Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لنظام زراعة الخلايا الآلي. يقلل نظام الاستزراع الآلي هذا من العمالة ويفيد المستخدمين ، بما في ذلك الباحثين غير المعتادين على التعامل مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، من صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
Abstract
من المتوقع أن يكون للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ذات القدرة اللانهائية على التكاثر الذاتي تطبيقات في العديد من المجالات ، بما في ذلك توضيح أمراض الأمراض النادرة ، وتطوير أدوية جديدة ، والطب التجديدي الذي يهدف إلى استعادة الأعضاء التالفة. على الرغم من ذلك ، لا يزال التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs محدودا. ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة إعادة إنتاج التمايز في الثقافة ، حتى مع المعرفة المتقدمة والمهارات التقنية المتطورة ، بسبب الحساسية العالية ل iPSCs للتغيرات البيئية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تطبيق نظام الثقافة الآلي إلى حل هذه المشكلة. يمكن توقع تجارب ذات قابلية استنساخ عالية مستقلة عن مهارة الباحث وفقا لإجراء مشترك عبر مختلف المعاهد. على الرغم من أن العديد من أنظمة الاستزراع الآلي التي يمكنها الحفاظ على ثقافات iPSC وتحفيز التمايز قد تم تطويرها سابقا ، إلا أن هذه الأنظمة ثقيلة وكبيرة ومكلفة لأنها تستخدم أذرعا روبوتية إنسانية متعددة المفاصل. لتحسين المشكلات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير نظام جديد باستخدام نظام سكة منزلق بسيط للمحور x-y-z ، مما يسمح له بأن يكون أكثر إحكاما وأخف وزنا وأرخص. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدم بسهولة تعديل المعلمات في النظام الجديد لتطوير مهام معالجة جديدة. بمجرد إنشاء المهمة ، كل ما يحتاجه المستخدم هو إعداد iPSC ، وتوفير الكواشف والمواد الاستهلاكية اللازمة للمهمة المطلوبة مسبقا ، وتحديد رقم المهمة ، وتحديد الوقت. أكدنا أن النظام يمكنه الحفاظ على iPSCs في حالة غير متمايزة من خلال عدة ممرات بدون خلايا مغذية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب وخلايا الكبد والأسلاف العصبية والخلايا الكيراتينية. سيمكن النظام من إجراء تجارب قابلة للتكرار بدرجة كبيرة عبر المؤسسات دون الحاجة إلى باحثين مهرة وسيسهل التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs في مجموعة واسعة من مجالات البحث من خلال تقليل العقبات التي تحول دون الدخول الجديد.
Introduction
تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات معالجة فعلية ومفصلة لنظام زراعة آلي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي أنتجناها بالتعاون مع شركة ، وإظهار نتائج تمثيلية.
منذ نشر المقال في عام 2007 ، جذبت iPSC الانتباه في جميع أنحاء العالم1. نظرا لأعظم ميزة لها تتمثل في القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، فمن المتوقع أن يتم تطبيقها في مجالات مختلفة مثل الطب التجديدي ، وتوضيح أسباب الأمراض المستعصية ، وتطوير أدوية علاجية جديدة 2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الخلايا الجسدية البشرية المشتقة من iPSC يمكن أن يقلل من التجارب على ، والتي تخضع لقيود أخلاقية كبيرة. على الرغم من أن العديد من iPSCs المتجانسة مطلوبة باستمرار للبحث عن طرق جديدة مع iPSCs ، إلا أن إدارتها شاقة للغاية. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع iPSC أمر صعب بسبب حساسيته العالية ، حتى للتغيرات الثقافية والبيئية الدقيقة.
لحل هذه المشكلة ، من المتوقع أن تؤدي أنظمة الثقافة الآلية المهام بدلا من البشر. طورت بعض المجموعات عددا قليلا من أنظمة زراعة الخلايا الجذعية البشرية الآلية متعددة القدرات لصيانة الخلايا والتمايز ونشرت إنجازاتها4،5،6. تجهز هذه الأنظمة ذراعا (أذرع) روبوتية متعددة المفاصل. لا تتمتع الأذرع الروبوتية بميزة من حيث أنها تحاكي حركات الذراع البشرية فحسب ، بل إنها أيضا تعيب من حيث أنها تتطلب تكلفة (تكاليف) أعلى للذراع (الذراعات) ، وتغليف نظام أكبر وأثقل ، وجهود تعليمية تستغرق وقتا طويلا من قبل المهندسين للحصول على الحركات المستهدفة 7,8. من أجل تسهيل إدخال الجهاز إلى المزيد من المرافق البحثية في نقاط الاستهلاك الاقتصادي والمساحي والموارد البشرية ، قمنا بتطوير نظام ثقافة آلي جديد لصيانة وتمييز iPSC إلى أنواع مختلفة من الخلايا9.
