Krystallisasjon og in situ romtemperaturdatainnsamling ved bruk av krystallisasjonsanlegget ved Harwell og Beamline VMXi, diamantlyskilde

Summary

Vi presenterer en protokoll for krystallisering av proteiner ved bruk av krystallisasjonsanlegget i forskningskomplekset ved Harwell og påfølgende in situ røntgenkrystallografisk datainnsamling fra krystaller i platene ved Diamonds allsidige makromolekylære krystallografi in situ (VMXi) strålelinje. Vi beskriver prøvekrav, krystallisasjonsprotokoller og retningslinjer for datainnsamling.

Abstract

Protokoller for robotproteinkrystallisering ved bruk av krystallisasjonsanlegget ved Harwell og in situ romtemperaturdatainnsamling fra krystallisasjonsplater ved Diamond Light Source beamline VMXi er beskrevet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å bestemme krystallstrukturer av høy kvalitet fra flere krystaller på en enkel måte og gir svært rask tilbakemelding på resultatene av krystallisasjonsforsøk, samt muliggjør seriell krystallografi. Verdien av romtemperaturstrukturer for å forstå proteinstruktur, ligandbinding og dynamikk blir stadig mer anerkjent i strukturbiologisamfunnet. Denne pipelinen er tilgjengelig for brukere fra hele verden med flere tilgjengelige tilgangsmåter. Krystallisasjonseksperimenter som er satt opp, kan avbildes og vises eksternt med krystaller identifisert automatisk ved hjelp av et maskinlæringsverktøy. Data måles i et købasert system med opptil 60° rotasjonsdatasett fra brukervalgte krystaller i en plate. Data fra alle krystallene i en bestemt brønn eller prøvegruppe blir automatisk slått sammen ved hjelp av xia2.multiplex med utgangene som er lett tilgjengelige via et nettlesergrensesnitt.

Introduction

Røntgenkrystallografi er fortsatt et sentralt verktøy for å forstå proteinstruktur og funksjon, og gir høyoppløselige strukturer av proteiner eller deres komplekser med for eksempel substrater eller legemiddelkandidater. I mange tilfeller er imidlertid oppnåelse av krystaller med ønskelige egenskaper - svært diffracting, krystallform som er egnet til bløtlegging og uten krystallpatologier som twinning - fortsatt en betydelig flaskehals¹. Siden egnede kjemiske forhold for å produsere proteinkrystaller generelt ikke kan forutsies, er krystallisasjonsscreening som utforsker tusenvis av potensielle kjemiske blandinger standard, ofte hjulpet av automatisering / robotikk ved innstilling av skjermer og krystallhoteller for overvåking, ofte eksternt, krystallisasjonsdråpebildene som er registrert.

Når krystaller oppstår, må de vanligvis høstes fra krystallisasjonsmiljøet ved hjelp av en nylon- eller Kapton-sløyfe og deretter overføres til en dråpe som inneholder et kryobeskyttelsesmiddel (søket etter dette er en ekstra variabel) før de stuper frysing i flytende nitrogen. Disse ekstra trinnene mellom krystallisering og røntgendatainnsamling kan innebære dehydrering av krystallisasjonsdråpen når det forseglede miljøet er ødelagt, mekaniske belastninger på krystallet når det håndteres, og skade fra kryobeskyttelsesmidlene til krystallgitteret (vanligvis resulterer i økt mosaikkspredning) blant andre faktorer². I tillegg er krystallhøsting tid- og arbeidskrevende og kan føre til inhomogenitet mellom prøvene, spesielt når huden dannes på dråper under høstingsprosessen. VMXi-strålelinjen gir tilgang til brukbare data fra krystaller som sitter fast på platen, som ellers ville blitt kassert for datainnsamling.

De aller fleste røntgenkrystallstrukturer bestemmes ved 100K ved hjelp av tilnærmingen ovenfor, noe som muliggjør enkel krystalltransport og håndtering og øker krystalllevetiden i røntgenstrålen med størrelsesordener. Det er imidlertid økende interesse for å bestemme strukturer under ikke-kryogene forhold, det vil si mye nærmere de fysiologiske forholdene som er relevante for proteinfunksjon ^2,3,4. Dette muliggjør en mye bedre forståelse av den dynamiske strukturen til proteiner, unngår aminosyrekonformasjoner eller sløyfer som fryses ut i funksjonelt ikke-relevante tilstander⁵, og gjør det mulig å utforske ligandbinding under forhold som er mye nærmere de i proteinets naturlige miljø i cellen og organismen⁶.

En alternativ tilnærming, implementert ved Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) strålelinjen ved Diamond Light Source-synkrotronen, Storbritannia, er å måle diffraksjonsdataene direkte fra krystaller i miljøet de har vokst i (dvs. i krystallisasjonsplaten), under omgivelsesforhold og uten forstyrrelser ^7,8. Dette muliggjør svært rask tilbakemelding fra krystallisasjonsskjermer og optimaliseringer for å veilede en bruker til en optimal krystallform for deres behov. Det gjør det også mulig å produsere romtemperaturstrukturer av høy kvalitet på en automatisert måte⁹.

Denne protokollen forutsetter at en bruker har en svært ren proteinprøve klar for krystallisering. Vi beskriver brukeropplevelsen til krystallisasjonsanlegget ved Harwell for å produsere proteinkrystaller og deretter bruke beamline VMXi for datainnsamling (figur 1).

Krystallisasjonsanlegget ved Harwell

Krystallisasjonsanlegget ved Harwell (CF) ligger i forskningskomplekset ved Harwell (RCaH) ved siden av Diamond Light Source. Anlegget tilbyr brukerne et automatisert laboratorium med høy gjennomstrømning for makromolekylær krystallisering, ved hjelp av robotikk for krystallisasjonsscreening, krystalloptimalisering, krystallavbildning og karakterisering. Gjennom tett integrasjon med den høyt automatiserte VMXi-strålelinjen har tempoet for bestemmelse av romtemperaturstrukturer akselerert kraftig og muliggjør karakterisering av nye proteinstrukturer, proteinligand- og DNA-ligandkomplekser, samt automatisert fragmentscreening (figur 1), alt under ikke-kryogene forhold.

CF-rørledningen er en pakke med instrumentering som omfatter nanoliter krystalliseringsroboter⁹ for krystallisering av løselige og membranproteiner, væskehåndteringsroboter for å forberede kommersielle krystallisasjonsskjermer og komplekse tilpassede optimaliseringsskjermer, og fire bildebehandlingsinstrumenter (en ved 4 ° C og tre ved 20 ° C for avbildning av krystallisasjonsplater (se materiallisten). Ett bildeapparat er i stand til å avbilde lipidkubisk fase (LCP) glassplater og ett bildeapparat er utstyrt med multifluorescensoptikk (begge ved 20 °C).

