Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kristallisation och insamling av rumstemperaturdata på plats med hjälp av kristallisationsanläggningen vid Harwell och strålröret VMXi, diamantljuskälla

Published: March 8, 2024 doi: 10.3791/65964
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,2
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Vi presenterar ett protokoll för kristallisation av proteiner med hjälp av kristallisationsanläggningen i forskningskomplexet vid Harwell och efterföljande röntgenkristallografisk datainsamling in situ från kristaller i plattorna vid Diamonds Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) strålrör. Vi beskriver provkrav, kristallisationsprotokoll och riktlinjer för datainsamling.

Abstract

Protokoll för robotproteinkristallisation med hjälp av kristallisationsanläggningen vid Harwell och in situ insamling av rumstemperaturdata från kristallisationsplattor vid Diamond Light Source-strålröret VMXi beskrivs. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att bestämma högkvalitativa rumstemperaturkristallstrukturer från flera kristaller på ett enkelt sätt och ger mycket snabb återkoppling på resultaten av kristallisationsförsök samt möjliggör seriell kristallografi. Värdet av rumstemperaturstrukturer för att förstå proteinstruktur, ligandbindning och dynamik blir alltmer erkänt inom strukturbiologin. Den här pipelinen är tillgänglig för användare från hela världen med flera tillgängliga åtkomstlägen. Kristallisationsexperiment som sätts upp kan avbildas och ses på distans med kristaller som identifieras automatiskt med hjälp av ett maskininlärningsverktyg. Data mäts i ett köbaserat system med upp till 60° rotationsdata från användarvalda kristaller i en platta. Data från alla kristaller inom en viss brunn eller provgrupp slås automatiskt samman med hjälp av xia2.multiplex med utgångarna direkt åtkomliga via ett webbläsargränssnitt.

Introduction

Röntgenkristallografi är fortfarande ett viktigt verktyg för att förstå proteiners struktur och funktion, vilket ger högupplösta strukturer av proteiner eller deras komplex med till exempel substrat eller läkemedelskandidater. I många fall är det dock fortfarande en betydande flaskhals att få fram kristaller med önskvärda egenskaper - mycket diffrakterande, kristallform som är mottaglig för blötläggning och utan kristallpatologier som tvillingbildning- 1. Eftersom lämpliga kemiska förhållanden för att producera proteinkristaller i allmänhet inte kan förutsägas, är kristallisationsscreening som utforskar tusentals potentiella kemiska blandningar standard, ofta med hjälp av automatisering/robotik för att ställa in skärmar och kristallhotell för övervakning, ofta på distans, av kristallisationsdroppbilderna som registreras.

När kristaller dyker upp måste de vanligtvis skördas från kristallisationsmiljön med hjälp av en nylon- eller Kapton-slinga och sedan överföras till en droppe som innehåller ett kryoskyddsmedel (sökandet efter detta är en ytterligare variabel) innan de fryses till flytande kväve. Dessa ytterligare steg mellan kristallisation och röntgendatainsamling kan bland annat innebära uttorkning av kristallisationsdroppen när dess förseglade miljö bryts, mekaniska påfrestningar på kristallen när den hanteras och skador från kryoskyddsmedlen på kristallgittret (vilket vanligtvis resulterar i ökad mosaikspridning) bland andra faktorer2. Dessutom är kristallskörd tids- och arbetskrävande och kan leda till inhomogenitet mellan prover, särskilt när hud bildas på droppar under skördeprocessen. VMXi-strålröret ger tillgång till användbara data från kristaller som sitter fast på plattan, som annars skulle kasseras för datainsamling.

De allra flesta röntgenkristallstrukturer bestäms vid 100K med hjälp av ovanstående tillvägagångssätt, vilket möjliggör enkel kristalltransport och hantering och ökar kristallens livslängd i röntgenstrålen med storleksordningar. Det finns dock ett ökande intresse för att bestämma strukturer under icke-kryogena förhållanden, det vill säga mycket närmare de fysiologiska förhållanden som är relevanta för proteinfunktion 2,3,4. Detta möjliggör en mycket bättre uppskattning av proteiners dynamiska struktur, undviker aminosyrakonformationer eller slingor som fryses ut i funktionellt icke-relevanta tillstånd5, och gör det möjligt att utforska ligandbindning under förhållanden som ligger mycket närmare dem i proteinets naturliga miljö i cellen och organismen6.

Ett alternativt tillvägagångssätt, implementerat vid strålröret Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) vid Diamond Light Source-synkrotronen, Storbritannien, är att mäta diffraktionsdata direkt från kristaller i den miljö där de har vuxit (dvs. inuti kristallisationsplattan), under omgivande förhållanden och utan störningar 7,8. Detta möjliggör mycket snabb återkoppling från kristallisationsskärmar och optimeringar för att vägleda en användare till en optimal kristallform för deras behov. Det gör det också möjligt att producera högkvalitativa rumstemperaturstrukturer på ett automatiserat sätt9.

Detta protokoll förutsätter att en användare har ett mycket rent proteinprov redo för kristallisation. Vi beskriver användarupplevelsen när det gäller att få tillgång till kristalliseringsanläggningen på Harwell för att producera proteinkristaller och sedan använda strålröret VMXi för datainsamling (figur 1).

Kristallisationsanläggningen i Harwell

Kristallisationsanläggningen vid Harwell (CF) ligger i forskningskomplexet vid Harwell (RCaH) intill diamantljuskällan. Anläggningen erbjuder användarna ett automatiserat laboratorium med hög genomströmning för makromolekylär kristallisation, med hjälp av robotik för kristallisationsscreening, kristalloptimering, kristallavbildning och karakterisering. Genom nära integration med det högautomatiserade VMXi-strålröret har takten för bestämning av rumstemperaturstrukturer accelererat kraftigt och möjliggör karakterisering av nya proteinstrukturer, protein-ligand och DNA-ligandkomplex, samt automatiserad fragmentscreening (figur 1), allt under icke-kryogena förhållanden.

CF-pipelinen är en serie instrument som omfattar nanoliterkristallisationsrobotar9 för kristallisation av lösliga proteiner och membranproteiner, vätskehanteringsrobotar för att förbereda kommersiella kristallisationsskärmar och komplexa anpassade optimeringsskärmar och fyra avbildningsinstrument (ett vid 4 °C och tre vid 20 °C för avbildning av kristallisationsplattor (se materialtabellen). En kamera kan avbilda lipidkubikfasglasplattor (LCP) och en bildgivare är utrustad med multifluorescensoptik (båda vid 20 °C).

Anläggningen används nu i stor utsträckning av ett brett spektrum av akademiska och industriella användare, inklusive Membrane Protein Laboratory (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem-fragmentscreeningsanläggningen 10, MX-strålrören, XFEL-navet samt Rosalind Franklin Institute (RFI). Denna väletablerade och optimerade pipeline har gjort det möjligt att utföra kristallisationsexperiment inom ett brett spektrum av strukturbiologiska projekt. Detta dokument beskriver pipelinen för kristaller avsedda för datainsamling vid VMXi, även om kristaller också kan skördas och kryokylas eller riktas till XChem-pipelinen.