كان الأساس المنطقي للنظام الجديد هو اعتماد نظام سكة حديد المحور X-Y-Z بدلا من الأذرع الروبوتية متعددة المفاصل9. لاستبدال الوظائف المعقدة الشبيهة باليد للأذرع الروبوتية ، قمنا بتطبيق فكرة جديدة على هذا النظام ، والتي يمكنها تلقائيا تغيير ثلاثة أنواع من أطراف الذراع الوظيفية المحددة. هنا ، نشير أيضا إلى كيف يمكن للمستخدمين بسهولة عمل جداول المهام بأوامر بسيطة على البرامج بسبب عدم وجود متطلبات لمساهمات المهندسين طوال العملية.
أظهر أحد أنظمة الاستزراع الروبوتي صنع أجسام جنينية باستخدام 96 لوحة بئر كمجاميع خلايا ثلاثية الأبعاد للتمايز4. لا يمكن للنظام المذكور هنا التعامل مع 96 لوحة بئر. حقق أحدهما درجة ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) باستخدام خط الخلية ، على الرغم من أنها لم تكن خلية جذعية بشرية متعددة القدرات5. تم الآن تطوير نظام الاستزراع الآلي المفصل هنا بهدف محدد هو مساعدة التجارب المعملية (الشكل 1). ومع ذلك ، فإنه يحتوي على أنظمة كافية للحفاظ على مستويات نظيفة تعادل خزانة أمان من المستوى الرابع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة الأخلاقيات بجامعة كانساي الطبية على توليد واستخدام iPSCs الصحية المشتقة من المتطوعين المسماة KMUR001 (الموافقة رقم 2020197). قدم المتبرع ، الذي تم تجنيده علنا ، موافقة رسمية مستنيرة ووافق على الاستخدام العلمي للخلايا.
ملاحظة: الواجهة الحالية (البرنامج الخاص المسمى "ccssHMI" الذي يعمل تحت نظام التشغيل Windows XP) هي شاشة التشغيل الأساسية. تحت الواجهة المذكورة أعلاه ، يتم ترتيب سلسلة من علامات التبويب ، مما يسمح للمستخدمين ببدء عمليات مختلفة.
1. عمليات التحميل
- انقر على تحميل زر على الشاشة العلوية للبرنامج. انقر فوق الزر بدء إعداد التحميل .
- ضع الطبق (الأطباق) أو اللوحة (الأطباق) المراد إدخالها في الجهاز في موضعها في الجهاز.
ملاحظة: يجب كتابة المعلومات اللازمة لتحديد الطبق على كل غطاء. - أغلق النافذة المنزلقة الأمامية يدويا واضغط على زر تأكيد السلامة الميكانيكية.
- حدد نوع وكمية الطبق (الأطباق) أو اللوحة (الأطباق) في البرنامج.
- انقر فوق الزر اكتمل إعداد التحميل . انقر فوق الزر بدء التحميل .
- بعد تحميل طبق في النظام، حدد المعلومات الموجودة على الطبق، مثل خلايا iPS أو بدون خلايا iPS، على البرنامج. تسجيل ملاحظات حول كل طبق في البرنامج.
- انقر فوق الزر "تسجيل " في النهاية لإكمال عملية التحميل.
2. عملية التفريغ
- انقر على تفريغ زر على الشاشة العلوية للبرنامج. حدد الطبق (الأطباق) المراد إزالته في البرنامج.
- بعد تحديد الطبق (الأطباق) ، انقر فوق الزر "بدء التحضير" للتفريغ . انقر فوق الزر "بدء تفريغ ".
- بعد نقل الطبق (الأطباق) من الحاضنة إلى طاولة العمل في النظام ، اضغط على زر إزالة الطبق .
- افتح النافذة المنزلقة الأمامية يدويا وأخرج الطبق (الأطباق). أغلق النافذة المنزلقة الأمامية يدويا واضغط على زر تأكيد السلامة الميكانيكية.
3. ملحق المواد الاستهلاكية: الماصات والأنابيب والمتوسطة
- لتجديد المواد الاستهلاكية مثل الماصات والأنابيب والوسيط، انقر على زر المواد الاستهلاكية على الشاشة العلوية للبرنامج، ثم حدد العنصر المراد تجديده.
- الماصات
- انقر فوق زر الماصة . حدد الزر تجديد .
- حدد رفا يريد المستخدم تجديده على البرنامج. انقر فوق الزر تجديد البدء .
- بعد التأكد من فتح غطاء منطقة تخزين الماصة على طاولة العمل ، افتح النافذة المنزلقة الأمامية يدويا وقم بتجديد الماصات حسب الحاجة.
- أغلق النافذة المنزلقة الأمامية يدويا واضغط على زر تأكيد السلامة الميكانيكية. انقر فوق الزر تجديد مكتمل .
- انقر فوق الزر إعداد التجديد وأدخل معلومات التجديد ، ثم انقر فوق الزر تسجيل .
- انقر فوق الزر تجديد مكتمل .
- انابيب
- انقر فوق الزر Tube . حدد الزر تجديد .
- حدد رفا يريد المستخدم تجديده على البرنامج. انقر فوق الزر تجديد البدء .
- بعد التأكد من انتقال الحامل إلى الأعلى ، انقر فوق الزر Replenish Tube .
- افتح النافذة المنزلقة الأمامية يدويا وقم بتجديد الأنابيب حسب الحاجة.
- أغلق النافذة المنزلقة الأمامية يدويا واضغط على زر تأكيد السلامة الميكانيكية.
- انقر فوق الزر تجديد مكتمل .
- انقر فوق الزر إعداد التجديد وأدخل معلومات التجديد ، ثم انقر فوق الزر تسجيل . انقر فوق الزر إغلاق .
- متوسط
- انقر فوق الزر متوسط . حدد ملف تجديد زر في البرنامج.
- حدد رفا واحدا من ثلاثة يريد المستخدمون تجديده. انقر فوق الزر تجديد البدء .
- بعد التأكد من فتح غطاء منطقة التخزين المتوسطة ، افتح النافذة المنزلقة الأمامية يدويا وقم بتجديد الوسيط.
- أغلق النافذة المنزلقة الأمامية يدويا واضغط على زر تأكيد السلامة الميكانيكية.
- انقر فوق الزر تجديد مكتمل .
- انقر فوق الزر "تجديد " وأدخل المعلومات الخاصة بالوسيط، بما في ذلك اسم الوسيط ومقداره. أدخل تعليقات إضافية إذا لزم الأمر.
- انقر فوق الزر تسجيل .
- انقر فوق الزر إغلاق .
- الماصات
4. اختيار المهمة
- انقر على مهمة زر على الشاشة العلوية للبرنامج.
- حدد زر إعداد المهمة . حدد المهمة المطلوبة من قائمة المهام وانقر فوق الزر الخطوة التالية .
- حدد التاريخ والوقت لتنفيذ المهمة، ثم انقر فوق الزر تسجيل . حدد طبقا أو طبقا لتنفيذ المهمة، ثم انقر فوق الزر تسجيل .
- بعد إعادة تأكيد المهمة المحددة ، انقر فوق الزر تسجيل . تأكد من تسجيل المهمة على الشاشة التالية.
- إذا لزم الأمر ، قم بتعيين المهمة التالية بنفس الطريقة.
- انقر فوق الزر "ابدأ" في النهاية. بعد ذلك ، ستبدأ المهمة تلقائيا في التاريخ والوقت المحددين.
ملاحظة: مباشرة بعد الانتهاء من كل مهمة ، يتم تشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية (الموجودة على جانبي غطاء المحرك) تلقائيا ، وبعد 5-30 دقيقة ، وفقا للإعداد الإضافي ، يتم إيقاف تشغيلها للحفاظ على غطاء المحرك في حالة معقمة. للتوقف، يمكن للمستخدمين النقر فوق الزر ابدأ . - إذا أراد المستخدمون إلغاء مهمة مجدولة مسبقا، فانقر فوق الزر إيقاف .
- بعد تحديد المهمة المراد إحباطها، انقر فوق الزر تحرير المهمة .
- انقر فوق الزر إلغاء المهمة . تأكد من حذف المهمة على الشاشة التالية.
5. تحقق من صور الخلية
- تتضمن كل مهمة ملاحظات مجهرية (التقاط صور) قبل وبعد عمل المهمة. راقب تقدم زراعة الخلايا فوتوغرافيا من خلال دمج مهمة التصوير المجهري قبل أو بعد كل مهمة.
- حدد برامج المهام المحددة مسبقا ، بما في ذلك تحديد مواقع محددة متعددة للطبق أو لوحة البئر مسبقا لمراقبة نقطة ثابتة لمراقبة نفس الموقع بمرور الوقت.
