Summary
Her præsenterer vi en protokol til et automatiseret cellekultursystem. Dette automatiserede dyrkningssystem reducerer arbejdskraft og gavner brugerne, herunder forskere, der ikke er bekendt med håndtering af inducerede pluripotente stamceller (iPS), fra vedligeholdelse af iPS-celler til differentiering i forskellige typer celler.
Abstract
Humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) med uendelig selvprolifererende evne forventes at have anvendelser på mange områder, herunder belysning af sjældne sygdomspatologier, udvikling af nye lægemidler og regenerativ medicin, der sigter mod at genoprette beskadigede organer. På trods af dette er den sociale implementering af hiPSC'er stadig begrænset. Dette skyldes til dels, at det er vanskeligt at reproducere differentiering i kultur, selv med avanceret viden og sofistikerede tekniske færdigheder, på grund af iPSC'ernes store følsomhed over for små miljøændringer. Anvendelsen af et automatiseret kultursystem kan løse dette problem. Eksperimenter med høj reproducerbarhed uafhængig af en forskers færdigheder kan forventes i henhold til en fælles procedure på tværs af forskellige institutter. Selvom der tidligere er udviklet flere automatiserede kultursystemer, der kan opretholde iPSC-kulturer og fremkalde differentiering, er disse systemer tunge, store og dyre, fordi de gør brug af humaniserede, multiartikulerede robotarme. For at forbedre ovenstående problemer udviklede vi et nyt system ved hjælp af et simpelt x-y-z-akseglideskinnesystem, så det kunne være mere kompakt, lettere og billigere. Desuden kan brugeren nemt ændre parametre i det nye system for at udvikle nye håndteringsopgaver. Når en opgave er etableret, skal brugeren blot forberede iPSC, på forhånd levere de reagenser og forbrugsstoffer, der er nødvendige for den ønskede opgave, vælge opgavenummeret og angive tidspunktet. Vi bekræftede, at systemet kunne opretholde iPSC'er i en udifferentieret tilstand gennem flere passager uden fødeceller og differentiere sig til forskellige celletyper, herunder kardiomyocytter, hepatocytter, neurale forfædre og keratinocytter. Systemet vil muliggøre meget reproducerbare eksperimenter på tværs af institutioner uden behov for kvalificerede forskere og vil lette den sociale implementering af hiPSC'er på en bredere vifte af forskningsområder ved at mindske hindringerne for nye indgange.
Introduction
Denne artikel har til formål at give faktiske og detaljerede håndteringsprocedurer for et automatiseret dyrkningssystem for humant inducerede pluripotente stamceller (iPSC), som vi producerede i samarbejde med et firma, og at vise repræsentative resultater.
Siden offentliggørelsen af artiklen i 2007 har iPSC tiltrukket sig opmærksomhed over hele verden1. På grund af dets største træk ved at kunne differentiere sig til enhver form for somatisk celle forventes det at blive anvendt på forskellige områder såsom regenerativ medicin, belysning af årsagerne til uhåndterlige sygdomme og udvikling af nye terapeutiske lægemidler 2,3. Desuden kan anvendelse af humane somatiske celler afledt af iPSC reducere dyreforsøg, som er underlagt betydelige etiske restriktioner. Selvom mange homogene iPSC'er konstant kræves for at undersøge nye metoder med iPSC'er, er det for besværligt at administrere dem. Desuden er håndtering af iPSC vanskelig på grund af dens høje følsomhed, selv over for subtile kulturelle og miljømæssige ændringer.
For at løse dette problem forventes automatiserede kultursystemer at udføre opgaver i stedet for mennesker. Nogle grupper har udviklet nogle få automatiserede humane pluripotente stamcellekultursystemer til cellevedligeholdelse og differentiering og offentliggjort deres resultater 4,5,6. Disse systemer udstyrer multiartikulerede robotarme. Robotarme har ikke kun fortjeneste, fordi de i høj grad efterligner menneskelige armbevægelser, men også ulemper, idet de kræver højere omkostninger til armen (e), større og tungere systememballage og tidskrævende uddannelsesindsats fra ingeniørerne for at opnå de målrettede bevægelser 7,8. For at gøre det lettere at introducere apparatet til flere forskningsfaciliteter på steder med økonomisk, rum- og menneskeressourceforbrug har vi udviklet et nyt automatiseret kultursystem til vedligeholdelse og differentiering af iPSC i forskellige celletyper9.
Vores begrundelse for det nye system var at vedtage et X-Y-Z-akseskinnesystem i stedet for multiartikulerede robotarme9. For at erstatte robotarmenes komplekse håndlignende funktioner anvendte vi en ny idé på dette system, som automatisk kan ændre tre typer specifikke funktionelle armspidser. Her angiver vi også, hvordan brugere nemt kan lave opgaveplaner med enkle ordrer på software på grund af manglende krav til ingeniørers bidrag gennem hele processen.
Et af robotkultursystemerne har demonstreret fremstillingen af embryoide kroppe ved hjælp af 96-brøndplader som 3D-celleaggregater til differentiering4. Det her rapporterede system kan ikke håndtere plader med 96 brønde. Man opnåede den nuværende gode fremstillingspraksis (cGMP) kvalitet ved hjælp af en cellelinje, selv om det ikke var en human pluripotent stamcelle5. Det automatiserede dyrkningssystem, der er beskrevet her, er nu udviklet med det specifikke formål at hjælpe laboratorieforsøg (figur 1). Det har dog nok systemer til at holde rene niveauer svarende til et niveau IV sikkerhedsskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske komité for Kansai Medical University godkendte generering og brug af de sunde frivilligt afledte iPSC'er ved navn KMUR001 (godkendelse nr. 2020197). Donoren, som blev åbent rekrutteret, gav formelt informeret samtykke og var enig i den videnskabelige brug af cellerne.
BEMÆRK: Den aktuelle grænseflade (den specielle software kaldet "ccssHMI", der kører under Windows XP-operativsystemet) er den grundlæggende betjeningsskærm. Under den førnævnte grænseflade arrangeres en række faner, der giver brugerne mulighed for at starte forskellige operationer.
1. Indlæsning
- Klik på knappen Indlæser på softwarens øverste skærm. Klik på knappen Start af indlæsningsforberedelse .
- Den eller de skåle eller tallerkener, der skal føres ind i apparatet, anbringes på plads i apparatet.
BEMÆRK: Nødvendige oplysninger til parabolidentifikation skal skrives på hvert låg. - Luk det forreste skydevindue manuelt, og tryk på knappen til mekanisk sikkerhedsbekræftelse.
- Vælg type og mængde af skål(e) eller tallerken(er) i softwaren.
- Klik på knappen Indlæsningsforberedelse fuldført . Klik på knappen Indlæser start .
- Når en parabol er uploadet til systemet, skal du vælge oplysningerne på skålen, f.eks. med iPS-celler eller uden iPS-celler, i softwaren. Registrer noter om hver skål i softwaren.
- Klik på knappen Registrering i slutningen for at fuldføre indlæsningen.
2. Aflæsning
- Klik på knappen Fjern på softwarens øverste skærm. Vælg den eller de skåle, der skal fjernes i softwaren.
- Når du har valgt skålen / skålene, skal du klikke på knappen Start til losning af forberedelse . Klik på knappen Aflæsning af start .
- Når skålen/skålene er blevet overført fra inkubatoren til arbejdsbordet i systemet, skal du trykke på knappen Fjernelse af opvaskemaskine .
- Åbn det forreste skydevindue manuelt, og tag fadet (fadene) ud. Luk det forreste skydevindue manuelt, og tryk på knappen til mekanisk sikkerhedsbekræftelse.
3. Supplement af forbrugsvarer: pipetter, rør og medium
- For at genopfylde forbrugsstoffer som pipetter, rør og medium skal du klikke på knappen Forbrugsstoffer på softwarens øverste skærm og derefter vælge det element, der skal genopfyldes.
- Pipetter
- Klik på knappen Pipette . Vælg knappen Genopfyld .
- Vælg et rack, som brugeren ønsker at genopfylde på softwaren. Klik på knappen Genopfyld start .
- Når du har bekræftet, at låget på pipetteopbevaringsområdet på arbejdsbordet er åbnet, skal du manuelt åbne det forreste skydevindue og genopfylde pipetterne efter behov.
- Luk det forreste skydevindue manuelt, og tryk på knappen til mekanisk sikkerhedsbekræftelse. Klik på knappen Genopfyld fuldført .
- Klik på knappen Opfyldningsopsætning , indtast oplysningerne om genopfyldningen, og klik derefter på knappen Registrering .
- Klik på knappen Genopfyld fuldført .
- Rør
- Klik på knappen Tube . Vælg knappen Genopfyld .
- Vælg et rack, som brugeren ønsker at genopfylde på softwaren. Klik på knappen Genopfyld start .
- Når du har bekræftet, at stativet er flyttet til toppen, skal du klikke på knappen Genopfyld rør .
- Åbn det forreste skydevindue manuelt, og genopfyld rørene efter behov.
- Luk det forreste skydevindue manuelt, og tryk på knappen til mekanisk sikkerhedsbekræftelse.
- Klik på knappen Genopfyld fuldført .
- Klik på knappen Opfyldningsopsætning , indtast oplysningerne om genopfyldningen, og klik derefter på knappen Registrering . Klik på knappen Luk .
- Medium
- Klik på knappen Mellem . Vælg knappen Genopfyld i softwaren.
- Vælg et rack blandt tre, som brugerne vil genopbygge. Klik på knappen Genopfyld start .
- Når du har bekræftet, at låget på det mellemstore opbevaringsområde er åbnet, skal du manuelt åbne det forreste skydevindue og genopfylde mediet.
- Luk det forreste skydevindue manuelt, og tryk på knappen til mekanisk sikkerhedsbekræftelse.
- Klik på knappen Genopfyld fuldført .
- Klik på knappen Genopfyld , og indtast oplysningerne for mediet, herunder mediets navn og mængde. Indtast yderligere kommentarer, hvis det er nødvendigt.
- Klik på knappen Registrering .
- Klik på knappen Luk .
- Pipetter
4. Valg af opgave
- Klik på knappen Task på softwarens øverste skærm.
- Vælg knappen Opgaveindstilling . Vælg den ønskede opgave fra opgavelisten, og klik på knappen Næste trin .
- Angiv dato og klokkeslæt for udførelsen af opgaven, og klik derefter på knappen Registrering . Vælg en tallerken eller tallerken for at udføre opgaven, og klik derefter på knappen Registrering .
- Når du har bekræftet den valgte opgave igen, skal du klikke på knappen Registrering . Bekræft, at opgaven er registreret på det næste skærmbillede.
- Indstil om nødvendigt den næste opgave på samme måde.
- Klik på Start-knappen i slutningen. Derefter starter opgaven automatisk på den angivne dato og klokkeslæt.
BEMÆRK: Umiddelbart efter afslutningen af hver opgave tændes UV-lys (placeret på to sider af emhætten) automatisk, og efter 5-30 minutter slukkes de i overensstemmelse med hjælpeindstillingen for at holde emhætten i aseptisk tilstand. For at stoppe kan brugerne klikke på knappen Start . - Hvis brugerne vil annullere en planlagt opgave på forhånd, skal du klikke på knappen Stop .
- Når du har valgt den opgave, der skal afbrydes, skal du klikke på knappen Rediger opgave .
- Klik på knappen Annuller opgave . Bekræft, at opgaven er blevet slettet på det næste skærmbillede.
5. Tjek cellebilleder
- Hver opgave omfatter mikroskopiske observationer (fotografering) før og efter opgavearbejdet. Overhold udviklingen i cellekultur fotografisk ved at inkorporere en mikroskopisk fotograferingsopgave før eller efter hver opgave.
- Vælg forudindstillede opgaveprogrammer, herunder valg af flere specifikke placeringer af skålen eller brøndpladen på forhånd til fastpunktsobservation for at overvåge den samme placering over tid.
6. Passaging og differentiering
- Følg trinene i afsnit 1-5, og indstil det automatiserede cellekultursystem til at udføre passaging og differentiering. Instrumentindstillingerne for passaging, kardiomyocytdifferentiering, hepatocytdifferentiering, neural forløbercelledifferentiering og keratinocytdifferentiering er vist i henholdsvis tabel 1, tabel 2, tabel 3, tabel 4 og tabel 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vedligeholdelse af menneskeskabte pluripotente stamceller
Vi brugte tre hPSC-linjer (RIKEN-2F, 253G1 og KMUR001). Vi har optimeret vedligeholdelsesprotokollen gennem daglige manuelt udførte eksperimenter og yderligere optimeret de detaljerede programmer gennem de syv indledende eksperimenter, der udføres af systemet. For eksempel er forskydningsspændinger forårsaget af spytstrømmens væskehastigheder fra forskellige pipets, der håndteres af mennesker og systemet, helt forskellige; Derfor optimerede vi tidslængden af den enzymatiske fordøjelse og antallet af pipetter til celledispersion af systemet.
Human inducerede pluripotente stamceller blev opretholdt på en 10 cm skål belagt med 0,5 μg/cm2 cellekulturmatrix med hiPSC kulturmedium (f.eks. Neutristem eller StemFit AK02N). Til passage blev systemet programmeret til at vaske hiPSC tre gange med 5 ml fosfatbuffersaltvand uden calcium (PBS[-]) og derefter behandle med 3 ml TrypLE express-enzym suppleret med 10 μM af Rho-kinasehæmmeren (Y-27632) i 15 minutter ved 37 °C. Derefter tilføjede systemet 9 ml PBS (-) med 0,15% bovin serumalbuminfraktion V (BSA) til pladen og udførte to sæt bevægelser, der sugede 10 ml celleholdig væske og dispenserede væsken fra pipettespidsen i en zig-zag-bevægelse over toppen af pladen, som blev vippet 20 ° tættere på pladeoverfladen, og gentog ovennævnte sekvens af operationer med pladen vippet 20° på den modsatte side. Derefter opsamlede systemet det celleholdige medium i et 15 ml rør og lukkede det, hvorefter det blev centrifugeret ved 115 x g i 5 minutter for at deponere cellerne. Derefter opsugede systemet supernatanten og dispergerede cellepelleten i enkeltceller ved hjælp af 10 ml dyrkningsmedium med 10 μM Y-27632 ved pipettering 10 gange. Systemet overførte 1 ml trypanblå opløsning til et nyt 15 ml rør, tilsatte derefter 1 ml af cellesuspensionen og blandede dem ved pipettering fem gange. Derefter blev 100 μL af Trypan blåfarvet celleopløsning opsuget og dispenseret i indløbsvinduet på engangshemocytometeret i holderen. Systemet flyttede hæmocytometerholderen til det mikroskopiske observationsområde og fangede et foto, som straks blev analyseret af software, og den opnåede cellekoncentration blev påført til næste trin. Til iPSC-vedligeholdelse podede systemet cellerne med en celletæthed på 15.000 celler/cm2 i nye plastplader med en diameter på 10 cm belagt med 0,5 μg/cm2-cellekulturmatrix . Til differentieringseksperimenter podede systemet cellerne ved den krævede celletæthed i mediet fremstillet for hver somatisk celletype i 6-brøndplader belagt med en cellekulturmatrix fortyndet til 1/100. Endelig udførte systemet krydslåsning fem gange, før pladerne blev overført til inkubatoren. Tre nye 10 cm plader indeholdende iPSC'er og tre cellekulturmatrix-præcoatede plader blev indlæst i systemet, og andre nødvendige emner blev også forberedt i henhold til de respektive procedurer, der er nævnt ovenfor. En cyklus af vedligeholdelseskultur består af en passaging opgave på dag 1 efterfulgt af en kultur medium ændring en gang om dagen i 3 dage. Gennem hele eksperimentet blev denne cyklus sat op til fem cyklusser. Derudover blev forbrugsstoffer genopfyldt igen.
I henhold til den bestilte tidsplan blev fem cyklusser med vedligeholdelseskultur udført med succes som planlagt af systemet. Fra cellefotografierne taget automatisk under hver opgave blev det bekræftet, at cellerne spredte sig jævnt over tid. Celleudvidelsen (n = 3) blev beregnet og vist i figur 2. For at bekræfte, om den udifferentierede tilstand af iPSC'er forbliver uændret, selv efter vedligeholdelseskultur i det automatiserede dyrkningssystem, blev immunocytometrisk analyse (Oct3/4 og SSEA4) udført ved anvendelse af de resterende prøver ved hver passage (figur 3A). Desuden blev de tre skåle efter fem cyklusser losset fra systemet, og immunohistokemisk analyse (Oct3/4, SSEA4 og Tra1-81) blev også udført (figur 3B). Begge analyser ved hjælp af fluorescerende immunfarvning viste, at den udifferentierede tilstand af iPS-celler blev bevaret. Karyotypning af iPSC'er blev også udført før og efter vedligeholdelseskultur i et automatiseret kultursystem. Selvom der blev observeret en abnormitet i en allel af kromosom 17 før starten af vedligeholdelseskulturen, blev der ikke observeret nogen særlig ændring af systemet efter 5 vedligeholdelseskulturer, inklusive abnormiteten (figur 3C). De indstillinger, der anvendes til vedligeholdelse af iPSC'er, er opsummeret i tabel 1.
Differentiering
Kardiomyocytter
Differentieringsprotokollen fra en tidligere publikation blev fulgt her10. Systemet såede udifferentierede hiPSC'er (KMUR001) med en densitet på 30.000 celler/cm2 på cellekulturmatrixbelagte 6-brøndsplader i hiPSC-dyrkningsmedium suppleret med 10 μM Y-27632. Systemet ændrede mediet til humant pluripotent stamcellemedium med 6 μM af GSK-3ß-hæmmeren CHIR-99021, 20 ng/ml Activin A og 10 ng/ml BMP4 efter 3 dage (differentieringsdag 1). På differentieringsdag 3 skiftede systemet til CDM3-medium: RPMI 1640, 500 μg/ml rekombinant humant albumin og 213 μg/ml L-ascorbinsyre 2-phosphat med 2 μM Wnt-C59. På differentieringsdag 5 skiftede systemet til frisk CDM3-medium; derefter gentog det at skifte til frisk CDM3-medium hver anden dag. De indstillinger, der anvendes til kardiomyocytdifferentiering af iPSC'er, er opsummeret i tabel 2.
Hepatocytter
Differentieringsprotokollen fra en tidligere publikation blev fulgt her11. Systemet såede udifferentierede hiPSC'er (RIKEN2F) med en densitet på 25.000 celler/cm2 på cellekulturmatrixbelagte 6-brøndsplader i hiPSC-kulturmedium suppleret med 10 μM Y-27632. Efter 2 dage (differentieringsdag 1) skiftede systemet mediet til RPMI-1640 plus 2% B27 minus insulin (RPMI-B27) indeholdende 100 ng/ml Activin A, 6 μM CHIR-99021 og 1% glutamintilskud (f.eks. GlutaMAX) i 24 timer. På differentieringsdag 2 ændrede vi mediet til RPMI-B27 med 50 ng/ml Activin A. På differentieringsdag 5 ændrede systemet mediet til RPMI-B27, der indeholder 1% glutamintilskud og 10 ng/ml BMP-4. På differentieringsdag 9 ændrede systemet mediet til hepatocytmodningsmedium: Leibovitzs L-15-medium indeholdende 8,3% tryptosephosphatbouillon, 10 μM hydrocortison-21-hemisuccinat, 50 μg / ml natrium-L-ascorbat, 100 nM dexamethason, 0,58% insulin-transferrin-selen, 2 mM glutamintilskud, 8,3% føtalt bovint serum og 100 nM rac-1,2-dihexadecylglycerol. Derefter gentog systemet at skifte mediet til et nyt medium hver anden dag. De indstillinger, der anvendes til hepatocytdifferentiering af iPSC'er, er opsummeret i tabel 3.
Neuronale forløberceller
Differentieringsprotokollen fra en tidligere publikation blev fulgt her12. Systemet såede udifferentierede hiPSC'er (RIKEN2F) med en densitet på 25.000 celler/cm2 på kældermembranmatrixbelagte 6-brøndsplader i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM)/F12 og neurobasale medium (1:1) suppleret med 10% Knockout serum udskiftning, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM glutamin supplement med 10 μM TGF-beta-receptorhæmmer (SB431542), 10 μM BMP signalhæmmer (dorsomorphin), og 10 μM Y-27632 (differentieringsdag 1). På differentieringsdag 5 ændrede systemet mediet til DMEM/F12 og neurobasalmedium 1:1 suppleret med 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskud, 1% N-2 supplement, 1% B-27 supplement, 50 μg/ml ascorbinsyre 2-phosphat, 10 μM SB431542 og 10 μM dorsomorphin. På differentieringsdag 9 ændrede systemet mediet til DMEM/F12 og neurobasalmedium 1:1 suppleret med 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskud, 1% N-2 supplement, 1% B-27 supplement, 50 μg/ml ascorbinsyre 2-phosphat og 1 μM all-trans retinsyre. På differentieringsdag 13-16 skiftede systemet mediet hver dag med DMEM/F12 og neurobasalt medium 1:1 suppleret med 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM glutamintilskud, 1% N-2 supplement, 1% B-27 supplement, 50 μg/ml ascorbinsyre 2-phosphat og 10 ng/ml bFGF og 10 ng/ml EGF. De indstillinger, der anvendes til neurale forløbercelledifferentieringer af iPSC'er, er opsummeret i tabel 4.
Keratinocytter
Differentieringsprotokollen fra en tidligere publikation blev fulgt her13. Systemet såede udifferentierede hiPSC'er (253G1) med en densitet på 15.000 celler/cm2 i cellekulturmatrixbelagte 6-brøndsplader i hiPSC-dyrkningsmedium med 10 μM Y-27632. Efter 2 dage senere (differentieringsdag 1) ændrede systemet mediet til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) / F12 og Neurobasal medium (1: 1) med 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM glutamin, 55 μM 2-mercaptoethanol, 1% N-2 supplement, 2% B-27 supplement, 50 μg / ml ascorbinsyre 2-phosphat, 0,05% bovin serumalbumin og 100 ng / ml FGF-basisk. På differentieringsdag 3 og derefter blev mediet ændret til humant keratinocytmedium (uden supplement til dag 3 og med et supplement på/efter dag 5) med tilsætning af 0,5 μg/ml hydrocortison, 1 μM all-trans retinsyre, 25 ng/ml hBMP-4, 2,4 μg/ml adenin, 1,37 ng/ml triiodothyronin, 0,3 mM ascorbinsyre 2-phosphat, og 2 μM forskolin, hver 2. dag af systemet. De indstillinger, der anvendes til keratinocytdifferentiering af iPSC'er, er opsummeret i tabel 5.
Som nævnt ovenfor blev hele processen udført ved hjælp af kun automatiseret kulturudstyr, fra såning af iPS-celler til den efterfølgende serie differentieringsprotokoller. Ekspressionen af karakteristiske markører i hver celle blev evalueret (figur 4). Det blev vist, at differentiering kun kunne induceres ved hjælp af et automatiseret dyrkningssystem.
Figur 1: Resumé af det automatiserede kultursystem. (A) Billede af systemet, der viser størrelse og layout skitse 1. (B) Billede af arbejdsbordet og layoutskitse 2. C) Håndværktøj: skål, rør og pipette. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Bando et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Passaging opgave og cellevækst. (A) Firkanten illustrerer hver proces. (B) iPSC-udvidelse beregnet ved hjælp af hver automatiseret celletælling i de tre uafhængige eksperimenter. (C) Repræsentative billeder, der optages automatisk fra passage til passage. Skalastænger = 400 μm og 100 μm (indsats). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Bando et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Automatiseret langtidsvedligeholdelse af iPSC. (A) Alle immuncytometoriske analyser af de tre uafhængige eksperimenter for Oct-3/4 og SSEA-4. Hvert blåt histogram indikerer ingen primær antistofkontrol. Hvert rødt histogram repræsenterer det angivne antigenspecifikke signal. (B) Repræsentative billeder af immunhistokemisk farvede celler for Oct-3/4, SSEA-4 og Tra 1-81. Skalastænger = 50 μm. (C) Karyotype af RIKEN2F-iPSC efter den femte passage. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Bando et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunohistokemisk farvning. Immunohistokemiske billeder af hepatocytter (skalastænger = 100 μm), kardiomyocytter (skalastænger = 100 μm), neuronale stamceller (skalastænger = 100 μm) og keratinocytter (skalastænger = 200 μm). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Bando et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Passageforberedelser og systemindstillinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Kardiomyocytdifferentieringspræparater og systemindstillinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Hepatocytdifferentieringspræparater og systemindstillinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Neurale forløbercelledifferentieringspræparater og systemindstillinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 5: Keratinocytdifferentieringspræparater og systemindstillinger. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trin i protokollen er, at hvis en bruger finder fejl, skal du klikke på knappen Annuller, Stop eller Nulstil når som helst og starte forfra fra det første trin. Softwaren kan undgå menneskelige fejl, herunder dobbeltbooking, åbning af døre, mens systemopgaverne er aktive og manglende genopfyldning. Et andet kritisk punkt for vellykket og effektiv differentiering til den ønskede somatiske celle er den korrekte udvælgelse af pluripotente stamcellelinjer, fordi hver pluripotent stamcelle har en ukontrollabel bias i sine differentieringsegenskaber 14,15.
Dette automatiserede dyrkningssystem til inducerede pluripotente stamceller kan opretholde og differentiere dem i forskellige somatiske celletyper. Størrelsen af dette system er 200 cm (bredde), 110 cm (dybde) og 233 cm (højde) med en samlet vægt på 1,2 tons. Inkubatoren indbygget i enheden kan samtidig holde seksogtredive 10 cm skåle og ni multiwellplader.
Forbedringer i forhold til tidligere modeller er, at X-Y-Z-akseskinnesystemet først som en håndteringsarm for nylig blev konverteret fra en 6-akset leddelt arm, der fungerer ved at ændre armens spidsværktøj til tre forskellige dele til skåle, rør og pipetter. Armen er ophængt fra systemets loft og bevæger sig langs X-Y-Z-aksen. For det andet blev der indført et celletællingssystem til føderfri vedligeholdelseskulturer og differentieringsinduktionsprotokoller, der udføres kontinuerligt fra passagen. Efter blanding af enkeltcellesuspensionsopløsningen med trypanblåopløsningen blev den overført til et engangshæmocytometer til mikroskopisk observation og billeddannelse. Softwaren analyserer automatisk det opnåede billede for at tælle antallet af levende celler og beregne det volumen, der kræves for at frø det krævede antal celler. Nøjagtigheden af celletal opnået ved denne billedanalyse var i overensstemmelse med den, der blev opnået manuelt.
X-Y-Z-akseskinnesystemet blev anvendt til at håndtere hver opgave hurtigere end den tidligere version (leddelt arm med flere akser). Med dette automatiserede dyrkningssystem blev fem kontinuerlige passager udført i 16 dage, og iPSC'er blev udvidet 625 ± 93 gange. Selvom beviset for udholdenhed for tidspunktet for cellevedligeholdelse uden fødeceller var kortere end vores tidligere demonstration med fødeceller, var celleudvidelsen mere effektiv sammenlignet med den tidligere demonstration6. Den forkortede opgavetid syntes at bidrage til at forhindre celleskader i at tørre under opgaverne.
Desuden blev differentieringsopgaver fra vedligeholdelseskultur til differentiering i kardiomyocytter, hepatocytter, neuronale forløberceller og keratinocytter udført uden menneskelig indgriben. Efter en række af disse kurser blev det bekræftet ved fluorescensimmunfarvning, at cellerne opnået i det automatiserede dyrkningssystem alene havde differentieret sig til de ønskede celler. Ved at dele et opgaveprogram og bruge dette system kan forskere, der ikke er fortrolige med iPS-cellehåndtering, derfor få iPSC-afledte somatiske celler til deres egen forskning. Desuden kunne forskelle i reproducerbarhed mellem forskere eller faciliteter elimineres så meget som muligt, og det kunne sikre, at celler af homogen kvalitet opnås hver gang.
Ved at vedtage et nyt skinnesystem kunne udstyret reduceres og reduceres i vægt til 1,2 tons, ~ 200 kg lettere end før. Desuden kunne omkostninger til reservedele og programindstilling reduceres med ca. $ 10.000 amerikanske dollars. Vedligeholdelses- og programmeringsomkostningerne blev anslået til at falde med 13%. For at motivere flere forskere til let at gå ind i iPS-cellerelateret forskning er det også vigtigt at holde udstyrsomkostningerne lave6. Vi håber, at nuværende og næste generations automatiske dyrkningssystemer vil være et af bidragene til at hjælpe med at levere iPSC'er og iPSC-afledte differentierede celler af mere ensartet kvalitet.
Dette systems største begrænsninger er køleskabets begrænsede kapacitet til foreløbig opbevaring af kulturer og dets svaghed i håndteringen af små mængder (<100 μL) væske. Desuden deaktiverer manglen på sofistikeret kunstig intelligens automatisk optimering i henhold til celletilstanden til tiden. Den mindre begrænsning er kravet om specielle pipettespidser leveret af systemproducenterne 4,5. Vi udvikler den næste generation af dyrkningssystemer, der vil være i stand til at håndtere små mængder væske til mellemstore præparater og inkluderer et feedbackoptimeringssystem baseret på højtydende kunstig intelligens (systemlæring). Vores samarbejdsproducent9 har tilstrækkelig knowhow til at bygge skræddersyede systemer efter brugernes særlige behov. Derudover vil næste generations systemer udstyret med mere generelle og bredere funktioner snart være på markedet. Vi overvejer også et abonnementsbaseret udlejningssystem for at levere opdaterede systemer til alle brugere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