Användaråtkomst tilldelas genom Diamond MX Proposal System (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) och industriella användare stöds genom Diamond Industry Liaison-gruppen. Alla användare kan komma till platsen med sina prover eller plattor, som kan transporteras för hand. Det rekommenderas inte att skicka tallrikar med kurir eftersom vår erfarenhet tyder på att droppar kan röra sig bort från den plats där de matades ut, eller så kan droppar skadas av kristallisationsbehållaren. Alternativt, efter överenskommelse, kan användare skicka sina proteinprover till CF, där personal sätter upp kristallisationsexperiment för deras räkning. Experimenten kan övervakas på distans av användaren genom att antingen logga in på Rock Maker Web i CF eller via ISPyB i VMXi. Åtkomst till CF kan utföras på ett iterativt sätt baserat på röntgendiffraktionsresultaten som samlats in på Diamond.

Strålrör VMXi vid Diamond Light Source

Beamline VMXi (hädanefter kallat "strålröret") är ett unikt och nyutvecklat instrument helt dedikerat till rumstempererad, högautomatiserad röntgenkristallografi med fokus på att mäta data från kristaller i lämpliga kristallisationsplattor. Strålröret erbjuder ett mikrofokus (10 x 10 μm), rosa stråle (bandpass på <5 × 10-2ΔE/E) med ett högt flöde på ~2 × 1013 fotoner/s (vid 16 KeV)7. Denna högflödesstråle, i kombination med en snabb detektor, möjliggör mycket hög genomströmning av prover och insamling av data från prover upp till 10 μm i storlek.

Kristallisationsplattor kommer in i strålröret genom att lagras i ett provlagringssystem och avbildas baserat på det schema som tillhandahålls av användaren när plattorna registreras med hjälp av ISPyB11-gränssnittet SynchWeb12. Vanligtvis rekommenderas användare att välja en Fibonacci-sekvens av tidpunkter för avbildning (0, 12, 24, 36, 60... 7 320 timmar från det att skylten matas in i systemet). Användaren informeras via e-post när en skylt har avbildats. Både bilder av synligt ljus och UV-ljus är tillgängliga för användare på begäran. Bilderna som tas av provlagringssystemet analyseras av en maskininlärningsalgoritm; Detta lokaliserar och definierar automatiskt intressanta platser för objekt som liknar kristaller och registrerar de intressanta platser som är redo för användaren att lägga till i en kö för datainsamling. Användare kan också manuellt klicka på bilderna i synligt ljus för att registrera intressanta platser eller klicka och dra ett område som ska analyseras med rasterskanning. Dessa poäng är tillgängliga för användare att lägga till i kön tillsammans med de automatiskt placerade punkterna.

När alla prover har lämpliga parametrar för datainsamling går plattan in i en kö. När plattan når toppen av kön matas den automatiskt ut till strålröret. Kristallisationsplattorna laddas automatiskt från kristallhotellen till strålröret av en robotarm, och efter bildmatchning mäts kristallografiska datamängder med upp till 60° rotation från varje vald kristall enligt användardefinierade instruktioner. Alla droppar i en platta kan användas för dessa experiment på strålröret. Data slås samman från flera kristaller för att producera isomorfa, optimalt sammanslagna datamängder på ett automatiserat sätt 7,9. När alla köade datauppsättningar har samlats in får användaren ett e-postmeddelande med en länk att följa för att se datauppsättningarna i ISPyB11, liksom i andra Diamond MX-strålrör. Användare hänvisas också till strålröret web sida (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Produktion av kristaller i in situ-plattor med hjälp av kristallisationsanläggningen i Harwell

OBS: Åtkomst till CF stöds av ett antal olika vägar och beror på projektets tillämpning och användartyp (akademisk eller industri). XChem- och MPL-projekt har ett eget ansökningssystem via User Administration System (UAS) och kan skickas in antingen via den vanliga åtkomstvägen (inklusive iNEXT Discovery och EUbOPEN) eller BAG Access. Protokollet nedan är specifikt för VMXi-användare.

  1. Inlämning av förslag och förberedelse inför besöket
    1. Ge information om projektet till en BAG-ansökan eller lägg till den i en aktiv BAG-ansökan. Det finns vanligtvis en BAG-koordinator som organiserar pappersarbetet. Alternativt kan du lämna in ett förslag om snabb åtkomst för tillträde till strålröret.
    2. Se till att provet har registrerats och säkerhetsvaliderats i UAS på förslag före ankomst till platsen, antingen med bud eller personligen.
    3. Kontrollera att användaren är registrerad (med FedID och lösenord).
    4. Se till att användaren har lagts till i ett MX-förslag som associerad i UAS av BAG-koordinatorn.
    5. Fyll i formuläret för information om strålrörskristallisationsprovet och skicka formuläret till VMXi@diamond.ac.uk.
    6. Kommunicera med strålrörspersonalen om experimentkraven och strålrörets tillgänglighet.
    7. Om proteinprover skickas, skicka endast prover efter överenskommelse. Se avsnitt 1.2 för mer information.
    8. Om användaren ska komma in på platsen för att sätta upp kristallisationsplattor i CF, kontrollera med anläggningens personal om det finns en tidslucka för att använda anläggningens instrumentering och följ avsnitt 1.2.1.
    9. Om användaren tar med sig plattor till platsen, se till att sample dispenseras i rätt platttyp och placera kristallisationsdropparna på rätt plats och i rätt mängd. Följ avsnitt 1.2.2. Strålröret accepterar endast specifika in situ-kristallisationsplattor (Greiner CrystalQuickX och MiTeGen In Situ-1); se till att dropparna inte är större än 200 nL.
  2. Kristallisationsexperiment utfört i CF
    OBS: Anläggningen erbjuder ett antal makromolekylära kristallisationsmetoder med hög genomströmning såsom ångdiffusion samt satskristallisation under olja och LCP. Det rekommenderas att börja med 70-100 μL rent protein och utföra ångdiffusionsexperiment för lösliga proteiner med tre filter med ett förhållande på 100 nL proteinlösning och 100 nL kristallisationsreservoarlösning och inkubera plattorna vid 20 °C. Ett antal kommersiella skärmar finns tillgängliga inom anläggningen. Fuktighets- och temperaturkontroll finns med 4 °C och 20 °C som används mest. Användare som besöker CF får standardiserad utbildning och support för att använda kristallisationsinstrumenteringen och kommer att använda de inställningar som beskrivs häri.
    1. Fraktprover för installation på CF
      OBS: Före ankomst till platsen ska proteinprovet ha validerats på förslag inom UAS-systemet. När proteinprovet har anlänt till platsen kommer personalen att sätta upp kristallisationsexperiment enligt instruktioner i tidigare kommunikation med användaren. Bekräftelse kommer att skickas via e-post med streckkodsinformation för de experimentella kristallisationsplattorna. Användaren kommer att bli ombedd att lägga till kristallisationsplattorna som behållare till det relevanta förslaget. När detta är gjort kan plattorna lagras i automatiserade kameror i kristallisationsanläggningen eller vid strålröret. ISPyB kommer att vara det gränssnitt som används för interaktion vid strålröret.
      1. Tillhandahåll proteinprovlösningen vid den koncentration som krävs för kristallisation i multiplar av 25 μL alikvoter. Märk tydligt provrören som innehåller proteinprovet.
      2. Om det behövs, tillhandahåll en proteinbuffertlösning, ligandlösning eller reservoarlösning.
      3. Informera personalen om vilka skärmar och fallförhållanden som ska användas.
    2. Inställningar för kristallisationsplatta
      OBS: Vi kräver att kristallisationsdropparna i Greiner CrystalQuickX och MiTeGen In Situ-1-plattan ska vara på en viss plats; plattor som sätts upp någon annanstans bör använda följande Mosquito13-inställningar som beskrivs här.
      1. För att justera plattdefinitionen för MiTeGen In Situ-1, öppna Mosquito SPT-programvaran och klicka på standardsidan för MiTeGen In Situ-1-plattdefinition genom att klicka på Inställningar | 96 Brunn | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 droppar) (Figur 2A). Klicka på redigeringsknappen och ändra värdena för plats för underbrunn 2: X Offset till - 1,2 och Y-förskjutning till 1,8 och för plats för underbrunn 3: X Offset till 1,3 och Y-offset till 1,8 (figur 2B,C).
      2. För att justera plattdefinitionen för Greiner CrystalQuickX, öppna programvaran Mosquito SPT och klicka på standardsidan för Greiner CrystalQuickX-plattdefinition genom att klicka på Inställningar | 96 Brunnar | Greiner CrystalQuickX (figur 2D). Klicka på redigeringsknappen och ändra värdena för underbrunn 1: X Offset till - 1,95 och Y Offset till 1,45 och för underbrunn 2: X Offset till 1,95 och Y Offset till 1,45 (Figur 2E,F).

2. Använda strålröret vid Diamond Light Source

OBS: All interaktion med strålröret av användare utförs på distans med hjälp av ISPyB11-gränssnittet . Ingen fysisk närvaro vid strålröret krävs och data samlas in med hjälp av ett köbaserat system snarare än att schemaläggas vid en viss tidpunkt. Användare kommer att ha ett förslag kopplat till sin Diamond Light Source-åtkomst. Vid strålröret tilldelas varje kristallisationsplatta ett unikt besök och definieras som en "behållare" inom ISPyB11 analogt med en puck som innehåller prover vid 100 K. Optimeringsskärmar kan inte skapas med hjälp av SynchWeb-gränssnittet och därför läggs information vanligtvis till i kommentarsfältet (se steg 2.1.4.). Den person som registrerar plattan måste kontrollera e-postadressen eftersom plattans ägare kommer att få e-postmeddelanden om avbildning samt meddelanden om att plattan är klar.

  1. Registrering av skyltar
    1. Logga in på ISPyB med ett lämpligt Diamond FedID och välj Förslag. Sök efter det förslag du är intresserad av genom att bläddra eller skriva in förslagsnumret i sökfältet. Välj Sändning i rullgardinsmenyn under förslagsnumret (bild 3A), vilket öppnar fönstret Försändelser med försändelser i förslaget. Klicka på +Lägg till sändning längst upp till höger (Figur 3B) för att öppna fönstret Lägg till ny sändning , ge försändelsen ett namn, klicka på Automatiserad/Imager och klicka sedan på knappen Lägg till sändning längst ned till vänster (Figur 3C).
    2. I sändningsfönstret (bild 3D) klickar du på +Lägg till behållare, vilket visar sidvyn Lägg till behållare (bild 3E). Välj i rullgardinsmenyn Behållartyp någon av de relevanta plåttyperna. Sidan ändras för att återspegla den behållartyp som har valts. Ange en streckkod och ett containernamn enligt e-postinstruktioner från strålrörspersonal som är specifika för experimentplattorna. Observera att det är skiftlägeskänsligt.
    3. Välj VMXi 20 °C imager i listrutan Requested Imager (begärd imager ), Fibonacci-bildschemat (Fibonacci) i menyn Imaging Schedule (Bildschema ), kristalliseringsskärmen ( kristallisationsskärmen ) och användarnamnet (Owner) i listrutan Owner (Owner (Ägare), klicka på knappen View (Visa ) och ange rätt e-postadress för kontakten i rutan Email (E-post ) (Figur 3F).
    4. Ange mer information om plattan i rutan Kommentarer . Välj det relevanta provet från rullgardinsmenyn Protein och använd den akronym som är registrerad i UAS och godkänd av Diamond i det experimentella förslaget. Ange samma namn i rutan Exempelnamn . Lämna de återstående rutorna tomma.
    5. Klicka på ikonen +Plate för att replikera exemplet över hela plattan och fylla i hela behållaren med gröna fyrkanter. Klicka på +Lägg till behållare längst ned på sidan för att registrera plattan. Be en anställd vid strålröret att överföra plattan till lämplig kamera, där den kommer att lagras och avbildas. Ett besök kommer att genereras när behållaren lagras i bilderna och användaren kommer att få ett e-postmeddelande med en länk till plattan och dess bilder.
  2. Visa bildresultat
    1. Navigera till förslaget av intresse (steg 2.1.1), välj Behållare i rullgardinsmenyn under förslagsnumret och observera listan över tillgängliga behållare för förslaget. Välj filtret Plattor om andra sample hållartyper finns. Om du vill begränsa sökningen ytterligare markerar du rutan Mina behållare för att endast visa de mest relevanta behållarna som är associerade med det aktuella inloggade användar-ID:t. Klicka på lämplig behållare genom att flytta markören över den enskilda raden och vänsterklicka med musen.
    2. När du väljer behållare visas en ny vy som visar en översikt över plattan (Figur 4A). Klicka på en droppe i plåtrepresentationen till vänster på displayen för att visa den senaste bilden från respektive droppe. Använd piltangenterna för att navigera mellan släpp eller välj enskilda droppar med musen/markören.
    3. För att se historiska bilder av en droppe, klicka på H-knappen och vänta på att ett popup-galleri med bilder ska visas över den aktuella brunnsdroppbilden. Håll muspekaren över de enskilda bilderna för att uppdatera huvudbilden.
    4. Poängsätt bilder för att indikera status för varje droppe genom att trycka på knapparna 0 - 9 . Om du vill se de enskilda kategorierna öppnar du rullgardinsmenyn Poäng längst upp till vänster i släppbilden. Leta efter blå kryss i var och en av droppbilderna, som är ett resultat av en algoritm (CHiMP) som tränats att leta efter "kristaller" i bilderna.
    5. Klicka på den tredje ikonknappen som heter Mät längst upp till höger i droppbilden för att komma åt ett mätverktyg. För att använda det här verktyget, klicka och dra en linje, så kommer en linjal att sträcka sig och ge avståndet i μm.
    6. Om du vill begära ytterligare en bildsession klickar du på antingen Synlig eller UV i listrutan bredvid rubriken Åtgärder längst ned på sidan. Klicka sedan på knappen Begär plåtavbildning .
  3. Kristallurval/CHiMP
    1. För att lägga till punkter för datainsamling manuellt, tryck på +Markera punkt-knappen . Håll muspekaren över önskad intressepunkt och välj. Vänta tills ett rött kryss visas.
      OBS: Upp till 100 objekt kan skapas per droppe.
    2. När alla punkter är markerade klickar du på knappen +Slutför . Kom ihåg att även klicka på knappen +Slutför innan du försöker mäta objekt. Om du vill lägga till regioner för datainsamling via rutnätsskanningar klickar du på knappen +Markera region . Klicka på den övre vänstra punkten och dra nedåt och åt höger för att skapa ett område som kommer att rasterskannas på strålröret. Precis som med punkter klickar du på knappen +Slutför när alla önskade regioner har skapats.
      OBS: Det är bättre att skapa en större region än många små regioner.