6. المرور والتمايز
- اتبع الخطوات الواردة في الأقسام 1-5 واضبط نظام زراعة الخلايا الآلي لأداء التمرير والتمايز. يتم عرض إعدادات الأداة للتمرير ، وتمايز الخلايا العضلية القلبية ، وتمايز خلايا الكبد ، وتمايز الخلايا العصبية السلائف ، وتمايز الخلايا الكيراتينية في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3 والجدول 4 والجدول 5 على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
صيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
استخدمنا ثلاثة خطوط hPSC (RIKEN-2F و 253G1 و KMUR001). لقد قمنا بتحسين بروتوكول الصيانة من خلال التجارب اليومية التي يتم إجراؤها يدويا وقمنا بتحسين البرامج التفصيلية من خلال التجارب الأولية السبع التي يقوم بها النظام. على سبيل المثال ، تختلف إجهادات القص الناتجة عن سرعات السائل لتدفق البصاق من الماصات المختلفة التي يتعامل معها البشر والنظام تماما. لذلك ، قمنا بتحسين المدة الزمنية لعملية الهضم الأنزيمي وعدد الماصات لتشتت الخلايا بواسطة النظام.
تم الحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا على طبق 10 سم مغطى بمصفوفة زراعة الخلايا 0.5 ميكروغرام / سم2 مع وسط ثقافة hiPSC (على سبيل المثال ، Neutristem أو StemFit AK02N). للمرور ، تمت برمجة النظام لغسل hiPSC ثلاث مرات مع 5 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات بدون الكالسيوم (PBS [-]) ، ثم معالجته ب 3 مل من إنزيم TrypLE Express المكمل ب 10 ميكرومتر من مثبط كيناز Rho (Y-27632) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضاف النظام 9 مل من PBS (-) مع 0.15٪ من جزء ألبومين مصل الأبقار V (BSA) إلى اللوحة وأجرى مجموعتين من الحركة التي استنشقت 10 مل من السائل المحتوي على الخلية ووزعت السائل من طرف الماصة في حركة متعرجة عبر الجزء العلوي من اللوحة ، والتي كانت مائلة 20 درجة أقرب إلى سطح اللوحة ، وكرر تسلسل العمليات أعلاه مع إمالة اللوحة عند 20 درجة على الجانب الآخر. بعد ذلك ، جمع النظام الوسط المحتوي على الخلية في أنبوب سعة 15 مل وغطاه ، وبعد ذلك تم طرده مركزيا عند 115 × جم لمدة 5 دقائق لإيداع الخلايا. بعد ذلك ، استنشق النظام المادة الطافية وقام بتفريق حبيبات الخلية إلى خلايا مفردة باستخدام 10 مل من وسط المزرعة مع 10 ميكرومتر Y-27632 عن طريق سحب 10 مرات. نقل النظام 1 مل من محلول التريبان الأزرق إلى أنبوب جديد سعة 15 مل ، ثم أضاف 1 مل من تعليق الخلية وخلطها عن طريق السحب خمس مرات. بعد ذلك ، تم استنشاق 100 ميكرولتر من محلول الخلية الملطخة باللون الأزرق Trypan وصرفها في نافذة مدخل مقياس الدم القابل للتصرف في الحامل. نقل النظام حامل مقياس الدم إلى منطقة المراقبة المجهرية ، والتقط صورة ، تم تحليلها على الفور بواسطة البرنامج ، وتم تطبيق تركيز الخلية الذي تم الحصول عليه على الخطوة التالية. لصيانة iPSC ، قام النظام بزرع الخلايا بكثافة خلية تبلغ 15000 خلية / سم2 في ألواح بلاستيكية جديدة قطرها 10 سم مطلية بمصفوفة زراعة خلية 0.5 ميكروغرام / سم2 . بالنسبة لتجارب التمايز ، قام النظام بزرع الخلايا عند كثافة الخلية المطلوبة في الوسط المعد لكل نوع من أنواع الخلايا الجسدية في ألواح ذات 6 آبار مطلية بمصفوفة زراعة الخلايا المخففة إلى 1/100. أخيرا ، أجرى النظام القفل المتقاطع خمس مرات قبل نقل اللوحات إلى الحاضنة. تم تحميل ثلاث لوحات جديدة مقاس 10 سم تحتوي على iPSCs وثلاث لوحات مصفوفة زرع الخلايا المطلية مسبقا في النظام ، كما تم إعداد العناصر الضرورية الأخرى وفقا للإجراءات ذات الصلة المذكورة أعلاه. تتكون دورة واحدة من ثقافة الصيانة من مهمة عابرة في اليوم 1 تليها تغيير وسيط الثقافة مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. طوال التجربة ، تم إعداد هذه الدورة لخمس دورات. بالإضافة إلى ذلك ، تم تجديد المواد الاستهلاكية بدورها.
وفقا للجدول الزمني المطلوب ، تم تنفيذ خمس دورات من ثقافة الصيانة بنجاح كما هو مخطط من قبل النظام. من صور الخلية التي تم التقاطها تلقائيا أثناء كل مهمة ، تم التأكد من أن الخلايا تكاثرت بسلاسة بمرور الوقت. تم حساب تمدد الخلية (n = 3) وموضح في الشكل 2. لتأكيد ما إذا كانت الحالة غير المتمايزة ل iPSCs تظل دون تغيير حتى بعد ثقافة الصيانة في نظام الاستزراع الآلي ، تم إجراء تحليل خلوي مناعي (Oct3/4 و SSEA4) باستخدام العينات المتبقية في كل مرور (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، بعد خمس دورات ، تم تفريغ الأطباق الثلاثة من النظام ، وتم إجراء التحليل الكيميائي المناعي (Oct3/4 و SSEA4 و Tra1-81) أيضا (الشكل 3 ب). أظهر كلا التحليلين باستخدام التلوين المناعي الفلوري أنه تم الحفاظ على الحالة غير المتمايزة لخلايا iPS. كما تم إجراء التنميط النووي ل iPSCs قبل وبعد ثقافة الصيانة في نظام استزراع آلي. على الرغم من ملاحظة وجود خلل في أليل الكروموسوم 17 قبل بدء ثقافة الصيانة ، لم يلاحظ النظام أي تغيير معين بعد 5 ثقافات صيانة ، بما في ذلك الشذوذ (الشكل 3C). يتم تلخيص الإعدادات المستخدمة لصيانة iPSCs في الجدول 1.
التمايز
خلايا عضلة القلب
تم اتباع بروتوكول التمايز من منشور سابق هنا10. قام النظام بزرع hiPSCs غير المتمايزة (KMUR001) بكثافة 30000 خلية / سم2 على ألواح 6 آبار مغلفة بمصفوفة زراعة الخلايا في وسط استزراع hiPSC مع استكمال 10 ميكرومتر من Y-27632. قام النظام بتغيير الوسط إلى وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات مع 6 ميكرومتر من مثبط GSK-3ß CHIR-99021 ، و 20 نانوغرام / مل Activin A ، و 10 نانوغرام / مل BMP4 بعد 3 أيام (يوم التمايز 1). في يوم التمايز 3 ، تغير النظام إلى وسط CDM3: RPMI 1640 ، 500 ميكروغرام / مل من الألبومين البشري المؤتلف ، و 213 ميكروغرام / مل L-حمض الأسكوربيك 2-فوسفات مع 2 ميكرومتر Wnt-C59. في يوم التمايز 5 ، تغير النظام إلى وسيط CDM3 جديد ؛ بعد ذلك ، تكرر التغيير إلى وسط CDM3 جديد كل يوم. يتم تلخيص الإعدادات المستخدمة لتمايز الخلايا العضلية القلبية ل iPSCs في الجدول 2.
خلايا الكبد
تم اتباع بروتوكول التمايز من منشور سابق هنا11. قام النظام بزرع hiPSCs غير المتمايزة (RIKEN2F) بكثافة 25000 خلية / سم2 على ألواح 6 آبار مغلفة بمصفوفة زراعة الخلايا في وسط استزراع hiPSC مع استكمال 10 ميكرومتر من Y-27632. بعد يومين (يوم التمايز 1) ، قام النظام بتغيير الوسيط إلى RPMI-1640 بالإضافة إلى 2٪ B27 ناقص الأنسولين (RPMI-B27) الذي يحتوي على 100 نانوغرام / مل Activin A ، 6 ميكرومتر CHIR-99021 ، و 1٪ مكمل الجلوتامين (على سبيل المثال ، GlutaMAX) لمدة 24 ساعة. في يوم التمايز 2 ، قمنا بتغيير الوسيط إلى RPMI-B27 مع 50 نانوغرام / مل Activin A. في يوم التمايز 5 ، قام النظام بتغيير الوسط إلى RPMI-B27 ، الذي يحتوي على 1٪ مكمل الجلوتامين و 10 نانوغرام / مل BMP-4. في يوم التمايز 9 ، قام النظام بتغيير الوسط إلى وسط نضج خلايا الكبد: وسط ليبوفيتز L-15 الذي يحتوي على 8.3٪ مرق فوسفات التربتوز ، 10 ميكرومتر هيدروكورتيزون 21-هيميسوتشينات ، 50 ميكروغرام / مل صوديوم L-أسكوربات ، 100 نانومتر ديكساميثازون ، 0.58٪ أنسولين - ترانسفيرين - سيلينيوم ، 2 مللي مول مكمل جلوتامين ، 8.3٪ مصل بقري جنيني ، و 100 نانومتر راك-1،2-ديهيكسيل جليسرول. بعد ذلك ، كرر النظام تغيير الوسيط إلى وسيط جديد كل يوم. يتم تلخيص الإعدادات المستخدمة لتمايز خلايا الكبد من iPSCs في الجدول 3.
خلايا السلائف العصبية
تم اتباع بروتوكول التمايز من منشور سابق هنا12. قام النظام بزرع hiPSCs غير المتمايزة (RIKEN2F) بكثافة 25000 خلية / سم2 على صفائح 6 آبار مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي في وسط النسر المعدل (DMEM) / F12 من Dulbecco والوسط العصبي القاعدي (1: 1) المكمل باستبدال مصل بالضربة القاضية بنسبة 10٪ ، و 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، ومكمل الجلوتامين 1 mM مع مثبط مستقبلات 10 μM TGF-beta (SB431542) ، مثبط إشارة BMP 10 ميكرومتر (dorsomorphin) ، و 10 ميكرومتر Y-27632 (يوم التمايز 1). في يوم التمايز 5 ، قام النظام بتغيير الوسط إلى DMEM / F12 والوسط العصبي القاعدي 1: 1 المكمل بأحماض أمينية غير أساسية 0.1mM ، 1 mM مكمل الجلوتامين ، 1٪ مكمل N-2 ، 1٪ B-27 ملحق ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك 2-فوسفات ، 10 ميكرومتر SB431542 ، و 10 ميكرومتر دورسومورفين. في يوم التمايز 9 ، قام النظام بتغيير الوسط إلى DMEM / F12 والوسط العصبي القاعدي 1: 1 المكمل ب 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1 mM مكمل الجلوتامين ، و 1٪ N-2 الملحق ، 1٪ B-27 الملحق ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك 2-فوسفات ، و 1 μM حمض الريتينويك المتحول. في يوم التمايز 13-16 ، قام النظام بتغيير الوسط كل يوم باستخدام DMEM / F12 والوسط العصبي القاعدي 1: 1 المكمل ب 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1 mM مكمل الجلوتامين ، و 1٪ N-2 الملحق ، 1٪ B-27 الملحق ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك 2-فوسفات ، و 10 نانوغرام / مل bFGF و 10 نانوغرام / مل EGF. يتم تلخيص الإعدادات المستخدمة لتمايز خلايا السلائف العصبية ل iPSCs في الجدول 4.
الخلايا الكيراتينية
تم اتباع بروتوكول التمايز من منشور سابق هنا13. قام النظام بزرع hiPSCs غير المتمايزة (253G1) بكثافة 15000 خلية / سم2 في صفائح 6 آبار مغلفة بمصفوفة زراعة الخلايا في وسط استزراع hiPSC مع 10 ميكرومتر Y-27632. بعد يومين (يوم التمايز 1) ، قام النظام بتغيير الوسط إلى وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / F12 والوسط العصبي القاعدي (1: 1) مع 0.1 mM من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1 mM الجلوتامين ، 55 μM 2-mercaptoethanol ، 1٪ N-2 الملحق ، 2٪ B-27 الملحق ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك 2-فوسفات ، 0.05٪ ألبومين مصل البقر ، و 100 نانوغرام / مل FGF-basic. في يوم التمايز 3 ، وبعد ذلك ، تم تغيير الوسط إلى وسط الخلايا الكيراتينية البشرية (بدون مكمل لليوم 3 ومع مكمل في / بعد اليوم 5) مع إضافة 0.5 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون ، 1 ميكرومتر حمض الريتينويك العابر بالكامل ، 25 نانوغرام / مل hBMP-4 ، 2.4 ميكروغرام / مل أدينين ، 1.37 نانوغرام / مل ثلاثي يودوثيرونين ، 0.3 مللي مول حمض الأسكوربيك 2-فوسفات ، و 2 ميكرومتر فورسكولين ، كل يومين بواسطة النظام. يتم تلخيص الإعدادات المستخدمة لتمايز الخلايا الكيراتينية للiPSCs في الجدول 5.
كما ذكر أعلاه ، تم تنفيذ العملية بأكملها باستخدام معدات الاستزراع الآلي فقط ، من بذر خلايا iPS إلى السلسلة اللاحقة من بروتوكولات التمايز. تم تقييم التعبير عن العلامات المميزة في كل خلية (الشكل 4). وتبين أن التمايز يمكن أن يحدث باستخدام نظام استزراع آلي فقط.
الشكل 1: ملخص نظام الاستزراع الآلي. (أ) صورة للنظام توضح الحجم ومخطط التخطيط 1. (ب) صورة لمنضدة العمل ورسم تخطيطي 2. (ج) الأدوات اليدوية: الصحن والأنبوب والماصة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Bando et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مهمة المرور ونمو الخلايا. (أ) يوضح المربع كل عملية. (ب) تم حساب تمدد iPSC باستخدام كل عدد خلايا آلي في التجارب المستقلة الثلاث. (ج) الصور التمثيلية الملتقطة تلقائيا من ممر إلى آخر. قضبان المقياس = 400 ميكرومتر و 100 ميكرومتر (أقحم). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Bando et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصيانة الآلية طويلة الأجل ل iPSC. (أ) جميع التحليلات المناعية للتجارب الثلاث المستقلة ل Oct-3/4 و SSEA-4. يشير كل مدرج تكراري أزرق إلى عدم وجود تحكم أساسي في الأجسام المضادة. يمثل كل مدرج تكراري أحمر الإشارة المحددة للمستضد المشار إليها. (ب) صور تمثيلية للخلايا الملطخة كيميائيا المناعية ل Oct-3/4 و SSEA-4 و Tra 1-81. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) النمط النووي ل RIKEN2F-iPSC بعد المقطع الخامس. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Bando et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التلوين المناعي الكيميائي. الصور المناعية الكيميائية لخلايا الكبد (قضبان المقياس = 100 ميكرومتر) ، خلايا عضلة القلب (قضبان المقياس = 100 ميكرومتر) ، الخلايا السلفية العصبية (قضبان المقياس = 100 ميكرومتر) ، والخلايا الكيراتينية (قضبان المقياس = 200 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Bando et al.9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: الاستعدادات للمرور وإعدادات النظام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: استعدادات تمايز عضلة القلب وإعدادات النظام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: استعدادات تمايز خلايا الكبد وإعدادات النظام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: استعدادات تمايز خلايا السلائف العصبية وإعدادات النظام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 5: استعدادات تمايز الخلايا الكيراتينية وإعدادات النظام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات المهمة في البروتوكول في أنه إذا وجد المستخدم أي أخطاء ، فانقر فوق الزر "إلغاء" أو "إيقاف" أو "إعادة تعيين" في أي وقت وابدأ من جديد من الخطوة الأولى. يمكن للبرنامج تجنب الأخطاء البشرية ، بما في ذلك الحجز المزدوج ، وفتح الأبواب أثناء تنشيط مهام النظام ، ونقص التجديد. نقطة أخرى حاسمة للتمايز الناجح والفعال للخلية الجسدية المرغوبة هي الاختيار الصحيح لخطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات لأن كل خلية جذعية متعددة القدرات لها تحيز لا يمكن السيطرة عليه في خصائص التمايز14,15.
يمكن لنظام الاستزراع الآلي هذا للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات الحفاظ عليها وتمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا الجسدية. حجم هذا النظام 200 سم (عرض) و 110 سم (عمق) و 233 سم (ارتفاع) ، بوزن إجمالي 1.2 طن. يمكن للحاضنة المدمجة في الجهاز أن تحتوي في وقت واحد على ستة وثلاثين طبقا بطول 10 سم وتسعة أطباق متعددة الآبار.
التحسينات على النماذج السابقة هي أنه أولا ، كذراع مناولة ، تم تحويل نظام السكك الحديدية X-Y-Z-axis حديثا من ذراع مفصلي من 6 محاور ، والذي يعمل عن طريق تغيير أداة طرف الذراع إلى ثلاثة أجزاء مختلفة للأطباق والأنابيب والماصات. يتم تعليق الذراع من سقف النظام ويتحرك على طول المحور X-Y-Z. ثانيا ، تم إدخال نظام عد الخلايا لثقافات الصيانة الخالية من التغذية وبروتوكولات تحريض التمايز التي يتم إجراؤها بشكل مستمر من الممر. بعد خلط محلول التعليق أحادي الخلية مع محلول التريبان الأزرق ، تم نقله إلى مقياس الدم القابل للتصرف للمراقبة المجهرية والتصوير. يقوم البرنامج تلقائيا بتحليل الصورة التي تم الحصول عليها لحساب عدد الخلايا الحية وحساب الحجم المطلوب لزرع العدد المطلوب من الخلايا. كانت دقة عدد الخلايا التي تم الحصول عليها بواسطة تحليل الصور هذا متسقة مع تلك التي تم الحصول عليها يدويا.
تم تطبيق نظام السكك الحديدية X-Y-Z-axes للتعامل مع كل مهمة بشكل أسرع من الإصدار السابق (ذراع مفصلي متعدد المحاور). باستخدام نظام الاستزراع الآلي هذا ، تم إجراء خمسة مقاطع مستمرة لمدة 16 يوما ، وتم توسيع iPSCs 625 ± 93 ضعفا. على الرغم من أن إثبات القدرة على التحمل لوقت صيانة الخلايا بدون خلايا مغذية كان أقصر من العرض التوضيحي السابق مع الخلايا المغذية ، إلا أن تمدد الخلية كان أكثر كفاءة مقارنة بالعرض السابق6. يبدو أن تقصير وقت المهمة يساهم في منع تلف الخلايا من الجفاف أثناء المهام.
علاوة على ذلك ، تم تنفيذ مهام التمايز من ثقافة الصيانة إلى التمايز إلى خلايا عضلة القلب وخلايا الكبد وخلايا السلائف العصبية والخلايا الكيراتينية دون تدخل بشري. بعد سلسلة من هذه الدورات ، تم التأكيد من خلال التلوين المناعي الفلوري أن الخلايا التي تم الحصول عليها في نظام الاستزراع الآلي وحده قد تمايزت إلى الخلايا المطلوبة. لذلك ، من خلال مشاركة برنامج مهام واستخدام هذا النظام ، يمكن للباحثين الذين ليسوا على دراية بإدارة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات الحصول على خلايا جسدية مشتقة من iPSC لأبحاثهم الخاصة. علاوة على ذلك ، يمكن القضاء على الاختلافات في قابلية التكاثر بين الباحثين أو المرافق قدر الإمكان ، ويمكن أن يضمن الحصول على خلايا ذات جودة متجانسة في كل مرة.
من خلال اعتماد نظام سكة حديد جديد ، يمكن تقليص حجم المعدات وتقليل وزنها إلى 1.2 طن ، ~ 200 كجم أخف من ذي قبل. علاوة على ذلك ، يمكن تخفيض تكاليف قطع الغيار وإعداد البرامج بحوالي 10000 دولار أمريكي. وقدرت تكاليف الصيانة والبرمجة بانخفاض بنسبة 13 في المائة. من أجل تحفيز المزيد من الباحثين على الدخول في الأبحاث المتعلقة بالخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات بسهولة ، من المهم أيضا الحفاظ على تكاليف المعدات منخفضة6. نأمل أن تكون أنظمة الزراعة الأوتوماتيكية الحالية والجيل التالي واحدة من المساهمات في المساعدة في توفير iPSCs والخلايا المتمايزة المشتقة من iPSC بجودة أكثر اتساقا.
تتمثل القيود الرئيسية لهذا النظام في قدرة الثلاجة المحدودة على التخزين المؤقت للمزارع وضعفها في التعامل مع كميات صغيرة (<100 ميكرولتر) من السائل. علاوة على ذلك ، فإن الافتقار إلى الذكاء الاصطناعي المتطور يعطل التحسين التلقائي وفقا لحالة الخلية في الوقت المحدد. القيد البسيط هو متطلبات نصائح ماصة خاصة مقدمة من الشركات المصنعة للنظام 4,5. نحن نعمل على تطوير الجيل التالي من أنظمة الاستزراع التي ستكون قادرة على التعامل مع كميات صغيرة من السائل للتحضيرات المتوسطة وتتضمن نظام تحسين التغذية المرتدة القائم على الذكاء الاصطناعي عالي الأداء (تعلم النظام). تمتلك الشركة المصنعة المتعاونة9 لدينا ما يكفي من المعرفة لبناء أنظمة مخصصة وفقا للاحتياجات الخاصة للمستخدمين. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم طرح أنظمة الجيل التالي المجهزة بوظائف أكثر عمومية وأوسع في السوق قريبا. نحن نفكر أيضا في نظام تأجير قائم على الاشتراك لتوفير أنظمة حديثة لجميع المستخدمين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من مركز ترويج الأعمال الجديدة ، شركة باناسونيك لهندسة الإنتاج المحدودة ، أوساكا ، اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
