Summary
Nous présentons ici un protocole pour un système automatisé de culture cellulaire. Ce système de culture automatisé réduit la main-d’œuvre et profite aux utilisateurs, y compris les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la manipulation des cellules souches pluripotentes induites (iPS), de l’entretien des cellules iPS à la différenciation en différents types de cellules.
Abstract
On s’attend à ce que les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) à capacité infinie d’auto-prolifération aient des applications dans de nombreux domaines, notamment l’élucidation de pathologies de maladies rares, le développement de nouveaux médicaments et la médecine régénérative visant à restaurer les organes endommagés. Malgré cela, la mise en œuvre sociale des HIPc est encore limitée. Cela s’explique en partie par la difficulté de reproduire la différenciation dans la culture, même avec des connaissances avancées et des compétences techniques sophistiquées, en raison de la grande sensibilité des CSPi aux changements environnementaux infimes. L’application d’un système de culture automatisé peut résoudre ce problème. On peut s’attendre à des expériences avec une reproductibilité élevée, indépendamment des compétences d’un chercheur, selon une procédure partagée entre différents instituts. Bien que plusieurs systèmes de culture automatisés capables de maintenir les cultures iPSC et d’induire une différenciation aient déjà été développés, ces systèmes sont lourds, volumineux et coûteux car ils utilisent des bras robotiques humanisés et multi-articulés. Pour améliorer les problèmes ci-dessus, nous avons développé un nouveau système utilisant un système simple de glissière sur l’axe x-y-z, ce qui lui permet d’être plus compact, plus léger et moins cher. De plus, l’utilisateur peut facilement modifier les paramètres du nouveau système pour développer de nouvelles tâches de manutention. Une fois qu’une tâche est établie, il suffit à l’utilisateur de préparer l’iPSC, de fournir à l’avance les réactifs et les consommables nécessaires à la tâche souhaitée, de sélectionner le numéro de la tâche et de spécifier l’heure. Nous avons confirmé que le système pouvait maintenir les cellules iPS dans un état indifférencié à travers plusieurs passages sans cellules nourricières et se différencier en différents types de cellules, y compris les cardiomyocytes, les hépatocytes, les progéniteurs neuronaux et les kératinocytes. Le système permettra des expériences hautement reproductibles dans tous les établissements sans avoir besoin de chercheurs qualifiés et facilitera la mise en œuvre sociale des hiPSC dans un plus large éventail de domaines de recherche en diminuant les obstacles à de nouvelles entrées.
Introduction
Cet article vise à fournir des procédures de manipulation réelles et détaillées pour un système automatisé de culture de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPi), que nous avons produit en collaboration avec une entreprise, et à montrer des résultats représentatifs.
Depuis la publication de l’article en 2007, l’iPSC a attiré l’attention dans le monde entier1. En raison de sa plus grande caractéristique de pouvoir se différencier en n’importe quel type de cellule somatique, il devrait être appliqué dans divers domaines tels que la médecine régénérative, l’élucidation des causes des maladies incurables et le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques 2,3. De plus, l’utilisation de cellules somatiques humaines dérivées de cellules iPSC pourrait réduire les expérimentations animales, qui sont soumises à d’importantes restrictions éthiques. Bien que de nombreuses cellules iPS homogènes soient constamment nécessaires pour rechercher de nouvelles méthodes avec des cellules iPS, il est trop laborieux de les gérer. De plus, la manipulation des cellules iPS est difficile en raison de sa grande sensibilité, même aux changements culturels et environnementaux subtils.
Pour résoudre ce problème, on s’attend à ce que les systèmes de culture automatisés effectuent des tâches à la place des humains. Certains groupes ont mis au point quelques systèmes automatisés de culture de cellules souches pluripotentes humaines pour le maintien et la différenciation cellulaires et ont publié leurs résultats 4,5,6. Ces systèmes équipent un ou plusieurs bras robotiques multiarticulés. Les bras robotiques ont non seulement l’avantage d’imiter fortement les mouvements des bras humains, mais aussi l’inconvénient d’exiger des coûts plus élevés pour le(s) bras(s), un emballage de système plus grand et plus lourd et des efforts d’éducation fastidieux de la part des ingénieurs pour obtenir les mouvements visés 7,8. Afin de faciliter l’introduction de l’appareil dans un plus grand nombre d’installations de recherche aux points de consommation économique, d’espace et de ressources humaines, nous avons développé un nouveau système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation des CSPi en différents types de cellules9.
La raison d’être de ce nouveau système était d’adopter un système de rails sur les axes X-Y-Z au lieu de bras robotiques multiarticulés9. Pour remplacer les fonctions complexes des bras robotiques, nous avons appliqué une nouvelle idée à ce système, qui peut changer automatiquement trois types d’embouts de bras fonctionnels spécifiques. Ici, nous indiquons également comment les utilisateurs peuvent facilement établir des calendriers de tâches avec de simples commandes sur un logiciel en raison de l’absence d’exigences pour les contributions des ingénieurs tout au long du processus.
L’un des systèmes de culture robotisés a démontré la fabrication de corps embryoïdes en utilisant des plaques à 96 puits comme agrégats cellulaires 3D pour la différenciation4. Le système décrit ici ne peut pas traiter les plaques à 96 puits. L’une d’entre elles a obtenu la note actuelle de bonnes pratiques de fabrication (BPF) en utilisant une lignée cellulaire, bien qu’il ne s’agisse pas d’une cellule souche pluripotente humaine5. Le système de culture automatisé détaillé ici a maintenant été développé dans le but spécifique d’aider les expériences de laboratoire (Figure 1). Cependant, il dispose de suffisamment de systèmes pour maintenir des niveaux de propreté équivalents à ceux d’une armoire de sécurité de niveau IV.
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Protocol
Le comité d’éthique de l’Université de médecine du Kansai a approuvé la production et l’utilisation de cellules iPS saines dérivées de volontaires nommées KMUR001 (approbation n° 2020197). Le donneur, qui a été ouvertement recruté, a donné son consentement formel et éclairé et était d’accord avec l’utilisation scientifique des cellules.
REMARQUE : L’interface actuelle (le logiciel spécial nommé « ccssHMI » fonctionnant sous le système d’exploitation Windows XP) est l’écran de fonctionnement fondamental. Sous l’interface susmentionnée, une série d’onglets sont organisés, permettant aux utilisateurs de lancer diverses opérations.
1. Opérations de chargement
- Cliquez sur le bouton Chargement sur l’écran supérieur du logiciel. Cliquez sur le bouton Début de la préparation du chargement .
- Placez le(s) plat(s) ou l’assiette(s) à entrer dans l’appareil en position dans l’appareil.
REMARQUE : Les informations nécessaires à l’identification de la boîte doivent être écrites sur chaque couvercle. - Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
- Sélectionnez le type et la quantité de plat(s) ou d’assiette(s) dans le logiciel.
- Cliquez sur le bouton Préparation du chargement terminée . Cliquez sur le bouton Début du chargement .
- Une fois qu’une antenne parabolique est téléchargée dans le système, sélectionnez les informations sur la parabole, par exemple avec ou sans cellules iPS, dans le logiciel. Enregistrez des notes sur chaque plat dans le logiciel.
- Cliquez sur le bouton Enregistrement à la fin pour terminer l’opération de chargement.
2. Opération de déchargement
- Cliquez sur le bouton Décharger sur l’écran supérieur du logiciel. Sélectionnez la ou les paraboles à supprimer dans le logiciel.
- Après avoir sélectionné le(s) plat(s), cliquez sur le bouton Démarrer la préparation du déchargement . Cliquez sur le bouton Démarrer le déchargement .
- Une fois que la ou les boîtes ont été transférées de l’incubateur à l’établi dans le système, appuyez sur le bouton Dish Removal .
- Ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et sortez le(s) plat(s). Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
3. Supplément de consommables : pipettes, tubes et milieu
- Pour réapprovisionner les consommables tels que les pipettes, les tubes et le milieu, cliquez sur le bouton Consommables sur l’écran supérieur du logiciel, puis sélectionnez l’élément à réapprovisionner.
- Pipettes
- Cliquez sur le bouton Pipetette . Sélectionnez le bouton Réapprovisionner .
- Sélectionnez un rack que l’utilisateur souhaite réapprovisionner sur le logiciel. Cliquez sur le bouton Démarrer du réapprovisionnement .
- Après avoir vérifié que le couvercle de la zone de stockage des pipettes sur l’établi est ouvert, ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et remplissez les pipettes si nécessaire.
- Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique. Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Cliquez sur le bouton Configuration du réapprovisionnement et saisissez les informations relatives au réapprovisionnement, puis cliquez sur le bouton Enregistrement .
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Tubes
- Cliquez sur le bouton Tube . Sélectionnez le bouton Réapprovisionner .
- Sélectionnez un rack que l’utilisateur souhaite réapprovisionner sur le logiciel. Cliquez sur le bouton Démarrer du réapprovisionnement .
- Après avoir vérifié que le rack s’est déplacé vers le haut, cliquez sur le bouton Réapprovisionner le tube .
- Ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et remplissez les tubes au besoin.
- Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Cliquez sur le bouton Configuration du réapprovisionnement et saisissez les informations relatives au réapprovisionnement, puis cliquez sur le bouton Enregistrement . Cliquez sur le bouton Fermer .
- Douleur moyenne
- Cliquez sur le bouton Moyen . Sélectionnez le bouton Réapprovisionner dans le logiciel.
- Sélectionnez un rack parmi trois que les utilisateurs souhaitent réapprovisionner. Cliquez sur le bouton Démarrer du réapprovisionnement .
- Après avoir vérifié que le couvercle de la zone de stockage du support a été ouvert, ouvrez manuellement la fenêtre coulissante avant et réapprovisionnez le support.
- Fermez manuellement la vitre coulissante avant et appuyez sur le bouton de confirmation de sécurité mécanique.
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner terminé .
- Cliquez sur le bouton Réapprovisionner et entrez les informations relatives au support, y compris le nom et la quantité du support. Saisissez des commentaires supplémentaires si nécessaire.
- Cliquez sur le bouton Inscription .
- Cliquez sur le bouton Fermer .
- Pipettes
4. Sélection des tâches
- Cliquez sur le bouton Tâche sur l’écran supérieur du logiciel.
- Sélectionnez le bouton Paramètre de tâche . Sélectionnez la tâche souhaitée dans la liste des tâches et cliquez sur le bouton Étape suivante .
- Spécifiez la date et l’heure d’exécution de la tâche, puis cliquez sur le bouton Inscription . Sélectionnez un plat ou une assiette pour effectuer la tâche, puis cliquez sur le bouton Enregistrement .
- Après avoir reconfirmé la tâche sélectionnée, cliquez sur le bouton Inscription . Confirmez que la tâche a été enregistrée sur l’écran suivant.
- Si nécessaire, définissez la tâche suivante de la même manière.
- Cliquez sur le bouton Démarrer à la fin. Ensuite, la tâche démarrera automatiquement à la date et à l’heure spécifiées.
REMARQUE : Immédiatement après avoir terminé chaque tâche, les lampes UV (situées sur les deux côtés de la hotte) s’allument automatiquement et, après 5 à 30 minutes, conformément au réglage auxiliaire, elles s’éteignent pour maintenir la hotte en état d’asepsie. Pour arrêter, les utilisateurs peuvent cliquer sur le bouton Démarrer . - Si les utilisateurs souhaitent annuler une tâche planifiée à l’avance, cliquez sur le bouton Arrêter .
- Après avoir sélectionné la tâche à abandonner, cliquez sur le bouton Modifier la tâche .
- Cliquez sur le bouton Annuler la tâche . Confirmez que la tâche a été supprimée sur l’écran suivant.
5. Vérifiez les images des cellules
- Chaque tâche comprend des observations microscopiques (prise de photos) avant et après le travail de la tâche. Observez la progression de la culture cellulaire par photographie en incorporant une tâche de photographie microscopique avant ou après chaque tâche.
- Sélectionnez des programmes de tâches prédéfinis, y compris la sélection à l’avance de plusieurs emplacements spécifiques de la parabole ou de la plaque de puits pour une observation en point fixe afin de surveiller le même emplacement au fil du temps.
6. Passaging et différenciation
- Suivez les étapes des sections 1 à 5 et configurez le système de culture cellulaire automatisé pour effectuer le passage et la différenciation. Les paramètres de l’instrument pour le passage, la différenciation des cardiomyocytes, la différenciation des hépatocytes, la différenciation des cellules précurseurs neurales et la différenciation des kératinocytes sont indiqués dans les tableaux 1, 2, 3, 4 et 5, respectivement.
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Representative Results
Maintien des cellules souches pluripotentes induites par l’homme
Nous avons utilisé trois lignées hPSC (RIKEN-2F, 253G1 et KMUR001). Nous avons optimisé le protocole de maintenance grâce à des expériences manuelles quotidiennes et optimisé davantage les programmes détaillés grâce aux sept expériences préliminaires effectuées par le système. Par exemple, les contraintes de cisaillement causées par les vitesses de liquide de l’écoulement de la broche provenant de différentes pipettes manipulées par l’homme et le système sont très différentes ; Par conséquent, nous avons optimisé la durée de la digestion enzymatique et le nombre de pipetages pour la dispersion cellulaire par le système.
Des cellules souches pluripotentes induites humaines ont été maintenues sur une boîte de 10 cm recouverte d’une matrice de culture cellulaire de 0,5 μg/cm2 avec un milieu de culture hiPSC (p. ex., Neutristem ou StemFit AK02N). Pour le passage, le système a été programmé pour laver l’hiPSC trois fois avec 5 mL de solution saline tampon phosphate sans calcium (PBS[-]), puis traiter avec 3 mL d’enzyme TrypLE express complétée par 10 μM de l’inhibiteur de la kinase Rho (Y-27632) pendant 15 min à 37 °C. Après cela, le système a ajouté 9 mL de PBS(-) avec 0,15 % d’albumine sérique bovine fraction V (BSA) à la plaque et a effectué deux séries de mouvements qui ont aspiré 10 mL de liquide contenant des cellules et distribué le liquide de l’embout de la pipette dans un mouvement en zigzag sur le dessus de la plaque, qui a été inclinée de 20° plus près de la surface de la plaque. et répété la séquence d’opérations ci-dessus avec la plaque inclinée à 20° du côté opposé. Ensuite, le système a recueilli le milieu contenant les cellules dans un tube de 15 ml et l’a bouché, après quoi il a été centrifugé à 115 x g pendant 5 minutes pour déposer les cellules. Par la suite, le système a aspiré le surnageant et dispersé la pastille cellulaire en cellules individuelles à l’aide de 10 mL de milieu de culture avec 10 μM Y-27632 par pipetage 10 fois. Le système a transféré 1 mL de solution de bleu de trypan dans un nouveau tube de 15 mL, puis a ajouté 1 mL de la suspension cellulaire et les a mélangés par pipetage cinq fois. Après cela, 100 μL de la solution cellulaire colorée au bleu de trypan ont été aspirés et distribués dans la fenêtre d’entrée de l’hémocytomètre jetable dans le support. Le système a déplacé le support de l’hémocytomètre vers la zone d’observation microscopique et a capturé une photo, qui a été immédiatement analysée par logiciel, et la concentration cellulaire obtenue a été appliquée à l’étape suivante. Pour la maintenance des cellules iPSC, le système a ensemencé les cellules à une densité cellulaire de 15 000 cellules/cm2 dans de nouvelles plaques en plastique de 10 cm de diamètre recouvertes d’une matrice de culture cellulaire de 0,5 μg/cm2 . Pour les expériences de différenciation, le système a ensemencé les cellules à la densité cellulaire requise dans le milieu préparé pour chaque type de cellules somatiques dans des plaques à 6 puits recouvertes d’une matrice de culture cellulaire diluée à 1/100. Enfin, le système a effectué cinq verrouillages croisés avant de transférer les plaques dans l’incubateur. Trois nouvelles plaques de 10 cm contenant des cellules iPS et trois plaques pré-enrobées de matrice de culture cellulaire ont été chargées dans le système, et d’autres éléments nécessaires ont également été préparés selon les procédures respectives mentionnées ci-dessus. Un cycle de culture d’entretien consiste en une tâche de passage le jour 1 suivie d’un changement de milieu de culture une fois par jour pendant 3 jours. Tout au long de l’expérience, ce cycle a été mis en place pour cinq cycles. De plus, les consommables ont été réapprovisionnés à leur tour.
Selon le calendrier commandé, cinq cycles de culture de maintenance ont été exécutés avec succès comme prévu par le système. À partir des photographies de cellules prises automatiquement au cours de chaque tâche, il a été confirmé que les cellules proliféraient en douceur au fil du temps. La dilatation de la cellule (n = 3) a été calculée et illustrée à la figure 2. Pour confirmer si l’état indifférencié des CSPi reste inchangé même après la culture d’entretien dans le système de culture automatisé, une analyse immunocytométrique (Oct3/4 et SSEA4) a été effectuée en utilisant les échantillons restants à chaque passage (Figure 3A). De plus, après cinq cycles, les trois boîtes ont été déchargées du système, et des analyses immunohistochimiques (Oct3/4, SSEA4 et Tra1-81) ont également été effectuées (Figure 3B). Les deux analyses utilisant l’immunomarquage fluorescent ont montré que l’état indifférencié des cellules iPS était préservé. Le caryotype des cellules iPS a également été effectué avant et après la culture d’entretien dans un système de culture automatisé. Bien qu’une anomalie ait été observée dans un allèle du chromosome 17 avant le début de la culture d’entretien, aucun changement particulier n’a été observé par le système après 5 cultures d’entretien, y compris l’anomalie (Figure 3C). Les paramètres utilisés pour l’entretien des cellules iPS sont résumés dans le tableau 1.
Différenciation
Cardiomyocytes
Le protocole de différenciation d’une publication précédente a été suivi ici10. Le système a ensemencé des hiPSC indifférenciés (KMUR001) à une densité de 30 000 cellules/cm2 sur des plaques à 6 puits revêtues d’une matrice de culture cellulaire dans un milieu de culture hiPSC complété par 10 μM de Y-27632. Le système a changé le milieu en milieu de cellules souches pluripotentes humaines avec 6 μM de l’inhibiteur de GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL d’activine A et 10 ng/mL de BMP4 après 3 jours (jour de différenciation 1). Au jour 3 de la différenciation, le système est passé au milieu CDM3 : RPMI 1640, 500 μg/mL d’albumine humaine recombinante et 213 μg/mL d’acide L-ascorbique 2-phosphate avec 2 μM Wnt-C59. Le jour 5 de la différenciation, le système est passé à un milieu CDM3 frais ; par la suite, il a répété le passage à un milieu CDM3 frais tous les deux jours. Les paramètres utilisés pour la différenciation cardiomyocytaire des cellules iPS sont résumés dans le tableau 2.
Hépatocytes
Le protocole de différenciation d’une publication précédente a été suivi ici11. Le système a ensemencé des hiPSC indifférenciés (RIKEN2F) à une densité de 25 000 cellules/cm2 sur des plaques à 6 puits revêtues d’une matrice de culture cellulaire dans un milieu de culture hiPSC complété par 10 μM de Y-27632. Après 2 jours (jour de différenciation 1), le système a changé le milieu pour RPMI-1640 plus 2 % de B27 moins d’insuline (RPMI-B27) contenant 100 ng/mL d’activine A, 6 μM CHIR-99021 et 1 % de supplément de glutamine (par exemple, GlutaMAX) pendant 24 h. Le jour 2 de la différenciation, nous avons changé le milieu en RPMI-B27 avec 50 ng/mL d’activine A. Au jour 5 de la différenciation, le système a changé le milieu en RPMI-B27, contenant un supplément de glutamine à 1 % et 10 ng/mL de BMP-4. Au jour 9 de la différenciation, le système a remplacé le milieu par un milieu de maturation hépatocytaire : milieu L-15 de Leibovitz contenant 8,3 % de bouillon de phosphate de tryptose, 10 μM d’hydrocortisone 21-hémisuccinate, 50 μg/mL de L-ascorbate de sodium, 100 nM de dexaméthasone, 0,58 % d’insuline-transferrine-sélénium, 2 mM de supplément de glutamine, 8,3 % de sérum de veau fœtal et 100 nM de rac-1,2-dihexadécylglycérol. Par la suite, le système a répété le changement de milieu pour un milieu frais tous les deux jours. Les paramètres utilisés pour la différenciation des cellules iPS par les hépatocytes sont résumés dans le tableau 3.
Cellules précurseurs neuronales
Le protocole de différenciation d’une publication précédente a été suivi ici12. Le système a ensemencé des hiPSC indifférenciées (RIKEN2F) à une densité de 25 000 cellules/cm2 sur des plaques à 6 puits revêtues d’une matrice de membrane basale dans le milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 et le milieu neurobasal (1 :1) de Dulbecco, complétés par 10 % de remplacement sérique Knockout, 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de supplément de glutamine avec 10 μM d’inhibiteur du récepteur TGF-bêta (SB431542), 10 μM d’inhibiteur du signal BMP (dorsomorphine), et 10 μM Y-27632 (jour de différenciation 1). Au jour 5 de la différenciation, le système a changé le milieu en DMEM/F12 et milieu neurobasal 1 :1 complété par 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de supplément de glutamine, 1 % de supplément de N-2, 1 % de supplément de B-27, 50 μg/mL d’acide ascorbique 2-phosphate, 10 μM de SB431542 et 10 μM de dorsomorphine. Au jour 9 de la différenciation, le système a changé le milieu en DMEM/F12 et milieu neurobasal 1 :1 complété par 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de supplément de glutamine, 1 % de supplément de N-2, 1 % de supplément de B-27, 50 μg/mL d’acide ascorbique 2-phosphate et 1 μM d’acide rétinoïque tout-trans. Du 13e au 16e jour de différenciation, le système a changé de milieu tous les jours avec du DMEM/F12 et du milieu neurobasal 1 :1 complété par 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de glutamine, 1 % de N-2, 1 % de B-27, 50 μg/mL d’acide ascorbique 2-phosphate, 10 ng/mL de bFGF et 10 ng/mL d’EGF. Les paramètres utilisés pour la différenciation des cellules précurseurs neurales des cellules iPS sont résumés dans le tableau 4.
Kératinocytes
Le protocole de différenciation d’une publication précédente a été suivi ici13. Le système a ensemencé des hiPSC indifférenciées (253G1) à une densité de 15 000 cellules/cm2 dans des plaques à 6 puits revêtues d’une matrice de culture cellulaire dans un milieu de culture hiPSC avec 10 μM Y-27632. Après 2 jours plus tard (jour de différenciation 1), le système a changé le milieu pour le milieu Eagle modifié (DMEM)/F12 et le milieu neurobasal (1 :1) de Dulbecco avec 0,1 mM d’acides aminés non essentiels, 1 mM de glutamine, 55 μM de 2-mercaptoéthanol, 1 % de supplément de N-2, 2 % de supplément de B-27, 50 μg/mL d’acide ascorbique 2-phosphate, 0,05 % d’albumine sérique bovine et 100 ng/mL de FGF-basique. Au jour 3 de la différenciation, et par la suite, le milieu a été remplacé par un milieu kératinocytaire humain (sans supplément pour le jour 3 et avec un supplément le jour 5 ou après) avec l’ajout de 0,5 μg/mL d’hydrocortisone, 1 μM d’acide rétinoïque tout-trans, 25 ng/mL de hBMP-4, 2,4 μg/mL d’adénine, 1,37 ng/mL de triiodothyronine, 0,3 mM d’acide ascorbique 2-phosphate, et 2 μM de forskoline, tous les 2 jours par le système. Les paramètres utilisés pour la différenciation des cellules iPS par les kératinocytes sont résumés dans le tableau 5.
Comme mentionné ci-dessus, l’ensemble du processus a été réalisé en utilisant uniquement des équipements de culture automatisés, de l’ensemencement des cellules iPS à la série ultérieure de protocoles de différenciation. L’expression des marqueurs caractéristiques dans chaque cellule a été évaluée (Figure 4). Il a été démontré que la différenciation pouvait être induite en utilisant uniquement un système de culture automatisé.
Figure 1 : Récapitulatif du système de culture automatisé. (A) Image du système montrant la taille et la disposition croquis 1. (B) Photo de l’établi et croquis de mise en page 2. (C) Outils à main : boîte, tube et pipette. Ce chiffre a été modifié avec l’autorisation de Bando et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Tâche de passage et croissance cellulaire. (A) Le carré illustre chaque processus. (B) Expansion des cellules iPS calculée à l’aide de chaque comptage cellulaire automatisé dans les trois expériences indépendantes. (C) Images représentatives capturées automatiquement d’un passage à l’autre. Barres d’échelle = 400 μm et 100 μm (médaillon). Ce chiffre a été modifié avec l’autorisation de Bando et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Maintenance automatisée à long terme de l’iPSC. (A) Toutes les analyses immunocytométoriques des trois expériences indépendantes pour Oct-3/4 et SSEA-4. Chaque histogramme bleu indique qu’il n’y a pas de contrôle primaire des anticorps. Chaque histogramme rouge représente le signal spécifique à l’antigène indiqué. (B) Images représentatives de cellules colorées immunohistochimiquement pour Oct-3/4, SSEA-4 et Tra 1-81. Barres d’échelle = 50 μm. (C) Caryotype de la RIKEN2F-iPSC après le cinquième passage. Ce chiffre a été modifié avec l’autorisation de Bando et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coloration immunohistochimique. Tableaux immunohistochimiques des hépatocytes (barres d’échelle = 100 μm), des cardiomyocytes (barres d’échelle = 100 μm), des cellules progénitrices neuronales (barres d’échelle = 100 μm) et des kératinocytes (barres d’échelle = 200 μm). Ce chiffre a été modifié avec l’autorisation de Bando et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Préparatifs du passage et réglages du système. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Préparations pour la différenciation des cardiomyocytes et réglages du système. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Préparations pour la différenciation des hépatocytes et réglages du système. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Préparations pour la différenciation des cellules précurseurs neuronales et paramètres du système. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 5 : Préparations de différenciation des kératinocytes et réglages du système. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Une étape critique du protocole est que si un utilisateur trouve des défauts, cliquez sur le bouton d’annulation, d’arrêt ou de réinitialisation à tout moment et recommencez à partir de la première étape. Le logiciel peut éviter les erreurs humaines, y compris la double réservation, l’ouverture des portes pendant que les tâches du système sont actives et le manque de réapprovisionnement. Un autre point critique pour une différenciation réussie et efficace en la cellule somatique souhaitée est la sélection correcte des lignées de cellules souches pluripotentes, car chaque cellule souche pluripotente présente un biais incontrôlable dans ses propriétés de différenciation14,15.
Ce système de culture automatisé de cellules souches pluripotentes induites peut les maintenir et les différencier en différents types de cellules somatiques. Les dimensions de ce système sont de 200 cm (largeur), 110 cm (profondeur) et 233 cm (hauteur), pour un poids total de 1,2 tonne. L’incubateur intégré à l’appareil peut contenir simultanément trente-six boîtes de 10 cm et neuf plaques multipuits.
Les améliorations par rapport aux modèles précédents sont les suivantes : tout d’abord, en tant que bras de manutention, le système de rail des axes X-Y-Z a été récemment converti à partir d’un bras articulé à 6 axes, qui fonctionne en changeant l’outil de pointe du bras en trois parties différentes pour les boîtes, les tubes et les pipettes. Le bras est suspendu au plafond du système et se déplace le long de l’axe X-Y-Z. Deuxièmement, un système de comptage cellulaire a été introduit pour les cultures d’entretien sans alimentateur et les protocoles d’induction de différenciation qui sont effectués en continu à partir du passage. Après avoir mélangé la solution de suspension unicellulaire avec la solution de bleu de trypan, elle a été transférée dans un hémocytomètre jetable pour l’observation microscopique et l’imagerie. Le logiciel analyse automatiquement l’image obtenue pour compter le nombre de cellules vivantes et calculer le volume nécessaire pour ensemencer le nombre requis de cellules. La précision du comptage cellulaire obtenue par cette analyse d’image était conforme à celle obtenue manuellement.
Le système de rails des axes X-Y-Z a été appliqué pour gérer chaque tâche plus rapidement que la version précédente (bras articulé multi-axes). Avec ce système de culture automatisé, cinq passages continus ont été effectués pendant 16 jours, et les cellules iPS ont été étendues de 625 ± 93 fois. Bien que la preuve de l’endurance pour le temps de maintien des cellules sans cellules nourricières ait été plus courte que notre démonstration précédente avec des cellules nourricières, l’expansion cellulaire était plus efficace par rapport à la démonstration précédente6. Le temps de travail raccourci semblait contribuer à empêcher les dommages cellulaires de sécher pendant les tâches.
De plus, les tâches de différenciation de la culture d’entretien à la différenciation en cardiomyocytes, hépatocytes, cellules précurseurs neuronales et kératinocytes ont été effectuées sans intervention humaine. Après une série de ces cours, il a été confirmé par immunomarquage par fluorescence que les cellules obtenues dans le système de culture automatisé seul s’étaient différenciées en cellules souhaitées. Par conséquent, en partageant un programme de tâches et en utilisant ce système, les chercheurs qui ne sont pas familiers avec la gestion des cellules iPS peuvent obtenir des cellules somatiques dérivées de cellules iPSC pour leurs propres recherches. De plus, les différences de reproductibilité entre les chercheurs ou les installations pourraient être éliminées autant que possible, et cela pourrait garantir l’obtention de cellules de qualité homogène à chaque fois.
En adoptant un nouveau système de rails, l’équipement a pu être réduit à 1,2 tonne, soit ~200 kg de moins qu’auparavant. De plus, les coûts liés aux pièces et à l’établissement des programmes pourraient être réduits d’environ 10 000 dollars américains. Les coûts de maintenance et de programmation devraient diminuer de 13 %. Afin de motiver davantage de chercheurs à se lancer facilement dans la recherche sur les cellules iPS, il est également important de maintenir les coûts d’équipement à un faible niveau6. Nous espérons que les systèmes de culture automatique actuels et de prochaine génération contribueront à fournir des cellules différenciées dérivées d’iPS et des cellules dérivées d’iPSC de qualité plus uniforme.
Les principales limites de ce système sont la capacité limitée du réfrigérateur pour le stockage provisoire des cultures et sa faiblesse à traiter de petites quantités (<100 μL) de liquide. De plus, l’absence d’intelligence artificielle sophistiquée désactive l’optimisation automatique en fonction de l’état de la cellule à l’heure. La limitation mineure est l’exigence d’embouts de pipette spéciaux fournis par les fabricants du système 4,5. Nous développons la prochaine génération de systèmes de culture qui seront capables de traiter de petites quantités de liquide pour les préparations de milieu et qui comprendront un système d’optimisation de la rétroaction basé sur une intelligence artificielle performante (apprentissage du système). Notre fabricant collaborateur9 dispose d’un savoir-faire suffisant pour construire des systèmes sur mesure en fonction des besoins particuliers des utilisateurs. En plus de cela, des systèmes de nouvelle génération équipés de fonctions plus générales et plus larges seront bientôt sur le marché. Nous envisageons également un système de location par abonnement pour fournir des systèmes à jour à tous les utilisateurs.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par une subvention du New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
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