    3. Observera de blå kryssen som redan finns på droppbilderna, som är resultatet av en algoritm som är utformad för att automatiskt lokalisera kristallina objekt (CHiMP). För att visualisera CHiMP-bedömningen av kristallisationsdroppar, klicka på kryssrutan Visa automatiska poäng och ändra sedan rullgardinsmenyn för Klass. Vanligtvis är den mest användbara inställningen här kristallalternativet (figur 4B).
      OBS: Detta är en ny funktion och det är inte garanterat att hitta alla kristaller och kan även hitta andra föremål som inte är kristaller.
    4. När alla punkter och regioner har markerats i respektive droppar, klicka på knappen Förbered för datainsamling längst ner på sidan.
  4. Förbereda prover för datainsamling
    1. Observera listan över prover som innehåller de punkter eller områden som valdes i föregående steg, eller som placeras automatiskt (figur 4C). Lägg till enskilda punkter eller regioner genom att trycka på + -knappen eller lägg till alla visade exempel genom att klicka på knappen Lägg till aktuell sida i kö .
    2. Filter är endast tillgängliga för att visa punktpunkter, regioner, automatiska punkter eller manuella punkter. Om du bara vill visa de prover som inte har tagits (dvs. som har exponerats för röntgenstrålar) klickar du på alternativen Utan data och Inte slutförda ovanför filterknapparna.
    3. Välj enskilda prover genom att klicka på respektive rad och uppdatera bilden till höger på skärmen för att visa rätt droppe och enskild punkt. Om det finns många exempel i listan ökar du antalet exempel som visas per sida genom att välja rullgardinsmenyn med 10 som standard och upp till 100 som maximalt antal exempel som visas.
    4. När alla punkter och regioner har lagts till i kön kontrollerar du att alla parametrar för insamling av experimentdata är associerade med varje experiment.
      1. Använd filter för Punkt, Region, Manuell och Auto. Klicka på punktfiltret och klicka på kryssrutan Markera alla under filterknapparna för att samtidigt tillämpa parametrar på alla exempel som visas i den aktuella listan över köade exempel .
      2. Välj experimentella parametrar från rullgardinsmenyn till höger på skärmen under släppfotot (Figur 4D). För regioner väljer du alternativet Grid Scan DMM 10 mikronsteg, 100 procent överföring. För alla andra punktexperiment väljer du andra alternativ i listrutan efter behov.
      3. För oscillerande datainsamlingar, klicka på Omega Scan DMM 60 grader 5 procent överföring alternativ för att samla in maximal mängd data från en enskild sample. Tillämpa små rotationer för mycket små kristaller eller strålningskänsliga prover och variera transmissionen baserat på tidigare erfarenhet av en viss kristallform. När alla exempel har tillämpat experimentella parametrar korrekt klickar du på knappen Köcontainer längst ned på sidan.
    5. När plattan har nått toppen av kön kommer den att presenteras för strålröret, datauppsättningar kommer att samlas in och sedan kommer den att återgå igen till provlagringen inom strålröret. När datainsamlingen från en platta är klar letar du efter ett e-postmeddelande med en länk att följa för att få tillgång till relevanta data.
  5. Skapa exempelgrupper
    OBS: Sample grupper kan skapas för att gruppera liknande samples över flera droppar eller plattor. Alla datauppsättningar inom dessa exempelgrupper kommer att bearbetas med hjälp av xia2.multiplex14-pipelinen när de har bearbetats av DIALS. Detta kan vara användbart när man samlar in många mycket små bitar av data och kan också vara användbart för att öka signal-till-brus för ligandbindande experiment.
    1. Välj Exempelgruppshantering i rullgardinsmenyn under förslagsnumret. Leta efter en lista över grupper om de redan har skapats av andra användare. Om du vill skapa en ny grupp klickar du på knappen +Skapa exempelgrupp . Klicka på en försändelse i rullgardinsmenyn på sidan Skapa provgrupp för att se provvisningsprogrammet (bild 5A). Klicka på containern som innehåller relevanta exempel från listan som är ifylld.
    2. När någon har klickat på en behållare letar du efter en bild som visar en översikt över plattan.
    3. Klicka på droppar individuellt genom att klicka på den enskilda droppen (figur 5B) eller klicka på droppar i rader eller kolumner genom att klicka på relevant radbokstav eller kolumnnummer. När alla brunnar som är associerade med en enskild grupp har valts anger du ett namn för gruppen i rutan Namn på exempelgrupp och klickar på knappen Spara exempelgrupp . Klicka på knappen Visa exempelgrupper på den här sidan för att återgå till listan över redan genererade exempelgrupper som är associerade med förslaget (figur 5C).
  6. Redigera exempelgrupper
    1. Klicka på en exempelgrupp i listan över grupper på sidan Hantering av exempelgrupp .
    2. Klicka på knappen +Redigera exempelgrupp bredvid behållarna som visas under gruppinformationen (bild 5C).
    3. Observera dropparna, som redan är associerade med en sample grupp, markerade på plattan överview.
    4. Lägg till fler droppar i exempelgruppen genom att klicka på droppar, brunnar eller kolumner som tidigare.
      OBS: Droppar kan inte tas bort från en sample grupp.
    5. När ytterligare droppar har lagts till redigerar du namnet på provgruppen och sparar det sedan, eller sparar det genom att klicka på knappen Spara provgrupp .
  7. Visualisera och analysera utdata från exempelgrupper
    1. Klicka på en enskild grupp i listan över exempelgrupper för att visa plattöversikten för behållaren eller behållarna som är associerade med gruppen. Dropparna som ingår i gruppen kommer att markeras på den här displayen (Figur 5D).
    2. Leta efter en lista som innehåller de tre senaste multiplexjobben i kronologisk ordning om data har samlats in i den här gruppen.
    3. Klicka på raden för en multiplexkörning för att uppdatera bearbetningsresultaten nedan.
    4. Observera snabblänksknappen , som visar antalet datauppsättningar som är associerade med gruppen. Klicka på den här knappen för att öppna en ny sida för datainsamlingar som visar de enskilda datauppsättningssamlingarna.