Anlegget brukes nå mye av et bredt spekter av akademiske og industrielle brukere, inkludert Membrane Protein Laboratory (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem fragment screening ^{facility 10}, MX beamlines, XFEL-hub, samt Rosalind Franklin Institute (RFI). Denne veletablerte og optimaliserte rørledningen har gjort det mulig å utføre krystallisasjonseksperimenter over et bredt spekter av strukturelle biologiske prosjekter. Denne artikkelen beskriver rørledningen for krystaller beregnet for datainnsamling ved VMXi, selv om krystaller også kan høstes og kryokjøles eller ledes til XChem-rørledningen.

Brukertilgang tildeles gjennom Diamond MX-forslagssystemet (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) og industrielle brukere støttes gjennom Diamond Industry Liaison-gruppen. Alle brukere kan komme til nettstedet med prøven (e) eller platene, som kan transporteres for hånd. Det anbefales ikke å sende plater med bud, da vår erfaring tyder på at dråper kan bevege seg bort fra stedet der de ble dispensert, eller dråper kan bli skadet av krystallisasjonsreservoaret. Alternativt, etter avtale, kan brukerne sende sine proteinprøver til CF, hvor ansatte setter opp krystallisasjonseksperimenter på deres vegne. Eksperimentene kan overvåkes eksternt av brukeren ved enten å logge på Rock Maker Web i tilfelle CF eller via ISPyB når det gjelder VMXi. Tilgang til CF kan utføres på en iterativ måte basert på røntgendiffraksjonsresultatene samlet inn på Diamond.

Beamline VMXi på Diamond Light Source

Beamline VMXi (heretter kalt "strålelinjen") er et unikt og nyutviklet instrument fullt dedikert til romtemperatur, høyautomatisert røntgenkrystallografi med fokus på måling av data fra krystaller i egnede krystallisasjonsplater. Strålelinjen tilbyr et mikrofokus (10 x 10 μm), rosa stråle (båndpass på <5 × ^10-2ΔE / E) med en høy fluks på ~ 2 × 10¹³ fotoner / s (ved 16 KeV) ⁷. Denne høyfluxstrålen, kombinert med en rask detektor, muliggjør svært høy gjennomstrømning av prøver og innsamling av data fra prøver oppover 10 μm i størrelse.

Krystallisasjonsplater kommer inn i strålelinjen ved å lagres i et prøvelagringssystem og avbildes basert på tidsplanen gitt av brukeren mens platene registreres ved hjelp av ISPyB^{11-grensesnittet} SynchWeb¹². Vanligvis anbefales brukere å velge en Fibonacci-sekvens av tidspunkter for avbildning (0, 12, 24, 36, 60... 7,320 timer fra platen som legges inn i systemet). Brukeren blir informert via e-post når en plate er avbildet. Både synlig lys og UV-lysavbildning er tilgjengelig for brukere på forespørsel. Bildene tatt av prøvelagringssystemet analyseres av en maskinlæringsalgoritme; Dette lokaliserer og definerer automatisk interessepunkter for objekter som ligner krystaller og registrerer interessepunktene som er klare for brukeren å legge til i en kø for datainnsamling. Brukere kan også manuelt klikke på bildene i synlig lys for å registrere interessepunkter eller klikke og dra et område som skal analyseres ved rasterskanning. Disse punktene er tilgjengelige for brukere å legge til i køen sammen med de automatisk lokaliserte punktene.

Når alle prøvene har riktige parametere for datainnsamling, går platen inn i en kø. Når platen når toppen av køen, blir den automatisk dispensert til strålelinjen. Krystallisasjonsplatene lastes automatisk fra krystallhotellene inn i strålelinjen av en robotarm, og etter bildematching måles krystallografiske datasett med opptil 60 ° rotasjon fra hver valgte krystall i henhold til brukerdefinerte instruksjoner. Alle dråper i en plate kan brukes til disse forsøkene på strålelinjen. Data slås sammen fra flere krystaller for å produsere isomorfe, optimalt sammenslåtte datasett på en automatisert måte ^7,9. Når alle datasettene i kø er samlet inn, sendes brukeren en e-post med en lenke som skal følges for å se datasettene i ISPyB¹¹, som i andre Diamond MX-strålelinjer. Brukere blir også dirigert til beamline-nettsiden (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocol

1. Fremstilling av krystaller innenfor in situ-plater ved bruk av krystallisasjonsanlegget ved Harwell

MERK: Tilgang til CF støttes av en rekke forskjellige ruter og avhenger av anvendelsen av prosjektet og brukertypen (akademisk eller industri). XChem- og MPL-prosjekter har sitt eget søknadssystem via brukeradministrasjonssystemet (UAS) og kan sendes enten via standard tilgangsrute (inkludert iNEXT Discovery og EUbOPEN) eller BAG Access. Protokollen nedenfor er spesifikk for VMXi-brukere.

