस्टलीकरण रोबोट9 को शामिल करने वाले इंस्ट्रूमेंटेशन का एक सूट है, वाणिज्यिक क्रिस्टलीकरण स्क्रीन और जटिल कस्टम ऑप्टिमाइज़ेशन स्क्रीन तैयार करने के लिए तरल हैंडलिंग रोबोट, और चार इमेजिंग उपकरण (4 डिग्री सेल्सियस पर एक और क्रिस्टलीकरण प्लेटों की इमेजिंग के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर तीन) ( सामग्री की तालिका देखें). एक इमेजर लिपिड क्यूबिक चरण (एलसीपी) ग्लास प्लेटों की इमेजिंग करने में सक्षम है और एक इमेजर बहु-प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी (दोनों 20 डिग्री सेल्सियस पर) से लैस है।

यह सुविधा अब व्यापक रूप से शैक्षणिक और औद्योगिक उपयोगकर्ताओं के व्यापक स्पेक्ट्रम द्वारा उपयोग की जाती है, जिसमें झिल्ली प्रोटीन प्रयोगशाला (एमपीएल; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem टुकड़ा स्क्रीनिंग सुविधा 10, MX बीमलाइन, XFEL-हब, साथ ही Rosalind फ्रैंकलिन संस्थान (RFI)। इस अच्छी तरह से स्थापित और अनुकूलित पाइपलाइन ने संरचनात्मक जीव विज्ञान परियोजनाओं के व्यापक स्पेक्ट्रम में क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को सक्षम किया है। यह पेपर VMXi पर डेटा संग्रह के लिए अभिप्रेत क्रिस्टल के लिए पाइपलाइन का वर्णन करता है, हालांकि क्रिस्टल को काटा भी जा सकता है और क्रायो-कूल्ड किया जा सकता है या XChem पाइपलाइन को निर्देशित किया जा सकता है।

उपयोगकर्ता पहुंच डायमंड एमएक्स प्रस्ताव प्रणाली (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) के माध्यम से आवंटित की जाती है और औद्योगिक उपयोगकर्ताओं को डायमंड उद्योग संपर्क समूह के माध्यम से समर्थित किया जाता है। सभी उपयोगकर्ता अपने नमूने या प्लेटों के साथ साइट पर आ सकते हैं, जिन्हें हाथ से ले जाया जा सकता है। कूरियर द्वारा प्लेटों को भेजने की अनुशंसा नहीं की जाती है क्योंकि हमारे अनुभव से पता चलता है कि बूंदें उस स्थान से दूर जा सकती हैं जिसमें उन्हें तिरस्कृत किया गया था, या क्रिस्टलीकरण जलाशय द्वारा बूंदें क्षतिग्रस्त हो सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, व्यवस्था द्वारा, उपयोगकर्ताओं को सीएफ के लिए अपने प्रोटीन के नमूने भेज सकते हैं, जहां कर्मचारियों के सदस्यों को उनकी ओर से क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की स्थापना. प्रयोगों को उपयोगकर्ता द्वारा दूर से मॉनिटर किया जा सकता है या तो CF के मामले में रॉक मेकर वेब पर लॉग इन करके या VMXi के मामले में ISPyB के माध्यम से। सीएफ तक पहुंच डायमंड में एकत्र एक्स-रे विवर्तन परिणामों के आधार पर एक पुनरावृत्त फैशन में की जा सकती है।

डायमंड लाइट सोर्स पर बीमलाइन VMXi

बीमलाइन वीएमएक्सआई (इसके बाद "बीमलाइन" के रूप में संदर्भित) एक अद्वितीय और हाल ही में विकसित उपकरण है जो पूरी तरह से कमरे के तापमान के लिए समर्पित है, उपयुक्त क्रिस्टलीकरण प्लेटों के भीतर क्रिस्टल से डेटा को मापने पर ध्यान देने के साथ अत्यधिक स्वचालित एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी है। बीमलाइन एक माइक्रो फोकस (10 x 10 माइक्रोन), गुलाबी बीम (<5 × 10-2ΔE/E का बैंड पास) ~ 2 × 1013 फोटॉन/एस (16 KeV पर)7 के उच्च प्रवाह के साथ प्रदान करता है। यह उच्च प्रवाह बीम, एक तेज डिटेक्टर के साथ मिलकर, नमूनों के बहुत उच्च थ्रूपुट और आकार में 10 माइक्रोन से ऊपर के नमूनों से डेटा के संग्रह को सक्षम बनाता है।

क्रिस्टलीकरण प्लेटें एक नमूना भंडारण प्रणाली में संग्रहीत करके बीमलाइन में प्रवेश करती हैं और ISPyB11 इंटरफ़ेस SynchWeb12 का उपयोग करके प्लेटों को पंजीकृत करते समय उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान की गई अनुसूची के आधार पर इमेज की जाती हैं। आमतौर पर, उपयोगकर्ताओं को इमेजिंग के लिए समय बिंदुओं के फाइबोनैचि अनुक्रम का चयन करने की सलाह दी जाती है (0, 12, 24, 36, 60... सिस्टम में दर्ज की जा रही प्लेट से 7,320 घंटे)। एक बार प्लेट को इमेज करने के बाद उपयोगकर्ता को ईमेल द्वारा सूचित किया जाता है। दोनों दृश्य प्रकाश और यूवी प्रकाश इमेजिंग मांग पर उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं। नमूना भंडारण प्रणाली द्वारा ली गई छवियों का विश्लेषण मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म द्वारा किया जाता है; यह स्वचालित रूप से उन वस्तुओं के हित के बिंदुओं का पता लगाता है और परिभाषित करता है जो क्रिस्टल से मिलते जुलते हैं और उपयोगकर्ता के लिए डेटा संग्रह के लिए कतार में जोड़ने के लिए तैयार रुचि के बिंदुओं को पंजीकृत करते हैं। उपयोगकर्ता रुचि के बिंदुओं को पंजीकृत करने के लिए दृश्यमान प्रकाश छवियों पर मैन्युअल रूप से क्लिक कर सकते हैं या रेखापुंज स्कैन द्वारा विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र को क्लिक और खींच सकते हैं। ये बिंदु उपयोगकर्ताओं के लिए स्वचालित रूप से स्थित बिंदुओं के साथ कतार में जोड़ने के लिए उपलब्ध हैं।

एक बार सभी नमूनों में डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त पैरामीटर होते हैं, प्लेट एक कतार में प्रवेश करती है। जब प्लेट कतार के शीर्ष पर पहुंच जाती है, तो यह स्वचालित रूप से बीमलाइन तक फैल जाती है। क्रिस्टलीकरण प्लेटों को क्रिस्टल होटलों से रोबोटिक बांह द्वारा स्वचालित रूप से बीमलाइन में लोड किया जाता है, और छवि मिलान के बाद, उपयोगकर्ता परिभाषित निर्देशों के अनुसार प्रत्येक चयनित क्रिस्टल से 60 डिग्री रोटेशन तक के क्रिस्टलोग्राफिक डेटा सेट को मापा जाता है। एक प्लेट के भीतर सभी बूँदें बीमलाइन पर इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. डेटा को आइसोमोर्फस, बेहतर रूप से मर्ज किए गए डेटा सेट को स्वचालित तरीके से 7,9 का उत्पादन करने के लिए कई क्रिस्टल से विलय कर दिया जाता है। एक बार सभी कतारबद्ध डेटा सेट एकत्र हो जाने के बाद, उपयोगकर्ता को ISPyB11 में डेटा सेट देखने के लिए अनुसरण करने के लिए एक लिंक के साथ एक ईमेल भेजा जाता है, जैसा कि अन्य डायमंड एमएक्स बीमलाइन में होता है। उपयोगकर्ताओं को बीमलाइन वेब पेज (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html) पर भी निर्देशित किया जाता है।

Protocol

1. हार्वेल में क्रिस्टलीकरण सुविधा का उपयोग करके सीटू प्लेटों में क्रिस्टल का उत्पादन

नोट: सीएफ तक पहुंच कई अलग-अलग मार्गों द्वारा समर्थित है और परियोजना और उपयोगकर्ता प्रकार (अकादमिक या उद्योग) के आवेदन पर निर्भर करती है। XChem और MPL परियोजनाओं का उपयोगकर्ता प्रशासन प्रणाली (UAS) के माध्यम से अपना प्रस्ताव आवेदन प्रणाली है और इसे या तो मानक एक्सेस मार्ग (iNEXT डिस्कवरी और EUbOPEN सहित) या BAG एक्सेस के माध्यम से प्रस्तुत किया जा सकता है। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल VMXi उपयोगकर्ताओं के लिए विशिष्ट है।

  1. प्रस्ताव प्रस्तुत करना और यात्रा की तैयारी
    1. बीएजी प्रस्ताव आवेदन को परियोजना के बारे में जानकारी प्रदान करें या इसे एक सक्रिय बीएजी प्रस्ताव में जोड़ें। आमतौर पर एक बीएजी समन्वयक होता है, जो कागजी कार्रवाई का आयोजन करता है। वैकल्पिक रूप से, बीमलाइन तक पहुंच के लिए एक त्वरित पहुंच प्रस्ताव प्रस्तुत करें।
    2. सुनिश्चित करें कि नमूना पंजीकृत किया गया है और कूरियर द्वारा या व्यक्तिगत रूप से साइट पर आने से पहले एक प्रस्ताव पर यूएएस में सुरक्षा मान्य है।
    3. सुनिश्चित करें कि उपयोगकर्ता पंजीकृत है (FedID और पासवर्ड के साथ)।
    4. सुनिश्चित करें कि उपयोगकर्ता को BAG समन्वयक द्वारा UAS में एक सहयोगी के रूप में MX प्रस्ताव में जोड़ा गया है।
    5. बीमलाइन क्रिस्टलीकरण नमूना विवरण फॉर्म को पूरा करें और फॉर्म को VMXi@diamond.ac.uk पर भेजें।
    6. प्रयोग आवश्यकताओं और बीमलाइन उपलब्धता के बारे में बीमलाइन कर्मचारियों के साथ संवाद करें।
    7. यदि प्रोटीन के नमूने भेज दिए जाते हैं, तो केवल पूर्व व्यवस्था द्वारा नमूने भेजें। विवरण के लिए खंड 1.2 देखें।
    8. यदि उपयोगकर्ता को सीएफ में क्रिस्टलीकरण प्लेटें स्थापित करने के लिए साइट पर आना है, तो सुविधा उपकरण का उपयोग करने के लिए समय स्लॉट की उपलब्धता के बारे में सुविधा कर्मचारियों से जांच करें और धारा 1.2.1 का पालन करें।
    9. यदि उपयोगकर्ता साइट पर प्लेटें लाता है, तो सुनिश्चित करें कि नमूना सही प्लेट प्रकार में तिरस्कृत है और क्रिस्टलीकरण बूंदों को सही स्थान और सही मात्रा में रखें। अनुभाग 1.2.2 का पालन करें। बीमलाइन केवल सीटू क्रिस्टलीकरण प्लेटों (ग्रीनर क्रिस्टलक्विकएक्स और मिटेजेन इन सीटू -1) में विशिष्ट स्वीकार करती है; सुनिश्चित करें कि बूंदें 200 एनएल से बड़ी नहीं हैं।
  2. सीएफ में आयोजित क्रिस्टलीकरण प्रयोग
    नोट: यह सुविधा कई उच्च-थ्रूपुट मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलीकरण विधियों जैसे वाष्प प्रसार के साथ-साथ तेल और एलसीपी के तहत बैच क्रिस्टलीकरण प्रदान करती है। शुद्ध प्रोटीन के 70-100 माइक्रोन के साथ शुरू करने और प्रोटीन समाधान के 100 एनएल और क्रिस्टलीकरण जलाशय समाधान के 100 एनएल के अनुपात का उपयोग करके तीन स्क्रीन के साथ घुलनशील प्रोटीन के लिए वाष्प प्रसार प्रयोग करने और प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की सिफारिश की जाती है। सुविधा के भीतर कई वाणिज्यिक स्क्रीन उपलब्ध हैं। आर्द्रता और तापमान नियंत्रण 4 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस के साथ उपलब्ध हैं जो सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं। सीएफ पर जाने वाले उपयोगकर्ता मानकीकृत प्रशिक्षण प्राप्त करते हैं और क्रिस्टलीकरण इंस्ट्रूमेंटेशन के संचालन का समर्थन करते हैं और यहां वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करेंगे।
    1. सीएफ में स्थापित करने के लिए शिपिंग नमूने
      नोट: साइट पर आने से पहले, प्रोटीन नमूना यूएएस प्रणाली के भीतर एक प्रस्ताव पर मान्य किया जाना चाहिए था। एक बार प्रोटीन का नमूना साइट पर आ जाने के बाद, कर्मचारियों के सदस्य उपयोगकर्ता के साथ पिछले संचार में निर्देश के अनुसार क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्थापित करेंगे। पुष्टि प्रयोगात्मक क्रिस्टलीकरण प्लेटों के लिए बारकोड जानकारी के साथ ई-मेल के माध्यम से भेजा जाएगा. उपयोगकर्ता को क्रिस्टलीकरण प्लेटों को संबंधित प्रस्ताव में कंटेनर के रूप में जोड़ने के लिए कहा जाएगा। एक बार यह हो जाने के बाद, प्लेटों को क्रिस्टलीकरण सुविधा में या बीमलाइन पर स्वचालित इमेजर्स में संग्रहीत किया जा सकता है। ISPyB बीमलाइन पर बातचीत के लिए उपयोग किया जाने वाला इंटरफ़ेस होगा।
      1. 25 μL एलिकोट के गुणकों में क्रिस्टलीकरण के लिए एकाग्रता पर प्रोटीन नमूना समाधान प्रदान करें। स्पष्ट रूप से प्रोटीन नमूना युक्त नमूना ट्यूबों लेबल.
      2. यदि आवश्यक हो, तो एक प्रोटीन बफर समाधान, लिगैंड समाधान, या जलाशय समाधान प्रदान करें।
      3. सुविधा कर्मचारियों को सूचित करें कि कौन सी स्क्रीन और ड्रॉप अनुपात का उपयोग किया जाना चाहिए।
    2. क्रिस्टलीकरण प्लेट सेटिंग्स
      नोट: हमें किसी विशेष स्थान पर होने के लिए ग्रीनर क्रिस्टलक्विकएक्स और मिटेजेन इन सीटू -1 प्लेट में क्रिस्टलीकरण बूंदों की आवश्यकता होती है; कहीं और स्थापित प्लेटों को यहां वर्णित निम्नलिखित मच्छर13 सेटिंग्स का उपयोग करना चाहिए।
      1. MiTeGen के लिए प्लेट परिभाषा को समायोजित करने के लिए सीटू -1 में, मच्छर एसपीटी सॉफ्टवेयर खोलें और सेटअप पर क्लिक करके मानक MiTeGen इन सीटू-1 प्लेट परिभाषा पृष्ठ पर क्लिक करें | 96 कुआं | MiTeGen इन सीटू-1 (96 x 2 बूँदें) (चित्रा 2A)। संपादन बटन पर क्लिक करें और उप अच्छी तरह से 2 स्थान के लिए मूल्यों में संशोधन: एक्स ऑफसेट करने के लिए - 1.2 और वाई ऑफसेट करने के लिए 1.8 और उप अच्छी तरह से 3 स्थान के लिए: एक्स 1.3 करने के लिए ऑफसेट और वाई 1.8 (चित्रा 2 बी, सी) के लिए ऑफसेट.
      2. ग्रीनर क्रिस्टलक्विकएक्स के लिए प्लेट परिभाषा को समायोजित करने के लिए, मच्छर एसपीटी सॉफ्टवेयर खोलें और सेटअप पर क्लिक करके मानक ग्रीनर क्रिस्टलक्विकएक्स प्लेट परिभाषा पृष्ठ पर क्लिक करें | 96 अच्छी तरह से | ग्रीनर क्रिस्टलक्विकएक्स (चित्रा 2 डी)। संपादन बटन पर क्लिक करें और उप अच्छी तरह से 1 स्थान के लिए मूल्यों में संशोधन करें: एक्स ऑफसेट टू - 1.95 और वाई ऑफसेट 1.45 और उप वेल 2 स्थान के लिए: एक्स ऑफसेट 1.95 और वाई ऑफसेट 1.45 (चित्रा 2ई, एफ)।

2. डायमंड लाइट सोर्स पर बीमलाइन का उपयोग करना

नोट: उपयोगकर्ताओं द्वारा बीमलाइन के साथ सभी इंटरैक्शन ISPyB11 इंटरफ़ेस का उपयोग करके दूरस्थ रूप से आयोजित किए जाते हैं। बीमलाइन पर कोई भौतिक उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है और किसी विशेष समय पर निर्धारित होने के बजाय कतार-आधारित प्रणाली का उपयोग करके डेटा एकत्र किया जाता है। उपयोगकर्ताओं के पास उनके डायमंड लाइट सोर्स एक्सेस से जुड़ा एक प्रस्ताव होगा। बीमलाइन पर, प्रत्येक क्रिस्टलीकरण प्लेट को एक अद्वितीय यात्रा आवंटित की जाती है और इसे ISPyB11 के भीतर एक 'कंटेनर' के रूप में परिभाषित किया जाता है, जो 100 K पर नमूने वाले पक के अनुरूप होता है। अनुकूलन स्क्रीन को SynchWeb इंटरफ़ेस का उपयोग करके नहीं बनाया जा सकता है और इस तरह, जानकारी आमतौर पर टिप्पणी अनुभाग में जोड़ी जाती है (चरण 2.1.4 देखें। प्लेट को पंजीकृत करने वाले व्यक्ति को ईमेल पते की जांच करने की आवश्यकता होगी क्योंकि प्लेट मालिक को इमेजिंग के साथ-साथ प्लेट पूर्ण सूचनाओं के बारे में ईमेल प्राप्त होंगे।

  1. प्लेटों का पंजीकरण
    1. एक उपयुक्त डायमंड FedID के साथ ISPyB में लॉग इन करें और प्रस्तावों का चयन करें। खोज बार में प्रस्ताव संख्या स्क्रॉल या टाइप करके रुचि के प्रस्ताव की खोज करें। प्रस्ताव संख्या (चित्रा 3 ए) के तहत ड्रॉपडाउन मेनू से शिपमेंट का चयन करें, जो उस प्रस्ताव में शिपमेंट के साथ शिपमेंट विंडो खोलेगा। नई शिपमेंट विंडो जोड़ने के लिए शीर्ष दाईं ओर +शिपमेंट जोड़ें (चित्र 3B) पर क्लिक करें, शिपमेंट को एक नाम दें, स्वचालित/इमेजर पर क्लिक करें, और फिर नीचे-बाएँ (चित्र 3C) पर शिपमेंट जोड़ें बटन पर क्लिक करें।
    2. शिपमेंट विंडो (चित्रा 3 डी) में, + कंटेनर जोड़ें, जो तब कंटेनर पृष्ठ दृश्य (चित्रा 3ई) जोड़ें प्रदर्शित करेगा पर क्लिक करें। कंटेनर प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू में प्रासंगिक प्लेट प्रकारों में से कोई एक चुनें। पृष्ठ चुने गए कंटेनर प्रकार को प्रतिबिंबित करने के लिए बदल जाएगा। प्रयोगात्मक प्लेटों के लिए विशिष्ट बीमलाइन कर्मचारियों से ईमेल निर्देशों के अनुसार एक बारकोड और कंटेनर नाम दर्ज करें। ध्यान दें कि यह केस-संवेदी है।
    3. अनुरोधित इमेजर ड्रॉपडाउन मेनू से VMXi 20 °C इमेजर का चयन करें, इमेजिंग शेड्यूल ड्रॉपडाउन मेनू से फाइबोनैचि इमेजिंग शेड्यूल, क्रिस्टलीकरण स्क्रीन ड्रॉपडाउन मेनू से क्रिस्टलीकरण स्क्रीन, और मालिक ड्रॉपडाउन मेनू से उपयोगकर्ता नाम, व्यू बटन पर क्लिक करें, और ईमेल बॉक्स (चित्रा 3F) में सही संपर्क ईमेल पता दर्ज करें।
    4. टिप्पणियाँ बॉक्स में प्लेट के बारे में अधिक विवरण दर्ज करें। प्रोटीन ड्रॉपडाउन मेनू से प्रासंगिक नमूने का चयन करें, और यूएएस में पंजीकृत संक्षिप्त नाम का उपयोग करें और प्रयोगात्मक प्रस्ताव के भीतर डायमंड द्वारा अनुमोदित करें। नमूना नाम बॉक्स में समान नाम दर्ज करें; शेष बक्से खाली छोड़ दें।
    5. पूरी प्लेट पर नमूना दोहराने के लिए + प्लेट आइकन पर क्लिक करें और पूरे कंटेनर को हरे वर्गों के साथ आबाद करें। प्लेट को पंजीकृत करने के लिए पृष्ठ के निचले भाग में +कंटेनर जोड़ें पर क्लिक करें। बीमलाइन पर कर्मचारियों के एक सदस्य से प्लेट को उपयुक्त इमेजर में स्थानांतरित करने के लिए कहें, जहां इसे संग्रहीत और इमेज किया जाएगा। कंटेनर को इमेजर्स में संग्रहीत करने पर एक विज़िट उत्पन्न होगी और उपयोगकर्ता को प्लेट और उसकी छवियों के लिंक के साथ एक ईमेल प्राप्त होगा।
  2. इमेजिंग परिणाम देखना
    1. ब्याज के प्रस्ताव (चरण 2.1.1) पर नेविगेट करें, प्रस्ताव संख्या के तहत ड्रॉपडाउन मेनू से कंटेनर का चयन करें, और प्रस्ताव के लिए उपलब्ध कंटेनरों की सूची का निरीक्षण करें। फिल्टर प्लेट्स का चयन करें यदि अन्य नमूना धारक प्रकार मौजूद हैं. खोज को और संकीर्ण करने के लिए, केवल वर्तमान लॉग-इन उपयोगकर्ता आईडी से जुड़े सबसे प्रासंगिक कंटेनर प्रदर्शित करने के लिए मेरे कंटेनर बॉक्स को चेक करें। कर्सर को अलग-अलग लाइन पर ले जाकर और माउस पर बायाँ-क्लिक करके उपयुक्त कंटेनर पर क्लिक करें।
    2. कंटेनर का चयन करने पर, एक नया दृश्य प्रस्तुत किया जाएगा, जिसमें प्लेट का अवलोकन दिखाया जाएगा (चित्र 4ए)। उस संबंधित ड्रॉप से सबसे हाल की छवि दिखाने के लिए प्रदर्शन के बाईं ओर प्लेट प्रतिनिधित्व में एक बूंद पर क्लिक करें। बूंदों के बीच नेविगेट करने के लिए तीर कुंजियों का उपयोग करें, या माउस/कर्सर का उपयोग करके अलग-अलग बूंदों का चयन करें।
    3. एक बूंद की ऐतिहासिक छवियों को देखने के लिए, एच बटन पर क्लिक करें और वर्तमान अच्छी तरह से ड्रॉप छवि पर प्रदर्शित करने के लिए छवियों की पॉपअप गैलरी की प्रतीक्षा करें। मुख्य ड्रॉप छवि को अपडेट करने के लिए अलग-अलग छवियों पर कर्सर घुमाएं।
    4. 0 - 9 बटन दबाकर प्रत्येक ड्रॉप की स्थिति को इंगित करने के लिए छवियों को स्कोर करें। अलग-अलग श्रेणियां देखने के लिए, ड्रॉपडाउन मेनू खोलें स्कोर ड्रॉप छवि के ऊपरी-बाईं ओर। प्रत्येक ड्रॉप छवियों में नीले क्रॉस की तलाश करें, जो छवियों के भीतर "क्रिस्टल" देखने के लिए प्रशिक्षित एल्गोरिथ्म (CHiMP) का परिणाम हैं।
    5. मापने के उपकरण तक पहुंचने के लिए ड्रॉप छवि के ऊपरी दाईं ओर माप नामक तीसरे आइकन बटन पर क्लिक करें। इस उपकरण का उपयोग करने के लिए, एक रेखा को क्लिक करें और खींचें, और एक शासक विस्तार करेगा और दूरी को माइक्रोन में देगा।
    6. अतिरिक्त इमेजिंग सत्र का अनुरोध करने के लिए, पृष्ठ के निचले भाग की ओर जाने वाली कार्रवाइयों के निकट स्थित ड्रॉपडाउन बॉक्स से दृश्यमान या UV पर क्लिक करें. फिर, अनुरोध प्लेट इमेजिंग बटन पर क्लिक करें।
  3. क्रिस्टल चयन/CHiMP
    1. मैन्युअल रूप से डेटा संग्रह के लिए अंक जोड़ने के लिए, + मार्क पॉइंट बटन दबाएं। वांछित रुचि के बिंदु पर कर्सर घुमाएं और चुनें। लाल क्रॉस के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें।
      नोट: प्रति ड्रॉप 100 ऑब्जेक्ट तक बनाए जा सकते हैं।
    2. जब सभी बिंदु चिह्नित हो जाएं, तो +समाप्त बटन पर क्लिक करें। वस्तुओं को मापने का प्रयास करने से पहले + समाप्त बटन पर भी क्लिक करना याद रखें। ग्रिड स्कैन के माध्यम से डेटा संग्रह के लिए क्षेत्रों को जोड़ने के लिए, + चिह्नित क्षेत्र बटन पर क्लिक करें। ऊपरी बाएँ हाथ बिंदु पर क्लिक करें और नीचे खींचें और सही एक क्षेत्र है कि रेखापुंज beamline पर स्कैन किया जाएगा बनाने के लिए. बिंदुओं के साथ, क्लिक करें + समाप्त बटन जब सभी वांछित क्षेत्र बनाए जाते हैं।
      नोट: कई छोटे क्षेत्रों की तुलना में एक बड़ा क्षेत्र बनाना बेहतर है।
    3. ड्रॉप छवियों पर पहले से ही नीले क्रॉस का निरीक्षण करें, जो स्वचालित रूप से क्रिस्टलीय वस्तुओं (CHiMP) का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किए गए एल्गोरिथ्म का परिणाम हैं। क्रिस्टलीकरण बूंदों के CHiMP मूल्यांकन की कल्पना करने के लिए, चेकबॉक्स पर क्लिक करें ऑटो स्कोर दिखाएं और फिर कक्षा के लिए ड्रॉपडाउन मेनू बदलें। आमतौर पर, यहां सबसे उपयोगी सेटिंग क्रिस्टल विकल्प (चित्रा 4 बी) है।
      नोट: यह एक नई सुविधा है और यह सभी क्रिस्टल को खोजने की गारंटी नहीं है और अन्य वस्तुओं को भी मिल सकता है जो क्रिस्टल नहीं हैं।
    4. जब सभी बिंदुओं और क्षेत्रों को संबंधित बूंदों में चिह्नित किया गया है, तो पृष्ठ के निचले भाग में डेटा संग्रह के लिए तैयार करें बटन पर क्लिक करें।
  4. डेटा संग्रह के लिए नमूने तैयार करना
    1. पिछले चरण में चयनित बिंदुओं या क्षेत्रों वाले नमूनों की सूची का निरीक्षण करें, या स्वचालित रूप से स्थित (चित्रा 4सी)। + बटन दबाकर अलग-अलग बिंदु या क्षेत्र जोड़ें या वर्तमान पृष्ठ को कतार में जोड़ें बटन पर क्लिक करके सभी प्रदर्शित नमूने जोड़ें।
    2. फ़िल्टर केवल बिंदु, क्षेत्र, ऑटो बिंदु या मैनुअल बिंदु दिखाने के लिए उपलब्ध हैं। केवल उन नमूनों को दिखाने के लिए जिन्हें शूट नहीं किया गया है (यानी, एक्स-रे के संपर्क में), फ़िल्टर बटन के ऊपर डेटा के बिना और पूर्ण नहीं विकल्प पर क्लिक करें।
    3. संबंधित लाइन पर क्लिक करके अलग-अलग नमूनों का चयन करें और सही ड्रॉप और व्यक्तिगत बिंदु दिखाने के लिए स्क्रीन के दाईं ओर छवि को अपडेट करें। यदि सूची में कई नमूने हैं, तो ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करके प्रति पृष्ठ प्रदर्शित नमूनों की संख्या बढ़ाएं, जिसमें डिफ़ॉल्ट रूप से 10 और प्रदर्शित नमूनों की अधिकतम संख्या 100 तक हो।
    4. एक बार सभी अंक और क्षेत्रों कतार में जोड़ा गया है, सुनिश्चित करें कि सभी प्रयोगात्मक डेटा संग्रह मापदंडों प्रत्येक प्रयोग के साथ जुड़े रहे हैं.
      1. Point, Region, Manual और Auto के लिए फ़िल्टर का उपयोग करें. प्वाइंट फिल्टर पर क्लिक करें और वर्तमान कतारबद्ध नमूने सूची में दिखाई देने वाले सभी नमूनों पर मापदंडों को एक साथ लागू करने के लिए फ़िल्टर बटन के नीचे सभी चेकबॉक्स का चयन करें पर क्लिक करें।
      2. ड्रॉप फोटो(चित्रा 4डी)के नीचे स्क्रीन के दाईं ओर ड्रॉपडाउन मेनू से प्रयोगात्मक मापदंडों का चयन करें। क्षेत्रों के लिए, ग्रिड स्कैन डीएमएम 10 माइक्रोन चरणों, 100 प्रतिशत ट्रांसमिशन के विकल्प का चयन करें। अन्य सभी बिंदु प्रयोगों के लिए, ड्रॉपडाउन मेनू से उपयुक्त अन्य विकल्पों का चयन करें।
      3. दोलन डेटा संग्रह के लिए, एक व्यक्तिगत नमूने से डेटा की अधिकतम मात्रा एकत्र करने के लिए ओमेगा स्कैन डीएमएम 60 डिग्री 5 प्रतिशत ट्रांसमिशन विकल्प पर क्लिक करें। बहुत छोटे क्रिस्टल या विकिरण-संवेदनशील नमूनों के लिए छोटे घुमाव लागू करें और एक विशेष क्रिस्टल रूप के साथ पूर्व अनुभव के आधार पर संचरण को भिन्न करें। एक बार सभी नमूनों प्रयोगात्मक पैरामीटर सही ढंग से लागू किया है, पृष्ठ के नीचे कतार कंटेनर बटन पर क्लिक करें.
    5. एक बार जब प्लेट कतार के शीर्ष पर पहुंच जाती है, तो इसे बीमलाइन पर प्रस्तुत किया जाएगा, डेटासेट एकत्र किए जाएंगे, और फिर यह बीमलाइन के भीतर नमूना भंडारण में वापस आ जाएगा। एक बार प्लेट से डेटा संग्रह पूरा हो जाने के बाद, प्रासंगिक डेटा तक पहुंचने के लिए अनुसरण करने के लिए एक लिंक के साथ एक ईमेल देखें।
  5. नमूना समूह बनाना
    नोट: नमूना समूहों को कई बूंदों या प्लेटों में समान नमूनों को समूहित करने के लिए बनाया जा सकता है। इन नमूना समूहों के भीतर सभी डेटासेट को डायल द्वारा संसाधित किए जाने के बाद xia2.multiplex14 पाइपलाइन का उपयोग करके संसाधित किया जाएगा। डेटा के कई बहुत छोटे वेजेज एकत्र करते समय यह उपयोगी हो सकता है और लिगैंड-बाइंडिंग प्रयोगों के लिए सिग्नल-टू-शोर बढ़ाने के लिए भी उपयोगी हो सकता है।
    1. प्रस्ताव संख्या के तहत ड्रॉपडाउन मेनू से नमूना समूह प्रबंधन का चयन करें। समूहों की एक सूची देखें यदि वे पहले से ही अन्य उपयोगकर्ताओं द्वारा बनाए गए हैं। नया समूह जनरेट करने के लिए, +नमूना समूह बनाएँ बटन क्लिक करें. नमूना व्यूअर (चित्रा 5 ए) देखने के लिए नमूना समूह पृष्ठ पर ड्रॉपडाउन मेनू से एक शिपमेंट पर क्लिक करें। उस कंटेनर पर क्लिक करें जिसमें पॉप्युलेट की गई सूची से प्रासंगिक नमूने हैं।
    2. जब एक कंटेनर पर क्लिक किया गया है, तो प्लेट अवलोकन दिखाने वाले ग्राफिक की तलाश करें।
    3. अलग-अलग ड्रॉप (चित्रा 5 बी) पर क्लिक करके व्यक्तिगत रूप से बूँदें पर क्लिक करें या प्रासंगिक पंक्ति पत्र या स्तंभ संख्या पर क्लिक करके पंक्तियों या स्तंभों में बूंदों पर क्लिक करें। जब किसी व्यक्तिगत समूह से संबद्ध सभी कुओं का चयन कर लिया जाता है, तो नमूना समूह का नाम बॉक्स में समूह के लिए कोई नाम दर्ज करें, और नमूना समूह सहेजें बटन क्लिक करें. प्रस्ताव (चित्रा 5 सी) से जुड़े पहले से उत्पन्न नमूना समूहों की सूची पर लौटने के लिए इस पृष्ठ पर नमूना समूह देखें बटन पर क्लिक करें।
  6. नमूना समूहों को संपादित करना
    1. नमूना समूह प्रबंधन पृष्ठ पर समूहों की सूची से किसी नमूना समूह पर क्लिक करें.
    2. समूह जानकारी (चित्रा 5 सी) के नीचे दिखाई देने वाले कंटेनरों से सटे नमूना समूह बटन पर क्लिक करें।
    3. बूंदों का निरीक्षण करें, पहले से ही एक नमूना समूह के साथ जुड़ा हुआ है, प्लेट अवलोकन पर प्रकाश डाला गया।
    4. पहले की तरह बूंदों, कुओं या स्तंभों पर क्लिक करके नमूना समूह में अधिक बूँदें जोड़ें।
      नोट: बूँदें एक नमूना समूह से हटाया नहीं जा सकता।
    5. एक बार अतिरिक्त बूँदें जोड़ दिया गया है, नमूना समूह का नाम संपादित करें और तब इसे सहेजें, या बस नमूना समूह सहेजें बटन क्लिक करके इसे सहेजें।
  7. नमूना समूहों के आउटपुट की कल्पना और विश्लेषण करना
    1. समूह से संबद्ध कंटेनर या कंटेनरों का प्लेट अवलोकन प्रदर्शित करने के लिए नमूना समूहों की सूची में से किसी व्यक्तिगत समूह पर क्लिक करें. समूह में शामिल बूंदों को इस प्रदर्शन(चित्रा 5डी)पर हाइलाइट किया जाएगा।
    2. कालानुक्रमिक अंतिम तीन मल्टीप्लेक्स नौकरियों वाली एक सूची देखें यदि इस समूह में डेटा एकत्र किया गया है।
    3. नीचे दिए गए प्रसंस्करण परिणामों को अपडेट करने के लिए मल्टीप्लेक्स रन के लिए लाइन पर क्लिक करें।
    4. त्वरित लिंक बटन का निरीक्षण करें, जो समूह से जुड़े डेटासेट की संख्या दिखाता है। व्यक्तिगत डेटासेट संग्रह प्रदर्शित करने वाला एक नया डेटा संग्रह पृष्ठ खोलने के लिए इस बटन पर क्लिक करें।

3. स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग तक पहुँचना

नोट: एक बार डेटा एकत्र हो जाने के बाद, उन्हें कई स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइनों के माध्यम से पारित किया जाता है। डायमंड में एमएक्स बीमलाइन में उपयोग की जाने वाली चार मानक पाइपलाइनें भी बीमलाइन पर एकत्र किए गए डेटा पर चलती हैं। वे 'fast_dp', 'xia2 डायल', 'xia2 3dii,' और 'autoPROC'15 हैं। 'fast_dp' गुणवत्ता का तेजी से आकलन करने के लिए तेजी से डेटा कमी प्रदान करेगा। अन्य तीन पाइपलाइनों को अधिक गणना समय की आवश्यकता होगी और तुलना के लिए विभिन्न डेटा कमी सॉफ्टवेयर पैकेज चलाएंगे। तदनुसार, आउटपुट आमतौर पर 'fast_dp' आउटपुट की तुलना में उच्च गुणवत्ता का होता है। बीमलाइन पर एकत्र किए गए डेटासेट स्वचालित मल्टी-क्रिस्टल मर्जिंग सॉफ्टवेयर 'xia2.multiplex'14 के माध्यम से भी चलेंगे, जो एक परिभाषित समूह के भीतर सभी डेटासेट को मर्ज कर देगा। ध्यान दें कि ग्रिड स्कैन वर्तमान में स्वचालित रूप से संसाधित नहीं होते हैं, डेटा को 'xia2.ssx' पाइपलाइन का उपयोग करके मैन्युअल रूप से संसाधित किया जा सकता है। स्वचालित प्रसंस्करण पाइपलाइनों के परिणाम निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके ISPyB11 में पाए जा सकते हैं।

  1. डेटासेट का पता लगाना
    1. ऊपर वर्णित के रूप में ISPyB में लॉग इन करें और प्रस्तावों का चयन करें।
    2. खोज बार में प्रस्ताव संख्या स्क्रॉल या टाइप करके रुचि के प्रस्ताव की खोज करें।
    3. उस विज़िट के लिए डेटा संग्रह विंडो तक पहुँचने के लिए स्क्रीन पर दिखाई देने वाली सूची से वांछित विज़िट पर क्लिक करें।
    4. कोई भी वांछित फ़िल्टर लागू करें।
      नोट: एक लोकप्रिय फ़िल्टर 'ऑटो एकीकृत' फ़िल्टर है, जो केवल उन डेटासेट को प्रदर्शित करेगा जो एक या अधिक प्रसंस्करण पाइपलाइनों के माध्यम से सफलतापूर्वक चले गए हैं। यह ग्रिड स्कैन को बाहर कर देगा क्योंकि ये वर्तमान में ISPyB के माध्यम से स्वचालित रूप से संसाधित नहीं होते हैं।
    5. रुचि का डेटासेट खोजने के लिए पृष्ठ को नीचे स्क्रॉल करें।
      नोट: प्रत्येक डेटासेट नमूना आईडी, उपयोग किए गए प्रयोगात्मक पैरामीटर, एक विवर्तन छवि दर्शक, एक क्रिस्टल छवि दर्शक और डेटा गुणवत्ता के त्वरित अवलोकन के लिए एक प्रति-छवि विश्लेषण प्लॉट प्रदर्शित करेगा।
  2. ऑटो प्रोसेसिंग परिणामों तक पहुंचने के लिए
    1. स्वचालित डेटा कमी(चित्रा 6ए)के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए एक विशिष्ट प्रयोग के डेटा सारांश के नीचे ऑटो प्रोसेसिंग टैब पर क्लिक करें।
    2. प्रत्येक आउटपुट का विस्तृत सारांश देखने के लिए विभिन्न पाइपलाइनों के अनुरूप विभिन्न टैब पर क्लिक करें।
      नोट: यदि नमूना समूहों को परिभाषित किया गया है, तो मल्टीप्लेक्स नौकरियों के अनुरूप दो टैब होंगे। एक उस बिंदु तक समूह में सभी डेटासेट के विलय के अनुरूप होगा, जबकि दूसरा केवल उस ड्रॉप के भीतर डेटासेट के विलय के अनुरूप होगा।
    3. परिणामी .mtz फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए लॉग और फ़ाइलें बटन पर क्लिक करें यदि प्रसंस्करण सफल रहा और कोई संबंधित लॉग फ़ाइल। डिंपल से आउटपुट देखने के लिए ऑटो प्रोसेसिंग सेक्शन के नीचे डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग टैब पर क्लिक करें।
      नोट: डिंपल केवल तभी चलेगा जब नमूना प्रस्तुत करने के दौरान पीडीबी फ़ाइल प्रदान की गई हो।
    4. DIMPLE से किसी भी परिणामी आउटपुट को डाउनलोड करने के लिए Logs & Files बटन पर क्लिक करें।
  3. समूह मल्टीप्लेक्स परिणामों तक पहुंचने के लिए, स्क्रीन के शीर्ष पर ड्रॉपडाउन मेनू खोलें जिस पर प्रस्ताव संख्या लिखी हो और नमूना समूह प्रबंधन पर क्लिक करें। सही कंटेनर के भीतर वांछित समूह के अनुरूप पंक्ति पर क्लिक करें। प्लेट के आरेख द्वारा नेत्रहीन रूप से दर्शाए गए समूह के अनुरूप मल्टीप्लेक्स आउटपुट की सूची खोजने के लिए नीचे स्क्रॉल करें।
    1. दी गई सूची में से वांछित मल्टीप्लेक्स आउटपुट पर क्लिक करें। xxx डेटा सेट बटन पर क्लिक करें, जहां xxx मर्ज किए गए डेटासेट (चित्रा 6B) की संख्या है।
      नोट: यह डेटा संग्रह स्क्रीन खोलेगा, लेकिन केवल चयनित मल्टीप्लेक्स नौकरी से डेटासेट दिखाए जाएंगे।
    2. शीर्ष प्रयोग के ऑटो प्रोसेसिंग टैब पर क्लिक करें।
    3. मल्टीप्लेक्स प्रोसेसिंग टैब पर क्लिक करें जो मर्ज किए गए डेटासेट की सही संख्या से मेल खाता है।
    4. लॉग पर क्लिक करें & फ़ाइलें बटन .mtz और इसी लॉग फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए (चरण 3.2.3 में के रूप में.)
  4. ग्रिड स्कैन परिणामों तक पहुँचने के लिए
    1. वांछित यात्रा के लिए डेटा संग्रह स्क्रीन पर नेविगेट करें। ग्रिड स्कैन डेटा परिणाम एकत्र किए गए किसी भी रोटेशन डेटा के साथ प्रदर्शित किए जाएंगे।
      नोट: कोई ऑटो प्रोसेसिंग परिणाम नहीं होगा।
    2. क्रिस्टल ड्रॉप की छवि में विवर्तन की उपस्थिति का प्रतिनिधित्व करने वाले हीट मैप के साथ ग्रिड मढ़ा होगा। ग्रिड में उस स्थिति के लिए विवर्तन छवि देखने के लिए एक वर्ग पर क्लिक करें. क्रिस्टल अच्छी छवि के शीर्ष पर ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक करें ताकि गर्मी का नक्शा क्या दर्शाता है। डिफ़ॉल्ट विवर्तन की कुल तीव्रता है , लेकिन इसे कुल धब्बे, अनुमानित रिज़ॉल्यूशन या बर्फ के बिना फ्रेम में बदला जा सकता है।

4. डेटा पुनर्संसाधन

नोट: चयनित डेटासेट को ISPyB11 इंटरफ़ेस के माध्यम से उसी प्रसंस्करण पाइपलाइनों का उपयोग करके पुन: संसाधित किया जा सकता है जो उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित परिवर्तित सेटिंग्स के साथ स्वचालित रूप से चलाए जाते हैं। एक संकल्प कट-ऑफ लागू किया जा सकता है; यदि क्रिस्टल की समरूपता/सेल ज्ञात है, तो इसे यह सुनिश्चित करने के लिए भी परिभाषित किया जा सकता है कि प्रसंस्करण पाइपलाइन सही सेटिंग में चलती हैं। विशिष्ट डेटासेट में चुनिंदा छवि श्रेणियों को उपलब्ध मल्टी-क्रिस्टल पाइपलाइनों का उपयोग करके भी मर्ज किया जा सकता है। यह फायदेमंद साबित हो सकता है यदि व्यवस्थित विकिरण क्षति विवर्तन छवियों के बाद के हिस्से को खराब गुणवत्ता का कारण बनती है। यह उपयोगकर्ता के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अपने डेटासेट को डाउनलोड करने और स्थानीय रूप से अपने वांछित पुनर्संसाधन सॉफ़्टवेयर को चलाने का एक विकल्प भी है, जिसके लिए ट्यूटोरियल कहीं और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html#)।

  1. कई अलग-अलग डेटासेट को पुन: संसाधित करने के लिए
    1. ISPyB में लॉग इन करें और ब्याज के डेटासेट (चरण 3.1) पर नेविगेट करें।
    2. डेटासेट पर क्लिक करें और रीप्रोसेसिंग विंडो खोलने के लिए डेटासेट टाइटल बार (चित्र 6) में कॉग आइकन पर क्लिक करें।
    3. किसी भी वांछित सेटिंग्स को कॉन्फ़िगर करें और चुनें कि कौन से फ्रेम पुनर्संसाधन में शामिल किए जाएंगे।
      नोट: छवि रेंज को लेबल किए गए बक्से में एक सीमा टाइप करके या प्रति-छवि विश्लेषण प्लॉट (चित्रा 7ए)में वांछित क्षेत्र को क्लिक करके और खींचकर परिभाषित किया जा सकता है।
    4. वैकल्पिक: व्यक्तिगत पुनर्संसाधन के लिए एक और डेटासेट जोड़ने के लिए, इसके कॉग आइकन पर क्लिक करें और यह पहले डेटासेट के नीचे रीप्रोसेसिंग विंडो में दिखाई देगा। व्यक्तिगत रूप से प्रक्रिया बॉक्स पर टिक करें।
    5. एकीकृत बटन पर क्लिक करें।
  2. मल्टी-क्रिस्टल डेटा को पुन: संसाधित करने के लिए
    1. किसी भी डेटासेट से रीप्रोसेसिंग विंडो खोलें।
    2. नई स्क्रीन खोलने के लिए मल्टी-क्रिस्टल बटन पर क्लिक करें।
    3. यात्रा के दौरान प्रयोगों से प्रति-छवि विश्लेषण भूखंडों की एक श्रृंखला खोजने के लिए नीचे स्क्रॉल करें।
    4. ड्रॉपडाउन मेनू से एक प्रसंस्करण पाइपलाइन चुनें।
    5. वैकल्पिक: किसी भी रिज़ॉल्यूशन सीमा या ज्ञात इकाई कक्ष पैरामीटर निर्धारित करें।
    6. क्लिक करें और छवि श्रेणियों को परिभाषित करने के लिए बहु क्रिस्टल पुनर्संसाधन (चित्रा 7) में शामिल किया जा खींचें.
      नोट: यह कई अलग-अलग भूखंडों पर किया जाना चाहिए ताकि कई अलग-अलग क्रिस्टल से डेटासेट विलय हो जाएं।
    7. एकीकृत बटन (चित्रा 7 बी) पर क्लिक करें.
  3. पुनर्संसाधित डेटा तक पहुँचने के लिए
    1. विशिष्ट विज़िट के लिए डेटा संग्रह पृष्ठ पर नेविगेट करें (चरण 3.1.1-3.1.3).
    2. स्क्रीन के शीर्ष पर रीप्रोसेसिंग बटन पर क्लिक करें।
    3. वांछित नौकरी का पता लगाने के लिए नीचे स्क्रॉल करें।
    4. पुन: संसाधित डेटा के लिए डेटा संग्रह स्क्रीन खोलने के लिए दाहिने हाथ के कॉलम में फ़ाइल पथ पर क्लिक करें।
    5. ऑटो प्रोसेसिंग टैब खोलें और पहले बताए अनुसार डेटा डाउनलोड करें (चरण 3.2)।
      नोट: किसी भी reprocessed कार्य पाइपलाइन नाम के आगे गोलाकार तीर प्रतीक द्वारा पहचाने जाने योग्य हैं।

Representative Results

क्रिस्टलीकरण सुविधा और VMXi बीमलाइन का उपयोग विभिन्न प्रकार के प्रोजेक्ट प्रकारों और उपयोग के मामलों के लिए किया गया है। यहां यह बताने के लिए कुछ उदाहरण दिए गए हैं कि उपयोगकर्ता क्या करना चाहते हैं।

केस स्टडी 1: मानक डेटा संग्रह

बीमलाइन एक क्रिस्टलीकरण प्लेट के भीतर क्रिस्टल की एक छोटी संख्या से कमरे के तापमान क्रिस्टल संरचनाओं के तेजी से निर्धारण को सक्षम बनाता है। क्रिस्टल की न्यूनतम संख्या अंतरिक्ष समूह और क्रिस्टल अभिविन्यास पर निर्भर है, लेकिन अक्सर 1-4 होती है, हालांकि कई दसियों क्रिस्टल से डेटा विलय करके बेहतर डेटा गुणवत्ता प्राप्त की जा सकती है। एक हालिया उदाहरण बीमलाइन मानकों में से एक है, थुमाटिन। चित्रा 8 ए में दिखाए गए कई क्रिस्टल, मैन्युअल रूप से डेटा संग्रह के लिए चिह्नित किए गए थे जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 2.3 में वर्णित है। इन क्रिस्टल कतार में जोड़ा गया के रूप में प्रोटोकॉल खंड 2.4 में वर्णित है और प्रयोगात्मक मापदंडों ड्रॉपडाउन सूची से चुना गया. एक बार प्रयोगात्मक मापदंडों लागू किया गया था, थाली डेटा संग्रह के लिए कतारबद्ध किया गया था. डेटासेट एकत्र किए गए, स्वचालित रूप से स्केल किए गए, और xia2.multiplex पाइपलाइन का उपयोग करके विलय कर दिया गया जैसा कि प्रोटोकॉल सेक्शन 3 में वर्णित है। सिंकवेब से एक उदाहरण आउटपुट चित्रा 8 ए मध्य में दिखाया गया है। पांच मर्ज किए गए डेटासेट ने 1.66 Å रिज़ॉल्यूशन के डेटासेट को जन्म दिया। एक अच्छी तरह से में लगभग पांच क्रिस्टल के मानक डेटा संग्रह के लिए, डेटासेट 2.5 मिनट के भीतर एकत्र किए गए थे।

केस स्टडी 2: लिगैंड बाइंडिंग - मैक 1 प्रोटीन का उपयोग करके टुकड़ा प्रयोग

कमरे के तापमान पर प्रोटीन-लिगैंड परिसरों की संरचनाओं का उत्पादन सीधे बीमलाइन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। लिगैंड को क्रिस्टलीकरण प्लेटों (या तो मैन्युअल रूप से या ध्वनिक ड्रॉप इंजेक्शन द्वारा) पर बूंदों में जोड़ा जा सकता है और उपयुक्त इनक्यूबेशन समय के बाद मापा गया डेटा। यहां वर्णित उदाहरण में, टुकड़ों की एक श्रृंखला को क्रिस्टलीकरण प्लेट में प्रोटीन nsp2 (Mac-3) के SARS-CoV-3 पहले मैक्रोडोमेन के क्रिस्टल वाले कुओं में तिरस्कृत किया गया था। एक ही टुकड़ा युक्त कुओं में से दो प्रोटोकॉल चरण 2.5 में वर्णित के रूप में एक समूह के रूप में सौंपा गया था. एकाधिक क्रिस्टल (42) को डेटा संग्रह के लिए चिह्नित किया गया था जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 2.3 और 2.4 में वर्णित है, और डेटासेट मानक मापदंडों (60 डिग्री रोटेशन, 0.1 डिग्री चरण, 0.00178 एस एक्सपोजर, 5% ट्रांसमिशन, 16 केवी - प्रति क्रिस्टल) (चित्रा 8बी) का उपयोग करके एकत्र किए गए थे। दो कुओं से डेटासेट स्वचालित रूप से xia2.dials पाइपलाइन का उपयोग करके संसाधित किए गए थे और बाद में, xia2.multiplex पाइपलाइन को इन डेटा सेटों में से 22 को स्वचालित रूप से मर्ज करने के लिए शुरू किया गया था। डिंपल को तब इन पाइपलाइनों के आउटपुट पर चलाया गया था और ऐसे नक्शे मिले जो स्पष्ट रूप से बाध्य टुकड़े के प्रमाण दिखाते थे। टुकड़ा मॉडल खाली घनत्व में बनाया गया था और आगे परिष्कृत (चित्रा 8 बी सही)। संरचना-आधारित दवा डिजाइन प्रक्रिया के लिए अमूल्य जानकारी और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए चरणों की इस श्रृंखला का उपयोग करके कमरे के तापमान लिगैंड-बाउंड संरचनाओं को आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। कई कुओं में 42 क्रिस्टल के इस डेटा संग्रह के लिए, डेटासेट 10 मिनट के भीतर एकत्र किए गए थे।

केस स्टडी 3: कम समरूपता अंतरिक्ष समूह और पसंदीदा अभिविन्यास के साथ संरचना समाधान प्लेट जैसी आकृति विज्ञान के साथ कई क्रिस्टल का एक ढेर सी-प्रकार गैस-बाध्यकारी साइटोक्रोम(चित्रा 8सी)के साथ क्रिस्टलीकरण प्रयोगों से उत्पन्न हुआ था। स्टैक के किनारे के चारों ओर कई पदों का चयन करके जहां एक्स-रे बीम में केवल एक क्रिस्टल था, एक मोनोक्लिनिक (सी 2) अंतरिक्ष समूह के बावजूद, चार क्रिस्टल से वेजेज को विलय करके 1.75 ए रिज़ॉल्यूशन के लिए एक अच्छी गुणवत्ता वाला डेटासेट प्राप्त करना संभव था। इसने क्रिस्टलीकरण स्थितियों को और अनुकूलित करने की आवश्यकता के बिना परियोजना की तेजी से प्रगति की अनुमति दी। यहपरिणाम पहले 9 वर्णित किया गया है। एक कुएं में चार क्रिस्टल के इस डेटा संग्रह के लिए, डेटासेट 2 मिनट के भीतर एकत्र किए गए थे।

केस स्टडी 4: सीरियल क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग करके प्लेट में माइक्रोक्रिस्टल से जानकारी और कमरे के तापमान की संरचना प्राप्त करना

अक्सर जब माइक्रोक्रिस्टल एक बूंद में दिखाई देते हैं या जब उपयोगकर्ता सिंक्रोट्रॉन या एक्सएफईएल स्रोतों पर धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के अग्रदूत के रूप में बैच में माइक्रो-क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की मांग कर रहे होते हैं, तो यह विवर्तन गुणों और यूनिट सेल आयामों पर तेजी से प्रतिक्रिया प्राप्त करने में बहुत मददगार होता है न्यूनतम सामग्री का उपयोग करके विभिन्न परीक्षण। इस उपयोग के मामले में, बैच में बढ़ रहे लाइसोजाइम के माइक्रोक्रिस्टल को क्रिस्टलीकरण प्लेट (200 एनएल वॉल्यूम प्रति ड्रॉप) में पाइप किया गया था और 10 माइक्रोन स्टेप साइज(चित्रा 9)के साथ ग्रिड स्कैन का उपयोग करके आठ बूंदों से डेटा एकत्र किया गया था। परिणामी 25,906 अभी भी छवियों को सीरियल क्रिस्टलोग्राफी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप डेटासेट था, जहां 9,891 विवर्तन पैटर्न अनुक्रमित किए गए थे और 2.0 ए रिज़ॉल्यूशन के लिए डेटासेट का उत्पादन करते हुए विलय कर दिया गया था जो प्रकाशित कमरे के तापमान संरचना के खिलाफ अच्छी तरह से परिष्कृत होता है (आरकाम = 19.6%, आरफ्री = 23.6% पीडीबी 8 ए 9 डी का उपयोग करके) (तालिका 1). इसने यूनिट सेल वितरण और एक माइक्रोक्रिस्टल कमरे के तापमान संरचना निर्धारण के विस्तृत विश्लेषण की अनुमति दी जो समय-हल किए गए अध्ययनों सहित जटिल धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों में फ़ीड कर सकता है। आवश्यक माइक्रोक्रिस्टल निलंबन की कुल मात्रा 1.6 माइक्रोन थी। ग्रिड स्कैन का उपयोग करके आठ कुओं में माइक्रोक्रिस्टल के इस डेटा संग्रह के लिए, डेटासेट 40 मिनट के भीतर एकत्र किए गए थे।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटीन-टू-स्ट्रक्चर पाइपलाइन का योजनाबद्ध क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग, क्रिस्टलीकरण सुविधा पर अनुकूलन, कमरे के तापमान स्वचालित डेटा संग्रह और वीएमएक्सआई, एक्सकैम टुकड़ा स्क्रीनिंग, और अन्य एमएक्स बीमलाइन पर डेटा संग्रह पर नमूना कटाई के बिना प्रसंस्करण। उपयोगकर्ता नमूने की आपूर्ति करके या VMXi बीमलाइन पर प्लेट लाकर पाइपलाइन शुरू कर सकते हैं। संक्षिप्त: स्वस्थानी में बहुमुखी मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: क्रिस्टलीकरण प्लेटों की स्थापना के लिए मच्छर एसपीटी लैबटेक इंटरफ़ेस। (ए) (1) सीटू -1 सेटअप दृश्य में MiTeGen। (2) 96-वेल प्लेट प्रकार पर जाकर और (3) MiTeGen प्लेट 2 ड्रॉप प्लेट का चयन करके MiTeGen 2 ड्रॉप मानक प्लेट चुनें। ड्रॉप 1 और ड्रॉप 2 के लिए परिभाषा मापदंडों को बदलने के लिए, जो VMXi के लिए आवश्यक है, (4) संपादन आइकन पर क्लिक करें। यह एक नई विंडो (बी) खोलता है जहां (5) एक्स और वाई ऑफसेट को दिखाए गए अनुसार बदलने की आवश्यकता है। (बी) उप अच्छी तरह से 2 और (सी) उप अच्छी तरह से 3 का चयन करें और तदनुसार मूल्यों को बदलें। (डी) क्रिस्टलक्विकएक्स सेटअप दृश्य। 96-वेल प्लेट प्रकार में जाकर और MiTeGen प्लेट 2 ड्रॉप प्लेट का चयन करके CrystalQuickX 2 ड्रॉप मानक प्लेट चुनें। ड्रॉप 1 और ड्रॉप 2 के लिए परिभाषा मापदंडों को बदलने के लिए, जो VMXi के लिए आवश्यक है, ऊपर की तरह ही संपादन आइकन पर क्लिक करें। यह एक नई विंडो खोलता है जहां (ई, एफ) एक्स और वाई ऑफसेट को दिखाए गए अनुसार बदलने की आवश्यकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: SynchWeb इंटरफ़ेस दिखा रहा है कि VMXi शिपमेंट कैसे बनाएं, प्लेट पंजीकृत करें और संपर्क विवरण की जांच करें। सिंकवेब इंटरफ़ेस में जानकारी अपलोड करने के विभिन्न चरणों के स्क्रीनशॉट (ए) ड्रॉपडाउन मेनू, (बी, सी) एक नया शिपमेंट पंजीकृत करने, (डी) एक नया कंटेनर पंजीकृत करने, (ई) प्लेट जानकारी दर्ज करने से दिखाए जाते हैं, (एफ) संपर्क विवरण की जांच करें, और (जी) एक प्रस्ताव के भीतर पंजीकृत कंटेनरों की एक सूची। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सिंकवेब का उपयोग करके डेटा संग्रह के लिए नमूने का चयन और तैयारी करना। स्क्रीनशॉट की एक श्रृंखला SynchWeb इंटरफ़ेस का उपयोग करके डेटा संग्रह के लिए नमूने तैयार करने के विभिन्न चरणों को दिखाती है। (ए) अंक और ब्याज के क्षेत्रों ड्रॉप अवलोकन से चुना जाता है. इस पैनल के निचले हिस्से में, एक बूंद की तस्वीरों की कालानुक्रमिक श्रृंखला है। (बी) एक प्लेट के लिए CHiMP आउटपुट का एक उदाहरण 'क्रिस्टल' श्रेणी के परिणामों को उजागर करता है। (सी) चयनित बिंदुओं और क्षेत्रों की सूची से कतार में नमूने जोड़ना और (डी) बीमलाइन-निर्मित प्रयोग सेटिंग्स की ड्रॉपडाउन सूची से कतारबद्ध नमूनों में डेटा संग्रह के लिए पैरामीटर लागू करना। कोई प्रयोगात्मक मापदंडों (लाल रंग में) बनाम उन है कि सही ढंग से लागू मापदंडों (ऊपर और नीचे) के साथ नमूने के बीच अंतर नोट. इस पैनल के निचले भाग में कतार कंटेनर बटन है, जो बीमलाइन पर एकत्र की जाने वाली प्लेट को कतारबद्ध करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: सिंकवेब में नमूना समूह निर्माण। नमूना समूह बनाने के विभिन्न चरणों को दिखाने वाले स्क्रीनशॉट की एक श्रृंखला। (ए) नमूने युक्त प्लेट (ओं) प्रासंगिक लदान से चुना जाता है और (बी) प्लेट के भीतर बूंदों का चयन कर रहे हैं. ये अलग-अलग बूंदें हो सकती हैं या पंक्ति और/या कॉलम द्वारा चुनी जा सकती हैं। (सी) नमूना समूहों की एक सूची जो पहले ही बनाई जा चुकी है। (डी) पिछले तीन मल्टीप्लेक्स प्रसंस्करण नौकरियों के आउटपुट सूचीबद्ध हैं और प्रसंस्करण पाइपलाइन से आंकड़े दिखाने के लिए चुने जा सकते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: डेटा प्रोसेसिंग और डेटा में कमी। (ए) ISPyB11 में संसाधित डेटासेट का स्क्रीनशॉट। पुनर्संसाधन सुविधाओं तक पहुँचने के लिए बटन हाइलाइट किया गया है। नमूना आईडी और प्रयोगात्मक पैरामीटर ऊपर बाईं ओर और बीच में विवर्तन छवि दर्शक में दिखाए जाते हैं। इस छवि पर क्लिक करने से विभिन्न छवियों की जांच करने के लिए एक इंटरैक्टिव विंडो खुल जाएगी। क्रिस्टल इमेज व्यूअर दाईं ओर दिखाया गया है और इस इमेज पर क्लिक करने से बीमलाइन और फॉर्मूलाट्रिक्स स्टोरेज इमेज की तुलना करने के लिए एक इंटरेक्टिव विंडो भी खुल जाएगी। प्रति-छवि विश्लेषण प्लॉट सबसे दाईं ओर दिखाया गया है और इस छवि पर क्लिक करने से इस आउटपुट का एक आवर्धित संस्करण खुल जाएगा। ऑटो प्रोसेसिंग टैब पर क्लिक करने से ऑटोप्रोसेसिंग दिखाई देगी और विभिन्न पाइपलाइनों के परिणामों के बीच तुलना करना आसान हो जाएगा। विभिन्न प्रसंस्करण पाइपलाइनों के बीच स्विच करने के लिए टैब पर क्लिक करें और चयनित पाइपलाइन से विस्तृत आउटपुट देखें। डेटा डाउनलोड के लिए लॉग्स और फ़ाइलें बटन हाइलाइट किया गया है। डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग टैब पर क्लिक करने से पोस्ट-डेटा कमी पाइपलाइनों के माध्यम से चलने वाले किसी भी डेटा सेट का विस्तार होगा और परिणाम प्रदान करेगा जहां उपयुक्त हो। (बी) नमूना समूह प्रबंधन स्क्रीन से स्क्रीनशॉट। उपयोगकर्ता-परिभाषित समूह का नाम शीर्ष पर है और शामिल कुओं का दृश्य विवरण नीचे देखा जा सकता है। एक हरा कुआं इंगित करता है कि उस बूंद से मापा गया सभी क्रिस्टल समूह में शामिल किया जाएगा। उस समूह पर किए गए विभिन्न मल्टीप्लेक्स नौकरियों का सारांश देखा जा सकता है और नीचे मल्टीप्लेक्स से विस्तृत आउटपुट है। शामिल प्रयोगों की जांच करने के लिए डेटा सेट बटन हाइलाइट किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: डेटा पुनर्संसाधन खिड़कियां। (ए) व्यक्तिगत और (बी) मल्टी-क्रिस्टल डेटासेट। दो अलग-अलग डेटासेट प्रदर्शित होते हैं जहां डेटा के क्षेत्रों का चयन किया गया है। प्रक्रिया व्यक्तिगत रूप से चेक बॉक्स टिक के साथ, चयनित विवर्तन छवियों को एकीकृत बटन दबाकर व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जाएगा। मल्टी-क्रिस्टल बटन पर क्लिक करने से व्यक्तिगत डेटासेट का प्रदर्शन खुल जाएगा। कई डेटासेट से विवर्तन छवियों को पुन: संसाधित करने के लिए, छवियों के क्षेत्रों को प्रदर्शित के रूप में चुना जाता है, और हाइलाइट किए गए के रूप में एकीकृत बटन पर क्लिक करके पुन: प्रसंस्करण शुरू किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: VMXi पाइपलाइन से प्रतिनिधि परिणाम। (ए) क्रिस्टलीकरण ड्रॉप (बाएं पैनल), डेटा प्रोसेसिंग परिणाम (केंद्र पैनल), और इलेक्ट्रॉन घनत्व (दाएं पैनल) के भीतर प्रोटीन थौमैटिन के लिए मार्क-अप क्रिस्टल। (बी) SARS-CoV-2 मैक्रो डोमेन के टुकड़े के बंधन को निर्धारित करने के लिए कई क्रिस्टल पर संग्रह। मानक प्रयोगात्मक सेटिंग्स का उपयोग करके EU-OPENSCREEN टुकड़ा स्क्रीन से एक टुकड़े की उपस्थिति में डेटासेट को कई क्रिस्टल पर एकत्र किया गया था। इन डेटा संग्रह के उदाहरण SynchWeb के इस अंश में दिखाए गए हैं। टुकड़ा इसी घनत्व में बनाया गया था और आगे परिष्कृत के रूप में सही पर सबसे दूर में प्रदर्शित किया गया है. (सी)डेटा संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले चुनौतीपूर्ण क्रिस्टलीकरण हिट से स्टैक में मार्क-अप मोनोक्लिनिक क्रिस्टल। ग्रीन क्रॉस और लाल संख्या इंगित करती है कि डेटा को 10 माइक्रोन बीम और 60 डिग्री रोटेशन का उपयोग करके मापा गया था। परिणामी वेजेज में से चार को 1.75 Å रिज़ॉल्यूशन पर डेटासेट का उत्पादन करने के लिए विलय कर दिया गया था। हेम समूह के चारों ओर इलेक्ट्रॉन घनत्व दाईं ओर प्रदर्शित होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: क्रिस्टलीकरण प्लेट में सीरियल क्रिस्टलोग्राफी (ए) क्रिस्टलीकरण ड्रॉप की ऑप्टिकल छवि, ब्याज के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने वाले एक सफेद बॉक्स के साथ। (बी) ग्रिड स्कैन बिंदुओं की परिभाषा। (C) अपवर्तन को इंगित करने वाला ऊष्मा मानचित्र। (डी) 9,000 से अधिक अभी भी विवर्तन पैटर्न से सेट एक सीरियल क्रिस्टलोग्राफी डेटा सेट से उत्पन्न इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संकल्प (Å) पूर्णता (%) बहुलता मैं/σ(मैं) आरविभाजन  सीसी1/2  अद्वितीय अवलोकन
कुल मिलाकर 100 95.5 20.8 0.063 0.998 8422
कम (55.55 - 5.43) 100 147.1 81.7 0.028 0.999 488
उच्च (2.03 -2.00) 100 75.3 1.2 1.092 0.410 411

तालिका 1: VMXi RT सीरियल डेटासेट के लिए डेटा आँकड़े। संक्षिप्ताक्षर: I = स्केल किए गए अवलोकनों की औसत तीव्रता; आरविभाजन = मापा तीव्रता की विसंगति का एक उपाय; CC 1/2 = डेटासेट के दो यादृच्छिक हिस्सों के बीच सहसंबंध गुणांक।

Discussion

हमने सीएफ में प्रोटीन के नमूने के आगमन से लेकर आगे के अनुप्रयोगों के लिए उपयोगकर्ता द्वारा अंतिम डेटा डाउनलोड करने तक की पूरी प्रक्रिया का वर्णन किया है। महत्वपूर्ण कदम एक उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन नमूने और उपयुक्त क्रिस्टल स्क्रीन का उत्पादन कर रहे हैं, या तो स्थापित शर्तों के आधार पर वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन या अनुकूलन स्क्रीन का उपयोग कर. यह प्रक्रिया सीएफ में हो सकती है, या उपयोगकर्ता घरेलू प्रयोगशालाओं में क्रिस्टलीकरण प्रक्रियाओं को अंजाम दे सकते हैं और उपयुक्त क्रिस्टलीकरण प्लेटों को बीमलाइन पर ला सकते हैं। उपयुक्त आंकड़ा संग्रह मापदंडों की पहचान कुछ नमूनों के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है, विशेष रूप से जहां विकिरण क्षति एक चिंता का विषय है। ज्यादातर मामलों में, स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग वैज्ञानिक प्रश्न का उत्तर देने के लिए पूरी तरह से पर्याप्त है, हालांकि उपयोगकर्ता बीमलाइन टूल का उपयोग करके पुन: संसाधित करने की क्षमता बनाए रखते हैं, उदाहरण के लिए, जहां अंतरिक्ष समूह अस्पष्ट है या एकत्रित डेटा का केवल प्रारंभिक भाग विकिरण क्षति प्रभाव को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है।

यदि प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण परीक्षणों से उपयुक्त क्रिस्टल का उत्पादन नहीं किया जाता है, तो प्रोटीन एकाग्रता, शुद्धता, या क्रिस्टलीकरण स्क्रीन में परिवर्तन का पता लगाया जा सकता है, जैसा कि क्रिस्टल सीडिंग का उपयोग हो सकता है। यदि क्रिस्टल बीमलाइन पर एक उपयोगी रिज़ॉल्यूशन के लिए विवर्तित नहीं होते हैं, तो अनुकूलन प्रयासों का मार्गदर्शन करने के लिए क्रिस्टल की अंतर्निहित विवर्तन सीमा और इकाई सेल का आकलन करने के लिए ग्रिड स्कैन का उपयोग एक अनियंत्रित बीम के साथ किया जा सकता है। क्रिस्टल जो प्लेटों के भीतर डेटा संग्रह के लिए बहुत छोटे हैं (जैसे, <10 माइक्रोन) इसके बजाय सीरियल क्रिस्टलोग्राफी या नैनो फोकस प्रयोगों (जैसे, डायमंड बीमलाइन वीएमएक्सएम पर) के लिए उपयुक्त हो सकते हैं। VMXi डेटा का उपयोग करके संरचनाओं को हल करना आम तौर पर आणविक प्रतिस्थापन द्वारा सीधा होता है, खासकर प्रभावी खोज मॉडल देने के लिए अल्फाफोल्ड16 के आगमन के बाद से। यदि यह सफल नहीं होता है, तो पारंपरिक एकल-तरंग दैर्ध्य विषम विवर्तन, बहुतरंगदैर्ध्य विषम विवर्तन, या लंबी तरंग दैर्ध्य चरणबद्ध प्रयोगों को सक्षम करने के लिए प्लेटों से क्रिस्टल काटा और क्रायोकूल्ड किया जा सकता है।

इस पद्धति के फायदों में तेजी से, उच्च-गुणवत्ता वाले डेटासेट और क्रिस्टलीकरण प्लेटों से सीधे प्रतिक्रिया प्राप्त करने की क्षमता शामिल है, जिसमें वे उन वातावरणों से क्रिस्टल को परेशान करने की आवश्यकता के बिना हैं जिनमें वे बढ़े हैं। संरचनात्मक जीव विज्ञान में तथाकथित 'कमरे का तापमान पुनर्जागरण' गैर-क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत प्राप्त संरचनाओं पर एक प्रीमियम रखता है ताकि अधिक शारीरिक प्रासंगिकता और प्रोटीन गतिशीलता का पता लगाया जासके। आमतौर पर, एक अनुकूलित क्रायोकूल्ड क्रिस्टल की तुलना में थोड़ा कम रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जाता है, लेकिन केवल तभी जब उपयुक्त क्रायो की स्थिति स्थापित की गई हो और यदि क्रिस्टल यांत्रिक हैंडलिंग और क्रिस्टलीकरण ड्रॉप3 के उद्घाटन के लिए मजबूत हों। एक आगामी आवेदन जिसके लिए यह पाइपलाइन बहुत अच्छी तरह से अनुकूल है, दवा की खोज में कमरे के तापमान पर प्रोटीन-लिगैंड कॉम्प्लेक्स या टुकड़ा अभियानों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग है। लिगैंड या टुकड़े या तो cocrystallized किया जा सकता है या कमरे के तापमान डेटा संग्रह से पहले विंदुक या ध्वनिक ड्रॉप इजेक्शन द्वारा जोड़ा जा सकता है। एक अन्य अनुप्रयोग कई सैकड़ों या हजारों क्रिस्टल से डेटा को अत्यधिक कुशल तरीके से तेजी से मापना है और फिर आइसोमोर्फस क्लस्टर निकालने के लिए DIALS17 मल्टीप्लेक्स14 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना है जो विभिन्न जैविक संस्थाओं का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं या क्रिस्टल की आबादी के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर स्थापित करने के लिए है जिन्हें एक अलग तरीके से इलाज किया गया है या विभिन्न लिगेंड या सिग्नल के संपर्क में लाया गया है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम कई डायमंड लाइट सोर्स वैज्ञानिकों और सहायक टीम के सदस्यों को स्वीकार करते हैं जिन्होंने वीएमएक्सआई बीमलाइन के डिजाइन, निर्माण और संचालन में योगदान दिया। हम बीमलाइन उपयोगकर्ताओं के आभारी हैं, जिन्होंने बाद में क्रिस्टलीकरण और डेटा संग्रह पाइपलाइनों के विकास में विचारों का योगदान दिया है। हार्वेल में क्रिस्टलीकरण सुविधा डायमंड लाइट सोर्स लिमिटेड, रोजालिंड फ्रैंकलिन इंस्टीट्यूट और मेडिकल रिसर्च काउंसिल द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formulator Formulatrix on request Liquid handling robot
Formulatrix imager Formulatrix on request Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X  Greiner Z617644 Crystallisation plate
Gryphon  Art Robbins Instruments 620-1000-10  Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1 Mitegen InSitu-01CL-40 Crystallisation plate
Mosquito LCP  (SPT Labtech) on request Crystallisation robot
Rock Imager & Maker Formualtrix on request Software for Imager
[1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion Art Robbins Instruments 640-1000-10  Liquid handling robot
https://www.artrobbins.com/scorpion

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References

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जैव रसायन अंक 205 परिवेश का तापमान कमरे का तापमान स्वस्थानी में क्रिस्टलीकरण स्वचालन
क्रिस्टलीकरण और हार्वेल और बीमलाइन VMXi, डायमंड लाइट सोर्स में क्रिस्टलीकरण सुविधा का उपयोग करके <em>स्वस्थानी</em> कमरे के तापमान डेटा संग्रह में
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Sandy, J., Mikolajek, H., Thompson, A. J., Sanchez-Weatherby, J., Hough, M. A. Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (205), e65964, doi:10.3791/65964 (2024).

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