3. Åtkomst till den automatiska databehandlingen

OBS: När data har samlats in skickas de genom flera pipelines för automatisk databehandling. De fyra standardrörledningarna som används över MX-strålrören på Diamond körs också på data som samlats in vid strålröret. De är 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' och 'autoPROC'15. "fast_dp" ger en snabb datareduktion för att snabbt bedöma kvaliteten. De andra tre pipelines kräver mer beräkningstid och kör en mängd olika programpaket för dataminskning för jämförelse. Följaktligen är utdata vanligtvis av högre kvalitet än "fast_dp"-utdata. Datauppsättningar som samlas in på strålröret kommer också att köras genom den automatiska multikristallsammanslagningsprogramvaran "xia2.multiplex"14, som kommer att slå samman alla datauppsättningar inom en definierad grupp. Observera att även om rutnätsskanningar för närvarande inte bearbetas automatiskt kan data bearbetas manuellt med hjälp av pipelinen "xia2.ssx". Resultatet av de automatiska bearbetningsrörledningarna finns i ISPyB11 med hjälp av följande protokoll.

  1. Hitta datauppsättningarna
    1. Logga in på ISPyB enligt beskrivningen ovan och välj Förslag.
    2. Sök efter det förslag du är intresserad av genom att bläddra eller skriva in förslagsnumret i sökfältet.
    3. Klicka på önskat besök i listan som visas på skärmen för att öppna fönstret Datainsamlingar för det besöket.
    4. Använd önskade filter.
      Ett populärt filter är filtret "Automatiskt integrerat", som endast visar datauppsättningar som har körts via en eller flera bearbetningspipelines. Detta utesluter rutnätsskanningar eftersom dessa för närvarande inte bearbetas automatiskt via ISPyB.
    5. Rulla nedåt på sidan för att hitta den datauppsättning som är av intresse.
      OBS: Varje datauppsättning kommer att visa sample ID, de experimentella parametrarna som används, en diffraktionsbildvisare, en kristallbildvisare och en analysplott per bild för snabb observation av datakvalitet.
  2. Så här får du åtkomst till resultaten för automatisk bearbetning
    1. Klicka på fliken Automatisk bearbetning under datasammanfattningen för ett specifikt experiment för att granska resultatet av den automatiska datareduktionen (bild 6A).
    2. Klicka på de olika flikarna som motsvarar de olika pipelinerna för att se en detaljerad sammanfattning av varje utdata.
      OBS: Om exempelgrupper har definierats kommer det att finnas två flikar som motsvarar multiplexjobb. Den ena motsvarar sammanslagningen av alla datauppsättningar i gruppen fram till den punkten, medan den andra endast motsvarar sammanslagningen av datauppsättningar inom den droppen.
    3. Klicka på knappen Loggar och filer för att ladda ned de resulterande MTZ-filerna om bearbetningen lyckades och eventuella associerade loggfiler. Klicka på fliken Nedströmsbearbetning under avsnittet Automatisk bearbetning för att visa utdata från DIMPLE.
      DIMPLE körs endast om en PDB-fil angavs när provet skickades.
    4. Klicka på knappen Loggar och filer för att ladda ned eventuella resulterande utdata från DIMPLE.
  3. För att komma åt gruppmultiplexresultaten, öppna rullgardinsmenyn högst upp på skärmen med förslagsnumret skrivet på det och klicka på Sample Group Management. Klicka på den rad som motsvarar önskad grupp i rätt behållare. Scrolla ner för att hitta listan över multiplexutgångar som motsvarar gruppen som representeras visuellt av ett diagram över plattan.
    1. Klicka på önskad multiplexutgång från listan. Klicka på knappen xxx Data Sets ( xxx Data Sets (xxx är antalet sammanfogade datamängder) (bild 6B).
      Detta öppnar skärmen Datainsamlingar , men endast datauppsättningarna från det valda multiplexjobbet visas.
    2. Klicka på fliken Automatisk bearbetning i det översta experimentet.
    3. Klicka på fliken Multiplex Processing som motsvarar rätt antal sammanfogade datauppsättningar.
    4. Klicka på knappen Loggar och filer för att ladda ned .mtz och motsvarande loggfiler (som i steg 3.2.3).
  4. Så här får du åtkomst till rutnätsgenomsökningsresultat
    1. Navigera till skärmen Datainsamlingar för önskat besök. Resultaten av rutnätsskanningsdata kommer att visas tillsammans med alla rotationsdata som samlas in.
      OBS: Det kommer inte att finnas några resultat av automatisk bearbetning.
    2. Bilden av kristalldroppen kommer att ha rutnätet överlagrat med en värmekarta som representerar närvaron av diffraktion. Klicka på en fyrkant för att visa diffraktionsbilden för den positionen i rutnätet. Klicka på rullgardinsmenyn högst upp i kristallbrunnsbilden för att ändra vad värmekartan representerar. Standardvärdet är total intensitet för diffraktion men kan ändras till totalt antal fläckar, uppskattad upplösning eller bildrutor utan is.

4. Bearbetning av uppgifter

OBS: Valda datauppsättningar kan bearbetas om via ISPyB11-gränssnittet med samma bearbetningsförlopp som körs automatiskt med ändrade inställningar som definieras av användaren. En upplösningsgräns kan tillämpas. Om kristallens symmetri/cell är känd kan detta också definieras för att säkerställa att bearbetningsrörledningarna körs i rätt inställning. Välj bildintervall över specifika datauppsättningar kan också sammanfogas med hjälp av tillgängliga multikristallpipelines. Detta kan visa sig vara fördelaktigt om systematiska strålskador gör att den senare delen av diffraktionsbilderna är av dålig kvalitet. Det är också ett alternativ för användaren att ladda ner sina datauppsättningar med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan och köra önskad upparbetningsprogramvara lokalt, handledningar för vilka är fritt tillgängliga någon annanstans (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

  1. Så här bearbetar du om flera enskilda datauppsättningar
    1. Logga in på ISPyB och navigera till de datauppsättningar som är av intresse (steg 3.1).
    2. Klicka på en datauppsättning och klicka på kugghjulsikonen i datauppsättningens namnlist (bild 6) för att öppna ombearbetningsfönstret.
    3. Konfigurera önskade inställningar och välj vilka bildrutor som ska ingå i ombearbetningen.
      OBS: Bildintervallet kan definieras antingen genom att skriva ett intervall i de märkta rutorna eller genom att klicka och dra önskat område i analysdiagrammet per bild (Figur 7A).
    4. VALFRITT: Om du vill lägga till ytterligare en datauppsättning för individuell ombearbetning klickar du på kugghjulsikonen så visas den i ombearbetningsfönstret under den första datauppsättningen. Markera rutan Bearbeta individuellt .
    5. Klicka på knappen Integrera .
  2. Så här bearbetar du multikristalldata
    1. Öppna ombearbetningsfönstret från valfri datauppsättning.
    2. Klicka på Multi-Crystal-knappen för att öppna en ny skärm.
    3. Scrolla ner för att hitta en serie analysdiagram per bild från experiment under besöket.
    4. Välj en bearbetningspipeline i listrutan.
    5. VALFRITT: Definiera eventuella upplösningsgränser eller kända enhetscellparametrar.
    6. Klicka och dra för att definiera bildintervall som ska ingå i multikristallomarbetningen (figur 7).
      OBS: Detta bör göras över flera olika diagram så att datauppsättningar från flera olika kristaller slås samman.
    7. Klicka på knappen Integrera (Bild 7B).
  3. För att få tillgång till bearbetade data
    1. Navigera till sidan Datainsamlingar för det specifika besöket (steg 3.1.1-3.1.3).
    2. Klicka på knappen Ombearbetning högst upp på skärmen.
    3. Scrolla ner för att hitta önskat jobb.
    4. Klicka på filsökvägen i den högra kolumnen för att öppna skärmen Datainsamlingar för ombearbetade data.
    5. Öppna fliken Automatisk bearbetning och ladda ned data enligt beskrivningen tidigare (steg 3.2).
      Alla ombearbetade jobb kan identifieras med symbolen med cirkulära pilar bredvid pipelinenamnet.

Representative Results

Kristallisationsanläggningen och VMXi-strålröret har använts för en mängd olika projekttyper och användningsfall. Här är ett litet antal exempel för att illustrera vad användare kanske vill ägna sig åt.

Fallstudie 1: Standarddatainsamling

Strålröret möjliggör snabb bestämning av rumstempererade kristallstrukturer från ett litet antal kristaller i en kristallisationsplatta. Det minsta antalet kristaller beror på rymdgruppen och kristallorienteringen, men är ofta 1-4, även om förbättrad datakvalitet kan uppnås genom att slå samman data från flera tiotals kristaller. Ett färskt exempel är en av strålrörsstandarderna, taumatin. Flera kristaller, som visas i figur 8A, märktes upp för datainsamling manuellt enligt beskrivningen i protokollavsnitt 2.3. Dessa kristaller lades till i kön enligt beskrivningen i protokollavsnitt 2.4 och experimentella parametrar valdes från rullgardinslistan. När experimentella parametrar hade tillämpats ställdes plattan i kö för datainsamling. Datauppsättningar samlades in, skalades automatiskt och sammanfogades med hjälp av xia2.multiplex-pipelinen enligt beskrivningen i protokollavsnitt 3. Ett exempel på utdata från SynchWeb visas i figur 8A i mitten. Fem sammanslagna dataset gav upphov till ett dataset med en upplösning på 1,66 Å. För standarddatainsamling av cirka fem kristaller i en brunn samlades dataset in inom 2,5 minuter.

Fallstudie 2: Ligandbindning – Fragmentexperiment med Mac1-protein

Att producera strukturer av protein-ligandkomplex vid rumstemperatur kan enkelt uppnås med hjälp av strålröret. Ligander kan tillsättas till droppar på kristallisationsplattor (antingen manuellt eller genom akustisk droppinjektion) och data mätas efter en lämplig inkubationstid. I exemplet som beskrivs här dispenserades en serie fragment i brunnar som innehöll kristaller av SARS-CoV-2:s första makrodomän av proteinet nsp3 (Mac-1) i en kristallisationsplatta. Två av brunnarna som innehöll samma fragment tilldelades som en grupp enligt beskrivningen i protokoll steg 2.5. Multipla kristaller (42) markerades för datainsamling enligt beskrivningen i protokollsteg 2.3 och 2.4, och datauppsättningar samlades in med hjälp av standardparametrar (60° rotation, 0,1° steg, 0,00178 s exponering, 5 % transmission, 16 KeV - per kristall) (figur 8B). Datauppsättningar från de två brunnarna bearbetades automatiskt med hjälp av xia2.dials-pipelinen och därefter initierades xia2.multiplex-pipelinen för att automatiskt slå samman 22 av dessa datauppsättningar. DIMPLE kördes sedan på utdata från dessa pipelines och gav kartor som tydligt visade bevis på det bundna fragmentet. Fragmentmodellen byggdes in i den obebodda tätheten och förfinades ytterligare (figur 8B till höger). Ligandbundna strukturer vid rumstemperatur kan enkelt bestämmas med hjälp av denna serie steg för att ge ovärderlig information och återkoppling till den strukturbaserade läkemedelsdesignprocessen. För denna datainsamling av 42 kristaller från ett antal brunnar samlades dataset in inom 10 minuter.

Fallstudie 3: Strukturlösning med låg symmetri och föredragna orienteringar En stapel av multipla kristaller med plattliknande morfologi producerades från kristallisationsexperiment med ett gasbindande cytokrom av c-typ (figur 8C). Genom att välja flera positioner runt kanten av stacken där endast en enda kristall fanns i röntgenstrålen, var det möjligt att få en högkvalitativ datamängd till 1,75 Å upplösning genom att slå samman kilar från fyra kristaller, trots en monoklinisk (C2) rymdgrupp. Detta möjliggjorde snabba framsteg i projektet utan att kristallisationsförhållandena behövde optimeras ytterligare. Detta resultat har beskrivits tidigare9. För denna datainsamling av fyra kristaller i en brunn samlades dataset in inom 2 min.

Fallstudie 4: Erhållande av information och rumstemperaturstruktur från mikrokristaller i en platta med hjälp av seriell kristallografi