1. Forslag innlevering og forberedelse til besøket
   1. Gi informasjon om prosjektet til et BAG-forslagsprogram eller legg det til et aktivt BAG-forslag. Det er vanligvis en BAG-koordinator, som organiserer papirarbeidet. Alternativt kan du sende inn et forslag om rask tilgang til strålelinjen.
   2. Sørg for at prøven er registrert og sikkerhetsvalidert i UAS på et forslag før ankomst på stedet, enten med bud eller personlig.
   3. Kontroller at brukeren er registrert (med FedID og passord).
   4. Forsikre deg om at brukeren er lagt til i et MX-forslag som tilknyttet i UAS av BAG-koordinatoren.
   5. Fyll ut skjemaet for strålekrystallisasjonsprøvedetaljer og send skjemaet til VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Kommuniser med strålelinjepersonalet om eksperimentkravene og strålelinjetilgjengeligheten.
   7. Hvis proteinprøver sendes, sendes bare prøver etter avtale. Se pkt. 1.2 for detaljer.
   8. Hvis brukeren skal komme inn på stedet for å sette opp krystallisasjonsplater i CF, må du sjekke med anleggspersonalet om tilgjengeligheten av en tidsluke for å bruke anleggsinstrumenteringen og følge seksjon 1.2.1.
   9. Hvis brukeren bringer plater på stedet, må du sørge for at prøven blir dispensert i riktig platetype og plassere krystalliseringsdråpene på riktig sted og riktig mengde. Følg kapittel 1.2.2. Strålelinjen aksepterer bare spesifikke in situ krystallisasjonsplater (Greiner CrystalQuickX og MiTeGen In Situ-1); sørg for at dråpene ikke er større enn 200 nL.
2. Krystallisasjonseksperiment utført ved CF
   MERK: Anlegget tilbyr en rekke makromolekylære krystallisasjonsmetoder med høy gjennomstrømning som dampdiffusjon samt batchkrystallisering under olje og LCP. Det anbefales å starte med 70-100 μL rent protein og utføre dampdiffusjonseksperimenter for løselige proteiner med tre skjermer ved å bruke et forhold på 100 nL proteinoppløsning og 100 nL krystallisasjonsreservoarløsning og inkubere platene ved 20 ° C. En rekke kommersielle skjermer er tilgjengelige i anlegget. Fuktighet og temperaturregulering er tilgjengelig med 4 °C og 20 °C mest brukt. Brukere som besøker CF får standardisert opplæring og støtte til å betjene krystallisasjonsinstrumenteringen og vil bruke innstillingene som er beskrevet her.
   1. Forsendelsesprøver for oppsett på CF
      MERK: Før ankomst på stedet, må proteinprøven ha blitt validert på et forslag i UAS-systemet. Når proteinprøven har ankommet stedet, vil medarbeiderne sette opp krystalliseringseksperimenter som beskrevet i tidligere kommunikasjon med brukeren. Bekreftelse vil bli sendt via e-post med strekkodeinformasjon for de eksperimentelle krystallisasjonsplatene. Brukeren vil bli bedt om å legge krystallisasjonsplatene som beholdere til det aktuelle forslaget. Når dette er gjort, kan platene lagres i automatiserte bildeapparater i krystallisasjonsanlegget eller ved strålelinjen. ISPyB vil være grensesnittet som brukes til samhandling ved strålelinjen.
      1. Tilveiebringelse av proteinprøveløsningen ved konsentrasjonen for krystallisering i multipler av 25 μL alikoter. Merk tydelig prøverørene som inneholder proteinprøven.
      2. Hvis nødvendig, gi en proteinbufferløsning, ligandoppløsning eller reservoarløsning.
      3. Informer anleggspersonalet om hvilke skjermer og fallforhold som skal brukes.
   2. Innstillinger for krystallisasjonsplate
      MERK: Vi krever krystallisasjonsdråpene i Greiner CrystalQuickX og MiTeGen In Situ-1-platen å være på et bestemt sted; plater satt opp andre steder bør bruke følgende Mosquito^{13-innstillinger} beskrevet her.
      1. For å justere platedefinisjonen for MiTeGen In Situ-1, åpne Mosquito SPT-programvaren og klikk på standard MiTeGen In Situ-1-platedefinisjonssiden ved å klikke på Oppsett | 96 Vel | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 dråper) (figur 2A). Klikk på redigeringsknappen og endre verdiene for plassering av brønn 2: X Forskyvning til - 1,2 og Y Forskyvning til 1,8 og for underbrønn 3 plassering: X Forskyvning til 1,3 og Y Forskyvning til 1,8 (figur 2B,C).
      2. For å justere platedefinisjonen for Greiner CrystalQuickX, åpne Mosquito SPT-programvaren og klikk på standard Greiner CrystalQuickX platedefinisjonsside ved å klikke Setup | 96 Vel | Greiner CrystalQuickX (figur 2D). Klikk på redigeringsknappen og endre verdiene for sub well 1 plassering: X Offset til - 1,95 og Y Forskyvning til 1,45 og for sub brønn 2 plassering: X Forskyvning til 1,95 og Y forskyvning til 1,45 (figur 2E,F).

2. Bruke strålelinjen ved Diamond Light Source

MERK: All interaksjon med strålelinjen av brukere utføres eksternt ved hjelp av ISPyB^{11-grensesnittet} . Ingen fysisk tilstedeværelse ved strålelinjen er nødvendig, og data samles inn ved hjelp av et købasert system i stedet for å bli planlagt på et bestemt tidspunkt. Brukere vil ha et forslag knyttet til deres Diamond Light Source-tilgang. Ved strålelinjen tildeles hver krystallisasjonsplate et unikt besøk og er definert som en "beholder" i ISPyB¹¹ analogt med en puck som inneholder prøver ved 100 K. Optimaliseringsskjermer kan ikke opprettes ved hjelp av SynchWeb-grensesnittet, og som sådan blir informasjon vanligvis lagt til i kommentarfeltet (se trinn 2.1.4.). Den enkelte som registrerer platen må sjekke e-postadressen, da plateeieren vil motta e-postmeldinger angående bildebehandling samt varsler om utfylte plater.

1. Registrere plater
   1. Logg inn på ISPyB med en passende Diamond FedID og velg Forslag. Søk etter forslaget av interesse ved å rulle eller skrive inn forslagsnummeret i søkefeltet. Velg Forsendelse fra rullegardinmenyen under forslagsnummeret (figur 3A), som åpner Forsendelser-vinduet med forsendelser i det forslaget. Klikk på +Legg til forsendelse øverst til høyre (figur 3B) for å åpne vinduet Legg til ny forsendelse , gi forsendelsen et navn, klikk på Automatisert/Bildekamera og klikk deretter på Legg til forsendelse-knappen nederst til venstre (figur 3C).
   2. I forsendelsesvinduet (figur 3D) klikker du på +Legg til container, som deretter viser sidevisningen Legg til container (figur 3E). Velg en av de relevante platetypene i rullegardinmenyen Containertype. Siden endres for å gjenspeile containertypen som ble valgt. Skriv inn et strekkode- og beholdernavn i henhold til e-postinstruksjoner fra strålelinjepersonalet som er spesifikt for eksperimentplatene. Merk at den skiller mellom store og små bokstaver.
   3. Velg VMXi 20 °C fra rullegardinmenyen Forespurt bilde, Fibonacci-bildeplanen fra rullegardinmenyen Bildeplan , krystalliseringsskjermen fra rullegardinmenyen Krystalliseringsskjerm og brukernavnet fra rullegardinmenyen Eier , klikk på Vis-knappen og skriv inn riktig kontakt-e-postadresse i E-post-boksen (figur 3F).
   4. Skriv inn flere detaljer om platen i Kommentarer-boksen . Velg den aktuelle prøven fra rullegardinmenyen Protein , og bruk akronymet registrert i UAS og godkjent av Diamond i det eksperimentelle forslaget. Skriv inn samme navn i Eksempelnavn-boksen ; La de resterende boksene stå tomme.
   5. Klikk på +Plate-ikonet for å replikere prøven over hele platen og fylle hele beholderen med grønne firkanter. Klikk på +Legg til beholder nederst på siden for å registrere platen. Be en medarbeider ved strålelinjen om å overføre platen til riktig bildeapparat, hvor den vil bli lagret og avbildet. Et besøk vil bli generert når beholderen er lagret i bildene, og brukeren vil motta en e-post med en lenke til platen og dens bilder.
2. Vise bilderesultater
   1. Naviger til forslaget av interesse (trinn 2.1.1), velg Containere fra rullegardinmenyen under forslagsnummeret, og følg listen over tilgjengelige beholdere for forslaget. Velg filterplatene hvis det finnes andre prøveholdertyper. Hvis du vil begrense søket ytterligere, merker du av for Mine beholdere for å bare vise de mest relevante beholderne som er knyttet til gjeldende påloggede bruker-ID. Klikk den aktuelle beholderen ved å flytte markøren over den enkelte linjen og venstreklikke med musen.
   2. Når du velger beholderen, vises en ny visning som viser en oversikt over platen (figur 4A). Klikk på en dråpe i platerepresentasjonen på venstre side av skjermen for å vise det nyeste bildet fra den respektive dråpen. Bruk piltastene til å navigere mellom dråper, eller velg individuelle dråper ved hjelp av en mus / markør.
   3. For å se historiske bilder av en dråpe, klikk på H-knappen og vent til et popup-galleri med bilder vises over det nåværende brønnfallbildet. Hold markøren over de enkelte bildene for å oppdatere hovedfallbildet.
   4. Score bilder for å indikere statusen til hver dråpe ved å trykke på 0 - 9 knappene. For å se de enkelte kategoriene, åpne rullegardinmenyen Poengsum øverst til venstre på slippbildet. Se etter blå kryss i hvert av fallbildene, som er et resultat av en algoritme (CHiMP) trent til å lete etter "krystaller" i bildene.
   5. Klikk på den tredje ikonknappen som heter Mål øverst til høyre på slippbildet for å få tilgang til et måleverktøy. For å bruke dette verktøyet, klikk og dra en linje, og en linjal vil utvide og gi avstanden i μm.
   6. Hvis du vil be om en ekstra bildeøkt, klikker du på enten Synlig eller UV i rullegardinlisten ved siden av Handlinger-overskriften nederst på siden. Klikk deretter på knappen Be om plateavbildning .
3. Krystallvalg/CHiMP
   1. Hvis du vil legge til punkter for datainnsamling manuelt, trykker du på +Merk punkt-knappen . Hold markøren over ønsket interessepunkt og velg. Vent til et rødt kryss vises.
      MERK: Opptil 100 objekter kan opprettes per dråpe.
   2. Når alle punktene er merket, klikker du på +Fullfør-knappen . Husk også å klikke på +Fullfør-knappen før du prøver å måle objekter. For å legge til regioner for datainnsamling via rutenettskanninger, klikk på +Merk region-knappen . Klikk på pek øverst til venstre og dra ned og til høyre for å lage et område som vil bli rasterskannet på strålelinjen. Som med poeng, klikk på + Fullfør-knappen når alle ønskede regioner er opprettet.
      MERK: Det er bedre å opprette en større region enn mange små regioner.
   3. Observer de blå kryssene allerede på slippbildene, som er resultatet av en algoritme designet for automatisk å lokalisere krystallinske objekter (CHiMP). For å visualisere CHiMP-vurderingen av krystallisasjonsdråper, klikk i avmerkingsboksen Vis automatiske poengsummer og endre deretter rullegardinmenyen for Klasse. Vanligvis er den mest nyttige innstillingen her krystallalternativet (figur 4B).
      MERK: Dette er en ny funksjon, og det er ikke garantert å finne alle krystaller og kan også finne andre objekter som ikke er krystaller.
   4. Når alle punkter og regioner er merket i de respektive slippene, klikker du på Forbered deg på datainnsamlingsknappen nederst på siden.
4. Klargjøre prøver for datainnsamling
   1. Se listen over prøver som inneholder punktene eller regionene som ble valgt i forrige trinn, eller automatisk plassert (figur 4C). Legg til enkeltpunkter eller regioner ved å trykke på + -knappen, eller legg til alle eksemplene som vises, ved å klikke knappen Legg til gjeldende side i køen .
   2. Filtre er tilgjengelige for å vise bare punkt, region, autopunkt eller manuelle punkt. Hvis du bare vil vise de prøvene som ikke er tatt (dvs. eksponert for røntgenbilder), klikker du alternativene Uten data og Ikke fullført over filterknappene.
   3. Velg individuelle prøver ved å klikke på den respektive linjen og oppdater bildet på høyre side av skjermen for å vise riktig fall og individuelt punkt. Hvis det er mange eksempler i listen, øker du antall eksempler som vises per side ved å velge rullegardinmenyen med 10 som standard og opptil 100 som maksimalt antall eksempler som vises.
   4. Når alle punktene og områdene er lagt til i køen, må du sørge for at alle parametere for eksperimentell datainnsamling er knyttet til hvert eksperiment.
      1. Bruk filtre for Punkt, Område, Manuell og Auto. Klikk på punktfilteret og klikk på Merk alle avmerkingsboksen under filterknappene for samtidig å bruke parametere på alle prøver som er synlige i gjeldende liste over prøver i kø .
      2. Velg eksperimentelle parametere fra rullegardinmenyen på høyre side av skjermen under slippbildet (figur 4D). For regioner velger du alternativet Grid Scan DMM 10 mikron trinn, 100 prosent overføring. For alle andre punkteksperimenter velger du andre alternativer fra rullegardinmenyen etter behov.
      3. For innsamling av oscillasjonsdata, klikk på overføringsalternativet Omega Scan DMM 60 grader 5 prosent for å samle inn maksimal mengde data fra en individuell prøve. Bruk små rotasjoner for svært små krystaller eller strålingsfølsomme prøver og varier overføringen basert på tidligere erfaring med en bestemt krystallform. Når alle eksemplene har eksperimentelle parametere brukt riktig, klikker du på Købeholder-knappen nederst på siden.
   5. Når platen har nådd toppen av køen, vil den bli presentert for strålelinjen, datasett vil bli samlet inn, og deretter vil den gå tilbake igjen til prøvelagringen i strålelinjen. Når datainnsamlingen fra en plate er fullført, kan du se etter en e-post med en lenke du kan følge for å få tilgang til de relevante dataene.
5. Opprette eksempelgrupper
   MERK: Prøvegrupper kan opprettes for å gruppere lignende prøver over flere dråper eller plater. Alle datasett innenfor disse eksempelgruppene vil bli behandlet ved hjelp av xia2.multiplex^{14-rørledningen} når den er behandlet av DIALS. Dette kan være nyttig når du samler inn mange svært små kiler med data, og kan også være nyttig for å øke signal-til-støy for ligandbindende eksperimenter.
   1. Velg Eksempel på gruppeadministrasjon fra rullegardinmenyen under forslagsnummeret. Se etter en liste over grupper hvis de allerede er opprettet av andre brukere. Hvis du vil generere en ny gruppe, klikker du + Opprett eksempelgruppe-knappen . Klikk på en forsendelse fra rullegardinmenyen på siden Opprett eksempelgruppe for å se eksempelvisningsprogrammet (figur 5A). Klikk beholderen som inneholder de relevante eksemplene fra listen som fylles ut.
   2. Når du har klikket på en beholder, ser du etter grafikk som viser plateoversikten.
   3. Klikk på dråper enkeltvis ved å klikke på det enkelte slippet (figur 5B) eller klikk på dråper i rader eller kolonner ved å klikke på den aktuelle radbokstaven eller kolonnenummeret. Når alle brønner som er knyttet til en enkeltgruppe, er valgt, skriver du inn et navn på gruppen i boksen Eksempelgruppenavn og klikker knappen Lagre prøvegruppe . Klikk på knappen Vis eksempelgrupper på denne siden for å gå tilbake til listen over allerede genererte eksempelgrupper som er knyttet til forslaget (figur 5C).
6. Redigere eksempelgrupper
   1. Klikk en eksempelgruppe fra listen over grupper på siden Eksempelgruppebehandling .
   2. Klikk på + Rediger eksempelgruppe-knappen ved siden av beholderne som vises under gruppeinformasjonen (figur 5C).
   3. Vær oppmerksom på dråpene, som allerede er knyttet til en prøvegruppe, uthevet på plateoversikten.
   4. Legg til flere slipp i prøvegruppen ved å klikke dråper, brønner eller kolonner som før.
      MERK: Dråper kan ikke fjernes fra en prøvegruppe.
   5. Når flere dråper er lagt til, redigerer du eksempelgruppenavnet og lagrer det, eller bare lagrer det ved å klikke på Lagre prøvegruppe-knappen .
7. Visualisere og analysere resultatet av utvalgsgrupper
   1. Klikk en enkeltgruppe fra listen over eksempelgrupper for å vise plateoversikten over beholderen eller beholderne som er knyttet til gruppen. Dråpene som er inkludert i gruppen, vil bli uthevet på dette displayet (figur 5D).
   2. Se etter en liste som inneholder de kronologiske tre siste multipleksjobbene hvis data er samlet inn i denne gruppen.
   3. Klikk linjen for en multiplekskjøring for å oppdatere behandlingsresultatene nedenfor.
   4. Vær oppmerksom på hurtigkoblingsknappen , som viser antall datasett som er knyttet til gruppen. Klikk denne knappen for å åpne en ny side for datainnsamlinger som viser de individuelle datasettsamlingene.

3. Tilgang til automatisk databehandling

MERK: Når dataene er samlet inn, sendes de gjennom flere automatiske databehandlingsrørledninger. De fire standard rørledningene som brukes over MX-strålelinjene på Diamond kjøres også på data samlet inn ved strålelinjen. De er 'fast_dp', 'xia2 ringer', 'xia2 3dii' og 'autoPROC'15. 'fast_dp' vil gi en rask datareduksjon for raskt å vurdere kvaliteten. De tre andre rørledningene vil kreve mer beregningstid og kjøre en rekke forskjellige datareduksjonsprogramvarepakker for sammenligning. Følgelig er utgangen vanligvis av høyere kvalitet enn 'fast_dp' -utgangen. Datasett samlet på strålelinjen vil også løpe gjennom den automatiske multikrystallsammenslåingsprogramvaren 'xia2.multiplex'14, som vil slå sammen alle datasett innenfor en definert gruppe. Merk at selv om nettskanninger for øyeblikket ikke behandles automatisk, kan dataene behandles manuelt ved hjelp av 'xia2.ssx' rørledningen. Resultatene av de automatiske prosesspipelinene finner du i ISPyB¹¹ ved hjelp av følgende protokoll.

1. Finne datasettene
   1. Logg inn på ISPyB som beskrevet ovenfor, og velg Forslag.
   2. Søk etter forslaget av interesse ved å bla eller skrive inn forslagsnummeret i søkefeltet.
   3. Klikk på ønsket besøk fra listen som vises på skjermen for å få tilgang til Datasamlinger-vinduet for det besøket.
   4. Bruk ønskede filtre.
      MERK: Et populært filter er 'Auto Integrated'-filteret, som bare viser datasett som har kjørt vellykket gjennom én eller flere behandlingspipeliner. Dette vil ekskludere rutenettskanninger, da disse for øyeblikket ikke behandles automatisk gjennom ISPyB.
   5. Rull nedover siden for å finne datasettet av interesse.
      MERK: Hvert datasett vil vise prøve-ID, de eksperimentelle parametrene som brukes, en diffraksjonsbildeviser, en krystallbildeviser og et analyseplott per bilde for rask observasjon av datakvalitet.
2. Slik får du tilgang til resultatene av automatisk behandling
   1. Klikk kategorien Automatisk behandling under datasammendraget for et bestemt eksperiment for å undersøke resultatene av den automatiske datareduksjonen (figur 6A).
   2. Klikk på de forskjellige fanene som tilsvarer de forskjellige rørledningene for å se et detaljert sammendrag av hver utgang.
      MERK: Hvis eksempelgrupper er definert, vil det være to kategorier som tilsvarer multipleksjobber. Den ene vil tilsvare sammenslåingen av alle datasett i gruppen frem til det punktet, mens den andre vil tilsvare sammenslåingen av datasett bare i den dråpen.
   3. Klikk på Logger og filer-knappen for å laste ned de resulterende .mtz-filene hvis behandlingen var vellykket og eventuelle tilknyttede loggfiler. Klikk på Downstream Processing-fanen under delen Automatisk behandling for å se utdataene fra DIMPLE.
      MERK: DIMPLE vil bare kjøre hvis en PDB-fil ble gitt under prøveinnsending.
   4. Klikk på Logger og filer-knappen for å laste ned alle resulterende utdata fra DIMPLE.
3. For å få tilgang til gruppens multipleksresultater, åpne rullegardinmenyen øverst på skjermen med forslagsnummeret skrevet på den og klikk på Eksempel på gruppeadministrasjon. Klikk på raden som tilsvarer ønsket gruppe i riktig beholder. Rull ned for å finne listen over multipleksutganger som tilsvarer gruppen som representert visuelt av et diagram over platen.
   1. Klikk på ønsket multipleksutgang fra listen som er gitt. Klikk på xxx Datasett-knappen , der xxx er antall sammenslåtte datasett (figur 6B).
      MERK: Dette åpner skjermbildet Datainnsamlinger , men bare datasettene fra den valgte multipleksjobben vises.
   2. Klikk på fanen Automatisk behandling i det øverste eksperimentet.
   3. Klikk på kategorien Multiplex Processing som tilsvarer riktig antall sammenslåtte datasett.
   4. Klikk på Logger &; Filer-knappen for å laste ned .mtz og tilsvarende loggfiler (som i trinn 3.2.3.)
4. Slik får du tilgang til resultater av rutenettskanning
   1. Naviger til skjermbildet Datainnsamling for ønsket besøk. Resultatene av rutenettskanningsdataene vises sammen med eventuelle innsamlede rotasjonsdata.
      MERK: Det vil ikke være noen automatiske behandlingsresultater.
   2. Bildet av krystalldråpen vil ha rutenettet overlagt med et varmekart som representerer tilstedeværelsen av diffraksjon. Klikk på en firkant for å vise diffraksjonsbildet for den posisjonen i rutenettet. Klikk på rullegardinmenyen øverst i krystallbrønnbildet for å endre hva varmekartet representerer. Standard er total intensitet av diffraksjon, men kan endres til totale flekker, estimert oppløsning eller rammer uten is.

4. Behandling av data

MERK: Valgte datasett kan behandles på nytt via ISPyB^{11-grensesnittet} ved hjelp av de samme behandlingspipelinene som kjøres automatisk med endrede innstillinger som definert av brukeren. En oppløsningsavskjæring kan brukes; Hvis krystallens symmetri / celle er kjent, kan dette også defineres for å sikre at prosessrørledningene kjører i riktig innstilling. Utvalgte bildeområder på tvers av spesifikke datasett kan også slås sammen ved hjelp av tilgjengelige rørledninger med flere krystaller. Dette kan være fordelaktig dersom systematiske stråleskader fører til at siste del av diffraksjonsbildene er av dårlig kvalitet. Det er også et alternativ for brukeren å laste ned datasettene sine ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor og kjøre ønsket reprosesseringsprogramvare lokalt, opplæringsprogrammer som er fritt tilgjengelige andre steder (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Slik behandler du flere individuelle datasett på nytt
   1. Logg på ISPyB og naviger til datasettene av interesse (trinn 3.1).
   2. Klikk på et datasett og klikk på tannhjulikonet på datasettets tittellinje (figur 6) for å åpne behandlingsvinduet.
   3. Konfigurer eventuelle ønskede innstillinger og velg hvilke rammer som skal inkluderes i reprosesseringen.
      MERK: Bildeområdet kan defineres enten ved å skrive inn et område i de merkede boksene eller ved å klikke og dra ønsket region i analyseplottet per bilde (figur 7A).
   4. VALGFRITT: Hvis du vil legge til et annet datasett for individuell reprosessering, klikker du på tannhjulikonet, og det vises i reprosesseringsvinduet under det første datasettet. Merk av for Behandle individuelt.
   5. Klikk på Integrer-knappen .
2. Slik behandler du data med flere krystaller på nytt
   1. Åpne reprosesseringsvinduet fra et hvilket som helst datasett.
   2. Klikk på Multi-Crystal-knappen for å åpne en ny skjerm.
   3. Rull ned for å finne en serie med analyseplott per bilde fra eksperimenter under besøket.
   4. Velg en behandlingspipeline fra rullegardinmenyen.
   5. VALGFRITT: Definer eventuelle oppløsningsgrenser eller kjente enhetscelleparametere.
   6. Klikk og dra for å definere bildeområder som skal inkluderes i gjengivelsen av flere krystaller (figur 7).
      MERK: Dette bør gjøres over flere forskjellige plott slik at datasett fra flere forskjellige krystaller slås sammen.
   7. Klikk på Integrer-knappen (figur 7B).
3. Slik får du tilgang til databehandlede data som behandles på nytt
   1. Gå til Datainnsamlinger-siden for det spesifikke besøket (trinn 3.1.1–3.1.3).
   2. Klikk på Reprocessing-knappen øverst på skjermen.
   3. Rull ned for å finne ønsket jobb.
   4. Klikk på filbanen i høyre kolonne for å åpne skjermbildet Datainnsamlinger for de behandlede dataene.
   5. Åpne kategorien Automatisk behandling og last ned data som beskrevet tidligere (trinn 3.2).
      Alle jobber som behandles på nytt, kan identifiseres med sirkelpilsymbolet ved siden av pipelinenavnet.

Representative Results

Krystallisasjonsanlegget og VMXi-strålelinjen har blitt brukt til et bredt spekter av prosjekttyper og brukstilfeller. Her er et lite antall eksempler for å illustrere hva brukerne kan ønske å forfølge.

Kasusstudie 1: Standard datainnsamling

Strålelinjen muliggjør rask bestemmelse av romtemperaturkrystallstrukturer fra et lite antall krystaller i en krystallisasjonsplate. Minste antall krystaller er avhengig av romgruppen og krystallorienteringen, men er ofte 1-4, selv om forbedret datakvalitet kan oppnås ved å slå sammen data fra flere titalls krystaller. Et nylig eksempel er en av strålestandardene, thaumatin. Flere krystaller, vist i figur 8A, ble markert for datainnsamling manuelt som beskrevet i protokollpkt. 2.3. Disse krystallene ble lagt til i køen som beskrevet i protokollseksjon 2.4 og eksperimentelle parametere ble valgt fra rullegardinlisten. Når eksperimentelle parametere var brukt, ble platen lagt i kø for datainnsamling. Datasett ble samlet inn, automatisk skalert og slått sammen ved hjelp av xia2.multiplex-rørledningen som beskrevet i protokollseksjon 3. Et eksempel på utdata fra SynchWeb er vist i figur 8A i midten . Fem sammenslåtte datasett ga opphav til et datasett med oppløsning på 1,66 Å. For standard datainnsamling av omtrent fem krystaller i en brønn ble datasett samlet inn innen 2,5 min.

Casestudie 2: Ligandbinding - Fragmenteksperiment ved bruk av Mac1-protein

Fremstilling av strukturer av proteinligandkomplekser ved romtemperatur kan enkelt oppnås ved bruk av strålelinjen. Ligander kan tilsettes dråper på krystallisasjonsplater (enten manuelt eller ved akustisk dråpeinjeksjon) og data målt etter en passende inkubasjonstid. I eksemplet beskrevet her ble en serie fragmenter dispensert i brønner som inneholdt krystaller av SARS-CoV-2 første makrodomene av proteinet nsp3 (Mac-1) i en krystallisasjonsplate. To av brønnene med samme fragment ble tildelt som gruppe som beskrevet i protokolltrinn 2.5. Flere krystaller (42) ble merket for datainnsamling som beskrevet i protokolltrinn 2.3 og 2.4, og datasett ble samlet inn ved hjelp av standardparametere (60° rotasjon, 0,1° trinn, 0,00178 s eksponering, 5% overføring, 16 KeV - per krystall) (figur 8B). Datasett fra de to brønnene ble automatisk behandlet ved hjelp av xia2.dials-rørledningen, og deretter ble xia2.multiplex-rørledningen startet for automatisk å slå sammen 22 av disse datasettene. DIMPLE ble deretter kjørt på utgangen av disse rørledningene og ga kart som tydelig viste bevis på det bundne fragmentet. Fragmentmodellen ble bygget inn i den ubebodde tettheten og ytterligere raffinert (figur 8B til høyre). Ligandbundne strukturer ved romtemperatur kan enkelt bestemmes ved hjelp av denne serien av trinn for å gi uvurderlig informasjon og tilbakemelding til den strukturbaserte legemiddeldesignprosessen. For denne datainnsamlingen av 42 krystaller over en rekke brønner ble datasett samlet inn innen 10 minutter.

Casestudie 3: Strukturløsning med lav symmetri romgruppe og foretrukne orienteringer En stabel med flere krystaller med platelignende morfologi ble produsert fra krystallisasjonseksperimenter med en c-type gassbindende cytokrom (figur 8C). Ved å velge flere posisjoner rundt kanten av stabelen der bare en enkelt krystall var i røntgenstrålen, var det mulig å oppnå et datasett av god kvalitet til 1,75 Å oppløsning ved å slå sammen kiler fra fire krystaller, til tross for en monoklinisk (C2) romgruppe. Dette tillot rask fremdrift av prosjektet uten behov for å optimalisere krystallisasjonsforholdene ytterligere. Dette resultatet er beskrevet tidligere⁹. For denne datainnsamlingen av fire krystaller i en brønn ble datasett samlet inn innen 2 minutter.

Casestudie 4: Innhenting av informasjon og romtemperaturstruktur fra mikrokrystaller i en plate ved hjelp av seriell krystallografi

Ofte når mikrokrystaller vises i en dråpe eller når brukere søker å optimalisere mikrokrystallisasjonsprotokoller i batch som en forløper for serielle krystallografieksperimenter ved synkrotron- eller XFEL-kilder, er det svært nyttig å få rask tilbakemelding på diffraksjonsegenskapene og enhetscelledimensjonene til forskjellige forsøk ved bruk av minimalt materiale. I dette tilfellet ble mikrokrystaller av lysozym som vokste i batch pipettert inn i en krystallisasjonsplate (200 nL volum per dråpe) og data samlet inn fra åtte dråper ved hjelp av en rutenettskanning med en trinnstørrelse på 10 μm (figur 9). De resulterende 25 906 stillbildene ble behandlet ved hjelp av seriell krystallografiprogramvare som resulterte i et datasett, hvor 9 891 diffraksjonsmønstre ble indeksert og slått sammen og produserte et datasett til 2,0 Å-oppløsning som raffinerte godt mot den publiserte romtemperaturstrukturen (_R-arbeid = 19,6%, R_fri = 23,6% ved bruk av PDB 8A9D) (tabell 1). Dette tillot detaljert analyse av enhetscellefordeling og bestemmelse av en mikrokrystallromtemperaturstruktur som kunne mates inn i komplekse serielle krystallografieksperimenter, inkludert tidsoppløste studier. Det totale volumet av mikrokrystallsuspensjon som var nødvendig var 1,6 μL. For denne datainnsamlingen av mikrokrystaller over åtte brønner ved hjelp av gridskanning, ble datasett samlet inn innen 40 minutter.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av protein-til-struktur-rørledningen som integrerer krystallisasjonsscreening, optimalisering ved krystallisasjonsanlegget, automatisert datainnsamling og prosessering ved romtemperatur uten prøvehøsting ved VMXi, XChem-fragmentscreening og datainnsamling ved andre MX-strålelinjer. Brukere kan starte rørledningen ved å levere en prøve eller ved å bringe plater til VMXi-strålelinjen. Forkortelse: Allsidig makromolekylær krystallografi in situ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Mosquito SPT Labtech-grensesnittet for å sette opp krystallisasjonsplater. (A) (1) Oppsettvisningen MiTeGen In Situ-1. Velg MiTeGen 2-dråpestandardplaten ved å gå til (2) platetypen med 96 brønner og velge (3) dråpeplaten MiTeGen plate 2. For å endre definisjonsparametrene for slipp 1 og slipp 2, som kreves for VMXi, klikk på (4) redigeringsikonet . Dette åpner et nytt vindu (B) der (5) X- og Y-forskyvningene må endres som vist. Velg (B) brønn 2 og (C) brønn 3 og endre verdiene deretter. (D) CrystalQuickX-oppsettvisningen . Velg CrystalQuickX 2 drop standard plate ved å gå til 96-brønn platetype og velge MiTeGen plate 2 drop plate. For å endre definisjonsparametrene for slipp 1 og slipp 2, som kreves for VMXi, klikker du på redigeringsikonet på samme måte som ovenfor. Dette åpner et nytt vindu der (E,F) X- og Y-forskyvningene må endres som vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: SynchWeb-grensesnittet viser hvordan du oppretter en VMXi-forsendelse, registrerer en plate og kontrollerer kontaktinformasjon. Skjermbilder av de ulike stadiene for opplasting av informasjon til SynchWeb-grensesnittet vises fra (A) rullegardinmenyen, (B,C) registrering av en ny forsendelse, (D) registrering av en ny container, (E) inntasting av plateinformasjon, (F) sjekk kontaktinformasjon og (G) en liste over registrerte containere i et forslag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Utvelgelse og klargjøring av prøver for datainnsamling ved hjelp av SynchWeb. En serie skjermbilder som viser de ulike stadiene av klargjøring av prøver for datainnsamling ved hjelp av SynchWeb-grensesnittet, vises. (A) Punkter og regioner av interesse velges fra slippoversikten. I den nedre delen av dette panelet er det en kronologisk serie fotografier av en dråpe. (B) Et eksempel på CHiMP-utgangen for en plate som fremhever resultater for kategorien 'krystall'. (C) Legge til eksempler i køen fra listen over valgte punkter og regioner og (D) bruke parametere for datainnsamling på prøvene i kø fra rullegardinlisten med strålelinjeopprettede eksperimentinnstillinger. Legg merke til forskjellen mellom prøver uten eksperimentelle parametere (i rødt) kontra de som har riktig brukte parametere (topp og bunn). Nederst på dette panelet er købeholderknappen , som køer platen som skal samles på strålelinjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Eksempel på gruppeopprettelse i SynchWeb. En serie skjermbilder som viser de ulike stadiene for å opprette eksempelgrupper. (A) Platen(e) som inneholder prøver velges fra den aktuelle forsendelsen og (B) dråpene i platen velges. Disse kan være individuelle dråper eller kan velges etter rad og/eller kolonne. (C) En liste over eksempelgrupper som allerede er opprettet. (D) Utdataene fra de tre siste multipleksbehandlingsjobbene er oppført og kan velges for å vise statistikk fra behandlingspipelinen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Databehandling og datareduksjon. (A) Skjermbilde av et behandlet datasett i ISPyB¹¹. Knappen for å få tilgang til reprosesseringsfunksjoner er uthevet. Prøve-ID og eksperimentelle parametere vises øverst til venstre og diffraksjonsbildeviseren i midten. Ved å klikke på dette bildet åpnes et interaktivt vindu for å undersøke forskjellige bilder. Krystallbildeviseren vises til høyre, og ved å klikke på dette bildet åpnes også et interaktivt vindu for å sammenligne strålelinje- og Formulatrix-lagringsbilder. Analyseplottet per bilde vises helt til høyre, og ved å klikke på dette bildet åpnes en forstørret versjon av denne utdataene. Ved å klikke på fanen Automatisk behandling vil autoprosesseringen bli synlig og gjøre sammenligningen mellom resultatene fra de forskjellige rørledningene enkel. Klikk på fanene for å bytte mellom de forskjellige behandlingsrørledningene og se detaljert utgang fra den valgte rørledningen. Logg og filer-knappen for datanedlasting er uthevet. Hvis du klikker kategorien Nedstrømsbehandling , utvides og gir resultater for alle datasett som kjøres gjennom pipeliner for reduksjon etter data, der det er aktuelt. (B) Skjermbilde fra skjermbildet Eksempel på gruppebehandling . Det brukerdefinerte gruppenavnet er øverst, og den visuelle beskrivelsen av de inkluderte brønnene kan ses nedenfor. En grønn brønn indikerer at alle krystaller målt fra den dråpen vil bli inkludert i gruppen. Et sammendrag av forskjellige multipleksjobber utført på den gruppen kan sees, og under er de detaljerte utdataene fra multipleks. Datasett-knappen for å undersøke de inkluderte eksperimentene er uthevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Vinduer for databehandling. (A) Individuelle og (B) multikrystalldatasett. To individuelle datasett vises der dataområder er valgt. Når det er merket av for Behandle individuelt, behandles de valgte diffraksjonsbildene individuelt ved å trykke på Integrer-knappen . Ved å klikke på Multikrystall-knappen åpnes en visning av de enkelte datasettene. Hvis du vil behandle diffraksjonsbilder fra flere datasett, velges områder av bilder som vist, og ny behandling startes ved å klikke på Integrer-knappen som uthevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Representative resultater fra VMXi-rørledningen. (A) Markerte krystaller for protein thaumatin i en krystallisasjonsdråpe (venstre panel), databehandlingsresultater (midtpanel) og elektrontetthet (høyre panel). (B) Samling på flere krystaller for å bestemme binding av fragmentet til SARS-CoV-2 makrodomene. Datasett ble samlet på flere krystaller i nærvær av et fragment fra EU-OPENSCREEN-fragmentskjermen ved hjelp av standard eksperimentelle innstillinger. Eksempler på disse datainnsamlingene er vist i dette utdraget fra SynchWeb. Fragmentet ble bygget inn i tilsvarende tetthet og ytterligere raffinert som vist lengst til høyre. (C) Markerte monokliniske krystaller i en stabel fra et utfordrende krystallisasjonstreff som brukes til datainnsamling. Grønne kryss og røde tall indikerer hvor data ble målt med en 10 μm stråle og 60° rotasjon. Fire av de resulterende kilene ble slått sammen til et datasett med 1,75 Å oppløsning. Elektrontettheten rundt Heme-gruppen vises til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Seriell krystallografi i krystallisasjonsplaten. (A) Optisk bilde av krystallisasjonsdråpen, med en hvit boks som representerer interesseområdet. (B) Definisjon av rutenettsskanningspunkter. (C) Varmekart som indikerer diffraksjon. (D) Elektrontetthetskart som oppstår fra et seriell krystallografidatasett fra mer enn 9000 fortsatt diffraksjonsmønstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Oppløsning (Å)	Fullstendighet (%)	Mangfold	I/σ(I)	Rsplittet	CC1/2	Unike observasjoner
Generelle	100	95.5	20.8	0.063	0.998	8422
Lav (55,55 - 5,43)	100	147.1	81.7	0.028	0.999	488
Høy (2,03 -2,00)	100	75.3	1.2	1.092	0.410	411

Tabell 1: Datastatistikk for det serielle datasettet VMXi RT. Forkortelser: I = gjennomsnittlig intensitet av de skalerte observasjonene; R_split = et mål på avvik mellom de målte intensitetene; CC 1/2 = korrelasjonskoeffisient mellom to tilfeldige halvdeler av datasettet.

Discussion

Vi har beskrevet hele prosedyren fra ankomsten av en proteinprøve i CF til nedlasting av de endelige dataene av brukeren for videre applikasjoner. Kritiske trinn er produksjon av en høyverdig proteinprøve og passende krystallskjermer, enten ved hjelp av kommersielle sparsomme matriseskjermer eller optimaliseringsskjermer basert på etablerte forhold. Denne prosessen kan finne sted i CF, eller brukere kan utføre krystallisasjonsprosedyrene i hjemmelaboratoriene og bringe egnede krystallisasjonsplater til strålelinjen. Identifisering av egnede datainnsamlingsparametere kan være viktig for visse prøver, spesielt der strålingsskade er et problem. I de fleste tilfeller er automatisert databehandling fullt tilstrekkelig til å svare på det vitenskapelige spørsmålet, selv om brukerne beholder muligheten til å reprosessere ved hjelp av strålelinjeverktøyene, for eksempel der romgruppen er tvetydig eller bare den første delen av de innsamlede dataene brukes til å minimere strålingsskadeeffekter.

Hvis egnede krystaller ikke produseres fra innledende krystallisasjonsforsøk, kan endringer i proteinkonsentrasjon, renhet eller krystallisasjonsskjermer utforskes, og det samme kan bruken av krystallsåing. Hvis krystaller ikke diffrakterer til en nyttig oppløsning ved strålelinjen, kan rutenettskanninger brukes med en uoppmerksom stråle for å vurdere den iboende diffraksjonsgrensen og enhetscellen til krystallene for å veilede optimaliseringsarbeidet. Krystaller som er for små for datainnsamling i plater (f.eks. <10 μm) kan i stedet være egnet for seriell krystallografi eller nanofokuseksperimenter (f.eks. ved Diamond beamline VMXm). Å løse strukturer ved hjelp av VMXi-data er generelt enkelt ved molekylær utskifting, spesielt siden ankomsten av Alphafold¹⁶ for å gi effektive søkemodeller. Hvis dette ikke lykkes, kan krystaller høstes og kryokjøles fra plater for å muliggjøre konvensjonell uregelmessig diffraksjon med én bølgelengde, anomaløs diffraksjon med flere bølgelengder eller eksperimenter med langbølgelengdeinnfasing.

Fordelene ved denne metoden inkluderer muligheten til å oppnå raske datasett av høy kvalitet og tilbakemelding direkte fra krystallisasjonsplater uten å måtte forstyrre krystaller fra miljøene de har vokst i. Den såkalte "romtemperaturrenessansen" i strukturbiologi legger vekt på strukturer oppnådd under ikke-kryogene forhold for å muliggjøre mer fysiologisk relevans og proteindynamikk som skal utforskes². Vanligvis oppnås en litt lavere oppløsning enn for en optimalisert kryokjølt krystall, men bare når egnede kryoforhold er etablert og hvis krystallene er robuste mot mekanisk håndtering og åpning av krystallisasjonsdråpen³. En kommende applikasjon som denne rørledningen er svært godt egnet for, er en storskala screening av proteinligandkomplekser eller fragmentkampanjer ved romtemperatur i legemiddeloppdagelse. Ligander eller fragmenter kan enten kokrystalliseres eller tilsettes ved pipette eller akustisk dråpeutstøting før innsamling av romtemperatur. En annen applikasjon er å raskt måle data fra mange hundre eller tusenvis av krystaller på en svært effektiv måte, og deretter bruke DIALS¹⁷ multiplex^{14-programvaren} til å trekke ut isomorfe klynger som kan representere forskjellige biologiske enheter eller å etablere statistisk signifikante forskjeller mellom populasjoner av krystaller som har blitt behandlet på en annen måte eller utsatt for forskjellige ligander eller signaler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion