Summary
在这里，我们提出了一种自动化细胞培养系统的方案。这种自动化培养系统减少了劳动力，使用户受益，包括不熟悉处理诱导多能干细胞（iPS）细胞的研究人员，从iPS细胞的维持到分化为各种类型的细胞。
Abstract
具有无限自我增殖能力的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）有望在众多领域得到应用，包括阐明罕见病病理学、开发新药以及旨在恢复受损器官的再生医学。尽管如此，hiPSCs的社会实施仍然有限。这在一定程度上是因为iPSCs对微小环境变化的高度敏感性，即使拥有先进的知识和复杂的技术技能，也难以在培养物中复制分化。自动化培养系统的应用可以解决这个问题。根据不同研究所的共享程序，可以预期具有独立于研究人员技能的高可重复性的实验。尽管之前已经开发了几种可以维持 iPSC 培养物和诱导分化的自动化培养系统，但这些系统笨重、大且成本高昂，因为它们使用了人源化、多关节的机械臂。为了改善上述问题，我们开发了一种使用简单的 x-y-z 轴滑轨系统的新系统，使其更紧凑、更轻、更便宜。此外，用户可以轻松修改新系统中的参数以开发新的处理任务。一旦建立了任务，用户需要做的就是准备iPSC，提前提供所需任务所需的试剂和耗材，选择任务编号，并指定时间。我们证实，该系统可以在没有饲养细胞的情况下通过多次传代将 iPSC 维持在未分化状态，并分化为各种细胞类型，包括心肌细胞、肝细胞、神经祖细胞和角质形成细胞。该系统将实现跨机构高度可重复的实验，而无需熟练的研究人员，并将通过减少新条目的障碍，促进hiPSCs在更广泛的研究领域的社会实施。
Introduction
本文旨在为我们与一家公司合作生产的人诱导多能干细胞（iPSC）的自动化培养系统提供实际和详细的处理程序，并展示具有代表性的结果。
自2007年文章发表以来，iPSC一直受到全世界的关注1。由于其最大的特点是能够分化成任何类型的体细胞，因此有望应用于再生医学、阐明疑难杂症的病因和开发新的治疗药物等各个领域2,3。此外，使用人类iPSC衍生的体细胞可以减少动物实验，这些实验受到重大的伦理限制。尽管不断需要大量同质的 iPSC 来研究 iPSC 的新方法，但管理它们太费力了。此外，由于iPSC的敏感性很高，因此处理iPSC很困难，即使对细微的文化和环境变化也是如此。
为了解决这个问题，自动化培养系统应该代替人类执行任务。一些研究小组已经开发了一些用于细胞维持和分化的自动化人类多能干细胞培养系统，并发表了他们的成就4,5,6。这些系统配备了多关节机械臂。机械臂不仅具有高度模仿人类手臂运动的优点，而且缺点在于它们需要更高的手臂成本、更大更重的系统包装以及工程师为获得目标运动而耗时的教育工作 7,8。为了在经济、空间和人力资源消耗方面更容易将该设备引入更多的研究机构，我们开发了一种新型自动化培养系统，用于维持 iPSC 并将其分化为各种细胞类型9。
我们采用新系统的理由是采用 X-Y-Z 轴导轨系统，而不是多关节机械臂9。为了取代机械臂复杂的手部功能，我们在这个系统中应用了一个新思路，它可以自动改变三种类型的特定功能臂尖。在这里，我们还指出了用户如何通过软件上的简单订单轻松制定任务计划，因为在整个过程中对工程师的贡献缺乏要求。
其中一个机器人培养系统已经证明了使用 96 孔板作为 3D 细胞聚集体进行分化4 来制造胚状体。此处报告的系统无法处理 96 孔板。其中一种使用细胞系达到了当前的良好生产规范（cGMP）等级，尽管它不是人类多能干细胞5。这里详细介绍的自动化培养系统现在已经开发出来，其具体目的是帮助实验室实验（图1）。但是，它有足够的系统来保持相当于 IV 级安全柜的清洁水平。
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Protocol
关西医科大学伦理委员会批准了名为KMUR001的健康志愿者来源的iPSCs的产生和使用（批准号2020197）。公开招募的捐赠者提供了正式的知情同意书，并同意细胞的科学使用。
注意：当前界面（在Windows XP操作系统下运行的名为“ccssHMI”的特殊软件）是基本操作屏幕。在上述界面下，排列了一系列选项卡，允许用户启动各种操作。
1. 装载操作
- 点击 加载 软件顶部屏幕上的 按钮 。单击 “加载准备开始” 按钮。
- 将要输入设备的盘子或盘子放在设备中的位置。
注意： 每个盖子上都应写有识别盘子的必要信息。 - 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。
- 在软件中选择盘子或盘子的类型和数量。
- 单击 “加载准备完成 ”按钮。单击 “加载开始 ”按钮。
- 将培养皿上传到系统后，在软件上选择皿上的信息，例如 有 iPS 细胞 或 不使用 iPS 细胞的信息。在软件中注册有关每道菜的注释。
- 点击最后的 注册 按钮，完成加载操作。
2.卸料操作
- 单击软件顶部屏幕上的 “卸载 ”按钮。在软件中选择要删除的盘子。
- 选择菜肴后，单击卸 载准备开始 按钮。单击“ 卸载开始” 按钮。
- 将培养皿从培养箱转移到系统中的工作台后，按下 培养皿移除 按钮。
- 手动打开前滑动窗并取出盘子。手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。
3.耗材的补充：移液器、试管和培养基
- 要补充移液器、试管和培养基等耗材，请单击软件顶部屏幕上的 “耗材 ”按钮，然后选择要补充的项目。
- 移液器
- 单击 移液器 按钮。选择“ 补充 ”按钮。
- 选择用户要在软件上补充的机架。单击“ 补充开始 ”按钮。
- 确认工作台上移液器存放区域的盖子打开后，手动打开前滑动窗口并根据需要补充移液器。
- 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。单击“ 补充已完成 ”按钮。
- 单击“ 补货设置 ”按钮并输入补货信息，然后单击 “注册 ”按钮。
- 单击“ 补充已完成 ”按钮。
- 管
- 单击 “管 ”按钮。选择“ 补充 ”按钮。
- 选择用户要在软件上补充的机架。单击“ 补充开始 ”按钮。
- 确认机架已移动到顶部后，单击“ 补充管 ”按钮。
- 手动打开前滑动窗并根据需要补充管子。
- 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。
- 单击“ 补充已完成 ”按钮。
- 单击“ 补货设置 ”按钮并输入补货信息，然后单击 “注册 ”按钮。单击 “关闭 ”按钮。
- 中等
- 单击 “中” 按钮。选择软件中的 “补充 ”按钮。
- 从用户要补货的三个机架中选择一个机架。单击“ 补充开始 ”按钮。
- 确认介质存储区的盖子已打开后，手动打开前滑动窗口并补充介质。
- 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。
- 单击“ 补充已完成 ”按钮。
- 单击“ 补充 ”按钮，然后输入介质的信息，包括介质的名称和数量。如有必要，请输入其他注释。
- 单击 “注册 ”按钮。
- 单击 “关闭 ”按钮。
- 移液器
4. 任务选择
- 单击软件顶部屏幕上 的“任务 ”按钮。
- 选择 “任务设置 ”按钮。从任务列表中选择所需的任务，然后单击“ 下一步 ”按钮。
- 指定执行任务的日期和时间，然后单击 “注册 ”按钮。选择要执行任务的盘子或盘子，然后单击 “注册 ”按钮。
- 重新确认所选任务后，单击 “注册 ”按钮。确认任务已在下一个屏幕上注册。
- 如有必要，请以相同的方式设置下一个任务。
- 单击末尾的 “开始” 按钮。然后，任务将在指定的日期和时间自动启动。
注意： 完成每项任务后，紫外线灯（位于抽油烟机两侧）立即自动打开，5-30 分钟后，根据辅助设置，它们关闭以保持抽油烟机处于无菌状态。若要停止，用户可以单击 “开始 ”按钮。 - 如果用户想要提前取消计划任务，请单击“ 停止 ”按钮。
- 选择要中止的任务后，单击“ 编辑任务 ”按钮。
- 单击 “任务取消 ”按钮。在下一个屏幕上确认任务已被删除。
5.检查细胞图片
- 每个任务都包括任务工作前后的显微观察（拍照）。通过在每项任务之前或之后结合显微摄影任务，以摄影方式观察细胞培养的进展。
- 选择预设的任务程序，包括提前选择培养皿或孔板的多个特定位置进行定点观察，以监测同一位置随时间的变化。
6. 传代和分化
- 按照第 1-5 节中的步骤操作，设置自动细胞培养系统以执行传代和分化。传代、心肌细胞分化、肝细胞分化、神经前体细胞分化和角质形成细胞分化的仪器设置分别如 表1、表2、表3、表4和 表5所示。
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Representative Results
维持人诱导的多能干细胞
我们使用了三种hPSC细胞系（RIKEN-2F、253G1和KMUR001）。我们通过每天的手动实验优化了维护方案，并通过系统进行的七次初步实验进一步优化了详细程序。例如，由人类和系统处理的不同移液器的唾液流速引起的剪切应力是完全不同的;因此，我们优化了酶消化的时间长度和系统细胞分散的移液次数。
将人诱导的多能干细胞维持在涂有 0.5 μg/cm2 细胞培养基质的 10 cm 培养皿上，并配以 hiPSC 培养基（例如，Neutristem 或 StemFit AK02N）。对于传代，系统被编程为用 5 mL 不含钙的磷酸盐缓冲盐水 （PBS[-]） 洗涤 hiPSC 三次，然后用 3 mL 补充有 10 μM Rho 激酶抑制剂 （Y-27632） 的 TrypLE 表达酶在 37 °C 下处理 15 分钟。 之后，系统向板中加入 9 mL 含 0.15% 牛血清白蛋白组分 V （BSA） 的 PBS（-），并执行两组运动，吸出 10 mL 含细胞液体，并以锯齿形运动从移液器吸头中分配液体，穿过板的顶部，该板倾斜 20° 靠近板表面， 并重复上述操作顺序，将板在另一侧倾斜 20°。然后，系统将含细胞的培养基收集在 15 mL 试管中并盖上盖子，然后以 115 x g 离心 5 分钟以沉积细胞。此后，系统吸出上清液，并使用含有 10 μM Y-27632 的 10 mL 培养基通过移液 10 次将细胞沉淀分散到单个细胞中。该系统将 1 mL 台盼蓝溶液转移到新的 15 mL 试管中，然后加入 1 mL 细胞悬液并通过移液 5 次混合。之后，将 100 μL 台盼蓝染色细胞溶液吸入支架中一次性血细胞计数器的入口窗口中。系统将血细胞计数器支架移至显微观察区，并拍摄一张照片，立即通过软件进行分析，将获得的细胞浓度应用于下一步。为了维持iPSC，系统将细胞密度为15,000个细胞/cm2 的细胞接种在涂有0.5μg/cm2 细胞培养基质的新的10 cm直径塑料板中。对于分化实验，系统将细胞以所需的细胞密度接种在为每种体细胞类型制备的培养基中，在涂有稀释至 1/100 的细胞培养基质的 6 孔板中。最后，系统在将板转移到培养箱之前进行了五次交叉锁定。将3个含有iPSCs的10cm新板和3个细胞培养基质预包被板装入系统，并根据上述程序制备其他必要物品。一个维持培养周期包括第 1 天的传代任务，然后每天更换一次培养基，持续 3 天。在整个实验过程中，这个循环被设置为五个周期。此外，消耗品也依次补充。
根据有序的时间表，系统按计划成功执行了五个周期的维护培养。从每次任务期间自动拍摄的细胞照片中，可以确认细胞随着时间的推移而平稳增殖。计算单元扩展 （n = 3） 并显示 在图 2 中。为了确认iPSC的未分化状态是否即使在自动培养系统中维持培养后仍保持不变，在每次传代时使用剩余样品进行免疫细胞术分析（Oct3/4和SSEA4）（图3A）。此外，经过五个循环后，从系统中卸下三个培养皿，并进行免疫组织化学分析（Oct3/4、SSEA4 和 Tra1-81）（图 3B）。使用荧光免疫染色的两种分析均显示，iPS细胞的未分化状态得以保留。在自动培养系统中维持培养之前和之后，还对iPSC进行核型分析。尽管在维持培养开始之前在17号染色体的等位基因中观察到异常，但在5次维持培养后，系统没有观察到特别的变化，包括异常（图3C）。表 1总结了用于维持iPSCs的设置。
分化
心肌细胞
此处遵循了先前出版物的鉴别方案10.该系统在补充有 10 μM Y-27632 的 hiPSC 培养基质包被的 6 孔板中以 30,000 个细胞/cm2 的密度将未分化的 hiPSC （KMUR001） 接种。3 天后（分化第 1 天），系统将培养基更换为含有 6 μM GSK-3ß 抑制剂 CHIR-99021、20 ng/mL Activin A 和 10 ng/mL BMP4 的人多能干细胞培养基。在分化第 3 天，系统更改为 CDM3 培养基：RPMI 1640、500 μg/mL 重组人白蛋白和 213 μg/mL L-抗坏血酸 2-磷酸和 2 μM Wnt-C59。在分化第5天，系统更换为新鲜CDM3培养基;此后，每隔一天重复更换新鲜CDM3培养基。表 2总结了用于iPSCs心肌细胞分化的设置。
肝细胞
此处遵循了先前出版物的差异化协议11.该系统在补充有 10 μM Y-27632 的 hiPSC 培养基质包被的 6 孔板上以 25,000 个细胞/cm2 的密度将未分化的 hiPSC （RIKEN2F） 接种。2 天后（分化第 1 天），系统将培养基更换为 RPMI-1640 加 2% B27 减去胰岛素 （RPMI-B27），其中包含 100 ng/mL 激活素 A、6 μM CHIR-99021 和 1% 谷氨酰胺补充剂（例如，GlutaMAX）24 小时。在分化第 2 天，我们将培养基更换为 RPMI-B27，加入 50 ng/mL 激活素 A。在分化第 5 天，系统将培养基更改为 RPMI-B27，含有 1% 谷氨酰胺补充剂和 10 ng/mL BMP-4。在分化第 9 天，系统将培养基更换为肝细胞成熟培养基：Leibovitz 的 L-15 培养基含有 8.3% 胰蛋白酶磷酸肉汤、10 μM 氢化可的松 21-琥珀酸酯、50 μg/mL L-抗坏血酸钠、100 nM 地塞米松、0.58% 胰岛素-转铁蛋白-硒、2 mM 谷氨酰胺补充剂、8.3% 胎牛血清和 100 nM rac-1,2-二十六烷基甘油。此后，系统每隔一天重复将培养基更换为新鲜培养基。表 3总结了用于iPSCs肝细胞分化的设置。
神经元前体细胞
此处遵循了先前出版物的分化协议12.该系统将密度为 25,000 个细胞/cm2 的未分化 hiPSC （RIKEN2F） 接种在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM）/F12 和补充有 10% 敲除血清替代物、0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 谷氨酰胺补充剂和 10 μM TGF-β 受体抑制剂 （SB431542）、10 μM BMP 信号抑制剂（dorsomorphin）、10 μM BMP 信号抑制剂 （dorsomorphin） 的基底膜基质包被的 6 孔板上， 和 10 μM Y-27632（分化第 1 天）。在分化第 5 天，系统将培养基更换为 DMEM/F12 和 Neurobasal 培养基 1：1，补充有 0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 谷氨酰胺补充剂、1% N-2 补充剂、1% B-27 补充剂、50 μg/mL 抗坏血酸 2-磷酸、10 μM SB431542 和 10 μM dorsomorphin。在分化第 9 天，系统将培养基更换为 DMEM/F12 和 1：1 神经基础培养基，补充有 0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 谷氨酰胺补充剂、1% N-2 补充剂、1% B-27 补充剂、50 μg/mL 抗坏血酸 2-磷酸和 1 μM 全反式视黄酸。在分化第 13-16 天，系统每天更换培养基，添加 DMEM/F12 和 1：1 的神经基础培养基，补充有 0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 谷氨酰胺补充剂、1% N-2 补充剂、1% B-27 补充剂、50 μg/mL 抗坏血酸 2-磷酸、10 ng/mL bFGF 和 10 ng/mL EGF。表 4总结了用于iPSCs的神经前体细胞分化的设置。
角质形成细胞
这里遵循了先前出版物的鉴别协议13.该系统在含有 10 μM Y-27632 的 hiPSC 培养基质包被的 6 孔板中以 15,000 个细胞/cm2 的密度接种未分化的 hiPSC （253G1）。2 天后（分化第 1 天），系统将培养基更换为 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM）/F12 和 Neurobasal 培养基 （1：1），其中含有 0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 谷氨酰胺、55 μM 2-巯基乙醇、1% N-2 添加剂、2% B-27 添加剂、50 μg/mL 抗坏血酸 2-磷酸、0.05% 牛血清白蛋白和 100 ng/mL 碱性 FGF。在第 3 天分化时，此后将培养基更改为人角质形成细胞培养基（第 3 天不添加，第 5 天/之后添加补充剂），加入 0.5 μg/mL 氢化可的松、1 μM 全反式视黄酸、25 ng/mL hBMP-4、2.4 μg/mL 腺嘌呤、1.37 ng/mL 三碘甲状腺原氨酸、0.3 mM 抗坏血酸 2-磷酸， 和 2 μM 毛喉素，每 2 天由系统使用。表 5总结了用于iPSC角质形成细胞分化的设置。
如上所述，整个过程仅使用自动化培养设备进行，从接种 iPS 细胞到随后的一系列分化方案。评估每个细胞中特征标志物的表达（图4）。结果表明，仅使用自动培养系统即可诱导分化。
图 1：自动化培养系统摘要。 （A） 显示尺寸和布局草图的系统图片 1.（B） 工作台图片和布局草图 2.（C） 手动工具：培养皿、试管和移液器。此图经 Bando 等人许可修改 9. 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：传代任务和细胞生长。 （A） 正方形表示每个过程。（B） 使用三个独立实验中的每个自动细胞计数计算的 iPSC 扩增。（C） 从通道到通道自动捕获的代表性图像。比例尺 = 400 μm 和 100 μm（插图）。此图经 Bando 等人许可修改 9. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：iPSC 的自动长期维护。 （A） Oct-3/4 和 SSEA-4 的三个独立实验的所有免疫细胞术分析。每个蓝色直方图表示没有一抗对照。每个红色直方图代表指示的抗原特异性信号。（B） Oct-3/4、SSEA-4 和 Tra 1-81 免疫组织化学染色细胞的代表性图像。比例尺 = 50 μm。 （C） 第五次传代后 RIKEN2F-iPSC 的核型。此图经 Bando 等人许可修改 9. 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：免疫组化染色。 肝细胞（比例尺 = 100 μm）、心肌细胞（比例尺 = 100 μm）、神经元祖细胞（比例尺 = 100 μm）和角质形成细胞（比例尺 = 200 μm）的免疫组织化学图片。此图经 Bando 等人许可修改 9. 请点击这里查看此图的较大版本.
表 1：通道准备和系统设置。请按此下载此表格。
表2：心肌细胞分化制剂和系统设置。请按此下载此表格。
表3：肝细胞分化制剂和系统设置。请按此下载此表格。
表4：神经前体细胞分化制备和系统设置。请按此下载此表格。
表5：角质形成细胞分化制剂和系统设置。请按此下载此表格。
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Discussion
协议中的一个关键步骤是，如果用户发现任何故障，请随时单击取消、停止或重置按钮，然后从第一步重新开始。该软件可以避免人为错误，包括重复预订、在系统任务处于活动状态时开门以及缺乏补货。成功和有效分化为所需体细胞的另一个关键点是正确选择多能干细胞系，因为每个多能干细胞在其分化特性中都具有不可控的偏差14,15。
这种用于诱导多能干细胞的自动化培养系统可以维持和分化为各种体细胞类型。该系统的尺寸为200厘米（宽），110厘米（深），233厘米（高），总重量为1.2吨。设备内置的培养箱可同时容纳 36 个 10 cm 培养皿和 9 个多孔板。
与以前的型号相比，改进之处在于，首先，作为搬运臂，X-Y-Z轴导轨系统由6轴铰接臂新改装而成，其工作原理是将臂的尖端工具更改为用于培养皿、管子和移液器的三个不同部件。机械臂悬挂在系统的天花板上，并沿 X-Y-Z 轴移动。其次，引入了细胞计数系统，用于从传代开始连续执行的无饲养层维持培养物和分化诱导方案。将单细胞悬浮液与台盼蓝溶液混合后，转入一次性血细胞计数器进行显微镜观察和成像。该软件自动分析获得的图像以计算活细胞的数量，并计算接种所需细胞数量所需的体积。通过该图像分析获得的细胞计数的准确性与手动获得的一致。
X-Y-Z轴导轨系统比以前的版本（多轴铰接臂）更快地处理每项任务。使用这种自动培养系统，连续 16 天进行 5 次传代，iPSC 扩增 625 倍± 93 倍。尽管在没有饲养细胞的情况下，细胞维持时间的耐久性证明比我们之前的饲养细胞演示要短，但与之前的演示相比，细胞扩增效率更高6.缩短的任务时间似乎有助于防止细胞损伤在任务期间干燥。
此外，从维持培养到分化为心肌细胞、肝细胞、神经元前体细胞和角质形成细胞的分化任务是在没有人为干预的情况下进行的。经过一系列这些疗程后，通过荧光免疫染色证实，仅在自动培养系统中获得的细胞已经分化为所需的细胞。因此，通过共享任务程序并使用该系统，不熟悉 iPS 细胞管理的研究人员可以获得 iPSC 衍生的体细胞用于自己的研究。此外，可以尽可能地消除研究人员或设施之间可重复性的差异，并且可以确保每次都能获得质量均匀的细胞。
通过采用新的轨道系统，设备可以缩小尺寸并减轻到1.2吨，比以前轻~200公斤。此外，零件和程序设置成本可以减少约 10,000 美元。据估计，维护和编程成本将下降13%。为了激励更多的研究人员轻松进入iPS细胞相关研究，保持较低的设备成本也很重要6。我们希望当前和下一代自动培养系统能够帮助提供质量更均匀的 iPSC 和 iPSC 衍生的分化细胞。
该系统的主要局限性是冰箱暂定储存培养物的容量有限，并且在处理少量 （<100 μL） 液体方面较弱。此外，由于缺乏复杂的人工智能，无法根据导通时间电池条件进行自动优化。次要限制是系统制造商提供的特殊移液器吸头的要求 4,5.我们正在开发下一代培养系统，该系统将能够处理少量液体用于培养基制剂，并包括基于高性能人工智能（系统学习）的反馈优化系统。我们的合作制造商9 拥有足够的专业知识，可以根据用户的特殊需求构建定制系统。除此之外，配备更通用和更广泛功能的下一代系统将很快投放市场。我们还在考虑采用基于订阅的租赁系统，为所有用户提供最新的系统。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了日本大阪松下生产工程有限公司新业务促进中心的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
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