Ofta när mikrokristaller dyker upp i en droppe eller när användare försöker optimera mikrokristallisationsprotokoll i batch som en föregångare till seriella kristallografiexperiment vid synkrotron- eller XFEL-källor, är det till stor hjälp att få snabb återkoppling om diffraktionsegenskaperna och enhetscelldimensionerna för olika försök med minimalt material. I detta användningsfall pipetterades mikrokristaller av lysozym som växte i batch in i en kristallisationsplatta (200 nL volym per droppe) och data samlades in från åtta droppar med hjälp av en rutnätsskanning med en stegstorlek på 10 μm (figur 9). De resulterande 25 906 stillbilderna bearbetades med hjälp av programvara för seriell kristallografi, vilket resulterade i en datauppsättning, där 9 891 diffraktionsmönster indexerades och slogs samman för att producera en datauppsättning med en upplösning på 2,0 Å som förfinades väl mot den publicerade rumstemperaturstrukturen (R-arbete = 19,6 %,R-fritt = 23,6 % med PDB 8A9D) (Tabell 1). Detta möjliggjorde detaljerad analys av enhetscellfördelning och en bestämning av mikrokristallrumstemperaturstrukturen som kunde matas in i komplexa seriekristallografiexperiment inklusive tidsupplösta studier. Den totala volymen mikrokristallsuspension som krävdes var 1,6 μL. För denna datainsamling av mikrokristaller från åtta brunnar med hjälp av rutnätsskanningar samlades datauppsättningar in inom 40 minuter.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av protein-till-struktur-pipelinen som integrerar kristallisationsscreening, optimering vid kristallisationsanläggningen, automatiserad datainsamling och bearbetning vid rumstemperatur utan provskörd vid VMXi, XChem-fragmentscreening och datainsamling vid andra MX-strålrör. Användare kan starta rörledningen genom att leverera ett prov eller genom att ta plattor till VMXi-strålröret. Förkortning: Mångsidig makromolekylär kristallografi in situ. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Mosquito SPT Labtech-gränssnittet för inställning av kristallisationsplattor. (A) (1) Vyn MiTeGen In Situ-1-konfiguration. Välj MiTeGen 2 droppplatta genom att gå till (2) 96-hålars platttyp och välja (3) MiTeGen platta 2 droppplatta. För att ändra definitionsparametrarna för drop 1 och drop 2, som krävs för VMXi, klicka på redigeringsikonen (4). Detta öppnar ett nytt fönster (B) där (5) X- och Y-förskjutningarna måste ändras enligt bilden. Välj (B) underbrunn 2 och (C) underbrunn 3 och ändra värdena därefter. (D) CrystalQuickX Setup-vyn. Välj CrystalQuickX 2 droppplatta genom att gå till 96-hålars platttyp och välja MiTeGen platta 2 droppplatta. För att ändra definitionsparametrarna för släpp 1 och släpp 2, vilket krävs för VMXi, klicka på redigeringsikonen på samma sätt som ovan. Detta öppnar ett nytt fönster där (E,F) X- och Y-förskjutningarna måste ändras enligt bilden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: SynchWeb-gränssnittet visar hur du skapar en VMXi-försändelse, registrerar en skylt och kontrollerar kontaktuppgifter. Skärmdumpar av de olika stegen i uppladdningen av information till SynchWeb-gränssnittet visas från (A) rullgardinsmenyn, (B,C) registrering av en ny försändelse, (D) registrering av en ny container, (E) inmatning av skyltinformation, (F) kontroll av kontaktuppgifter och (G) en lista över registrerade behållare i ett förslag. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Välja och förbereda exempel för datainsamling med SynchWeb. En serie skärmbilder som visar de olika stegen i att förbereda prover för datainsamling med hjälp av SynchWeb-gränssnittet visas. (A) Punkter och regioner av intresse väljs från översikten. I den nedre delen av denna panel finns en kronologisk serie fotografier av en droppe. (B) Ett exempel på CHiMP-utdata för en platta som markerar resultat för kategorin "kristall". (C) Lägga till prover i kön från listan över valda punkter och regioner och (D) tillämpa parametrar för datainsamling på de köade proverna från rullgardinsmenyn med experimentinställningar som skapats av strålröret. Observera skillnaden mellan prover utan experimentella parametrar (i rött) jämfört med de som har korrekt tillämpade parametrar (överst och nederst). Längst ner på denna panel finns knappen Köbehållare , som köar plattan som ska samlas på strålröret. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Exempel på skapande av grupp i SynchWeb. En serie skärmbilder som visar de olika stegen för att skapa exempelgrupper. (A) Plattan/plattorna som innehåller prover väljs ut från den relevanta försändelsen och (B) dropparna i plattan väljs. Dessa kan vara enskilda droppar eller kan väljas efter rad och/eller kolumn. C) En förteckning över urvalsgrupper som redan har skapats. (D) Utdata från de tre senaste multiplexbearbetningsjobben listas och kan väljas för att visa statistik från bearbetningspipelinen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Databehandling och datareduktion. (A) Skärmdump av en bearbetad datauppsättning i ISPyB11. Knappen för att komma åt rengöringsfunktioner är markerad. Exempel-ID och experimentella parametrar visas längst upp till vänster och diffraktionsbildvisaren i mitten. Genom att klicka på den här bilden öppnas ett interaktivt fönster för att undersöka olika bilder. Kristallbildvisaren visas till höger och genom att klicka på den här bilden öppnas också ett interaktivt fönster för att jämföra strålrörs- och Formulatrix-lagringsbilder. Analysdiagrammet per bild visas längst till höger och genom att klicka på den här bilden öppnas en förstorad version av dessa utdata. Om du klickar på fliken Automatisk bearbetning blir den automatiska bearbetningen synlig och gör det enkelt att jämföra resultaten av de olika pipelines. Klicka på flikarna för att växla mellan de olika bearbetningsförloppen och visa detaljerade utdata från den valda pipelinen. Knappen Loggar och filer för datanedladdning är markerad. Om du klickar på fliken Nedströmsbearbetning expanderas och resultat visas för alla datauppsättningar som körs via pipelines efter datareduktion där det är lämpligt. (B) Skärmdump från skärmen Sample Group Management . Det användardefinierade gruppnamnet finns högst upp och den visuella beskrivningen av de inkluderade brunnarna kan ses nedan. En grön brunn indikerar att alla kristaller som mäts från den droppen kommer att inkluderas i gruppen. En sammanfattning av olika multiplexjobb som utförs på den gruppen kan ses och under finns detaljerade utdata från multiplex. Knappen Datauppsättningar för att undersöka de inkluderade experimenten är markerad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Fönster för ombearbetning av data. (A) Individuella och (B) multikristalldatamängder. Två enskilda datauppsättningar visas där dataområden har valts. När kryssrutan Bearbeta individuellt är markerad kommer de valda diffraktionsbilderna att bearbetas individuellt genom att trycka på knappen Integrera . Om du klickar på Multi-crystal-knappen öppnas en visning av de enskilda datauppsättningarna. Om du vill bearbeta om diffraktionsbilder från flera datauppsättningar markeras bildområden som de visas och ombearbetningen initieras genom att klicka på knappen Integrera som markerad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Representativa resultat från VMXi-pipelinen. (A) Märkta kristaller för proteinet taumatin inom en kristallisationsdroppe (vänster panel), databehandlingsresultat (mittpanel) och elektrondensitet (höger panel). (B) Insamling på flera kristaller för att bestämma fragmentets bindning till SARS-CoV-2 makrodomän. Dataset samlades in på flera kristaller i närvaro av ett fragment från EU-OPENSCREEN-fragmentskärmen med hjälp av experimentella standardinställningar. Exempel på dessa datainsamlingar visas i detta utdrag från SynchWeb. Fragmentet byggdes in i motsvarande densitet och förfinades ytterligare som visas längst till höger. (C) Märkta monokliniska kristaller i en stapel från en utmanande kristallisationsträff som används för datainsamling. Gröna kryss och röda siffror visar var data mättes med en stråle på 10 μm och 60° rotation. Fyra av de resulterande kilarna slogs samman för att producera en datauppsättning med 1,75 Å upplösning. Elektrontätheten runt Heme-gruppen visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Seriell kristallografi i kristallisationsplattan. (A) Optisk bild av kristallisationsdroppen, med en vit ruta som representerar det intressanta området. (B) Definition av rutnätsskanningspunkter. C) Värmekarta som visar diffraktion. (D) Elektrontäthetskarta som härrör från en seriell kristallografidatauppsättning från mer än 9 000 stillbildsdiffraktionsmönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Resolution (Å) Fullständighet (%) Multiplicitet I/σ(I) R split  CC1/2  Unika observationer
Övergripande 100 95.5 20.8 0.063 0.998 8422
Låg (55,55 - 5,43) 100 147.1 81.7 0.028 0.999 488
Hög (2,03 -2,00) 100 75.3 1.2 1.092 0.410 411

Tabell 1: Datastatistik för den seriella VMXi RT-datauppsättningen. Förkortningar: I = medelintensiteten för de skalade observationerna; R-delning = ett mått på avvikelsen mellan de uppmätta intensiteterna, CC 1/2 = korrelationskoefficienten mellan två slumpmässiga halvor av materialet.

Discussion

Vi har beskrivit hela proceduren från ankomsten av ett proteinprov i CF till nedladdning av de slutliga data av användaren för vidare applikationer. Kritiska steg är produktion av ett högkvalitativt proteinprov och lämpliga kristallskärmar, antingen med hjälp av kommersiella glesa matrisskärmar eller optimeringsskärmar baserade på etablerade förhållanden. Denna process kan äga rum i CF, eller så kan användare utföra kristallisationsprocedurerna i hemlaboratorierna och ta med lämpliga kristallisationsplattor till strålröret. Det kan vara viktigt att identifiera lämpliga parametrar för datainsamling för vissa prover, särskilt när det gäller strålningsskador. I de flesta fall är automatiserad databehandling fullt tillräcklig för att besvara den vetenskapliga frågan, även om användarna behåller möjligheten att bearbeta med hjälp av strålrörsverktygen, till exempel när rymdgruppen är tvetydig eller endast den första delen av de insamlade uppgifterna används för att minimera strålningsskadorna.

Om lämpliga kristaller inte produceras från initiala kristallisationsförsök, kan förändringar i proteinkoncentration, renhet eller kristallisationsskärmar undersökas, liksom användningen av kristallsådd. Om kristaller inte diffrakterar till en användbar upplösning vid strålröret, kan rutnätsskanningar användas med en odämpad stråle för att bedöma kristallernas inneboende diffraktionsgräns och enhetscell för att vägleda optimeringsinsatser. Kristaller som är för små för datainsamling i plattor (t.ex. <10 μm) kan istället vara lämpliga för seriell kristallografi eller nanofokusexperiment (t.ex. vid diamantstrålröret VMXm). Att lösa strukturer med hjälp av VMXi-data är i allmänhet enkelt genom molekylär ersättning, särskilt sedan tillkomsten av Alphafold16 för att ge effektiva sökmodeller. Om detta inte lyckas kan kristaller skördas och kryokylas från plattor för att möjliggöra konventionella envåglängdsavvikande diffraktion, flervåglängds anomal diffraktion eller fasningsexperiment med långa våglängder.

Fördelarna med denna metod inkluderar möjligheten att få snabba, högkvalitativa dataset och återkoppling direkt från kristallisationsplattor utan att behöva störa kristaller från de miljöer där de har vuxit. Den så kallade "rumstemperaturrenässansen" inom strukturbiologi premierar strukturer som erhålls under icke-kryogena förhållanden för att möjliggöra mer fysiologisk relevans och proteindynamikatt utforskas. Vanligtvis uppnås en något lägre upplösning än för en optimerad kryokyld kristall men endast när lämpliga kryoförhållanden har etablerats och om kristallerna är robusta för mekanisk hantering och öppning av kristallisationsdroppe3. En kommande applikation för vilken denna pipeline är mycket väl lämpad är en storskalig screening av protein-ligandkomplex eller fragmentkampanjer vid rumstemperatur inom läkemedelsutveckling. Ligander eller fragment kan antingen samkristalliseras eller tillsättas genom pipett eller akustisk dropputkastning före insamling av rumstemperaturdata. En annan tillämpning är att snabbt mäta data från många hundra eller tusentals kristaller på ett mycket effektivt sätt och sedan använda programvaran DIALS17 multiplex14 för att extrahera isomorfa kluster som kan representera olika biologiska enheter eller för att fastställa statistiskt signifikanta skillnader mellan populationer av kristaller som har behandlats på ett annat sätt eller exponerats för olika ligander eller signaler.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi erkänner de många Diamond Light Source-forskare och supportteammedlemmar som bidrog till designen, konstruktionen och driften av VMXi-strålröret. Vi är tacksamma för strålrörsanvändare, som senare har bidragit med idéer till utvecklingen av kristallisations- och datainsamlingspipelines. Kristallisationsanläggningen vid Harwell stöds av Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Institute och Medical Research Council.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formulator Formulatrix on request Liquid handling robot
Formulatrix imager Formulatrix on request Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X  Greiner Z617644 Crystallisation plate
Gryphon  Art Robbins Instruments 620-1000-10  Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1 Mitegen InSitu-01CL-40 Crystallisation plate
Mosquito LCP  (SPT Labtech) on request Crystallisation robot
Rock Imager & Maker Formualtrix on request Software for Imager
[1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion Art Robbins Instruments 640-1000-10  Liquid handling robot
https://www.artrobbins.com/scorpion

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).
  2. Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1 (2021).
  3. Helliwell, J. R. What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).
  4. Thorne, R. E. Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).
  5. Keedy, D. A., et al. Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr. Structure. 22 (6), 899-910 (2014).
  6. Huang, C. Y., et al. Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).
  7. Sanchez-Weatherby, J., et al. Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).
  8. Jacquamet, L., et al. Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam. Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).
  9. Mikolajek, H., et al. Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi. IUCrJ. 10, 420-429 (2023).
  10. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source. Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).
  11. Delageniere, S., et al. Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  12. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. Synchweb: A modern interface for ispyb. Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).
  13. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology. JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).
  14. Gildea, R. J., et al. Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).
  15. Winter, G., Mcauley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with alphafold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  17. Winter, G., et al. Dials as a toolkit. Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).

Tags

Biokemi utgåva 205 omgivningstemperatur rumstemperatur in situ kristallisation automatisering
Kristallisation och insamling av rumstemperaturdata på <em>plats</em> med hjälp av kristallisationsanläggningen vid Harwell och strålröret VMXi, diamantljuskälla
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sandy, J., Mikolajek, H., Thompson,… More

Sandy, J., Mikolajek, H., Thompson, A. J., Sanchez-Weatherby, J., Hough, M. A. Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (205), e65964, doi:10.3791/65964 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter