Summary
Здесь мы представляем протокол для автоматизированной системы культивирования клеток. Эта автоматизированная система культивирования сокращает трудозатраты и приносит пользу пользователям, в том числе исследователям, незнакомым с обращением с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS), от поддержания iPS-клеток до дифференцировки в различные типы клеток.
Abstract
Ожидается, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) с бесконечной способностью к самораспространению найдут применение во многих областях, включая выяснение патологий редких заболеваний, разработку новых лекарств и регенеративную медицину, направленную на восстановление поврежденных органов. Несмотря на это, социальное применение ИПСК по-прежнему ограничено. Отчасти это связано с трудностью воспроизведения дифференциации в культуре, даже при наличии продвинутых знаний и сложных технических навыков, из-за высокой чувствительности ИПСК к мельчайшим изменениям окружающей среды. Решить эту проблему может применение автоматизированной системы культуры. Эксперименты с высокой воспроизводимостью, не зависящие от квалификации исследователя, можно ожидать в соответствии с общей процедурой для различных институтов. Несмотря на то, что ранее было разработано несколько автоматизированных систем культивирования, которые могут поддерживать культуры ИПСК и индуцировать дифференциацию, эти системы являются тяжелыми, большими и дорогостоящими, поскольку в них используются гуманизированные, многошарнирные роботизированные руки. Чтобы решить вышеуказанные проблемы, мы разработали новую систему, использующую простую систему направляющих по осям x-y-z, что позволило сделать ее более компактной, легкой и дешевой. Кроме того, пользователь может легко изменять параметры в новой системе для разработки новых задач по обработке. После того, как задача поставлена, все, что нужно сделать пользователю, это подготовить iPSC, заранее поставить реагенты и расходные материалы, необходимые для выполнения нужной задачи, выбрать номер задачи и указать время. Мы подтвердили, что система может поддерживать ИПСК в недифференцированном состоянии через несколько пассажей без фидерных клеток и дифференцироваться в различные типы клеток, включая кардиомиоциты, гепатоциты, нейральные предшественники и кератиноциты. Система позволит проводить высоковоспроизводимые эксперименты в разных учреждениях без необходимости в квалифицированных исследователях и будет способствовать социальному внедрению ИПСК в более широкий спектр областей исследований, уменьшая препятствия для новых заявок.
Introduction
Цель данной статьи – представить реальные и подробные процедуры работы с автоматизированной системой культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), которую мы создали в сотрудничестве с компанией, и показать репрезентативные результаты.
С момента публикации статьи в 2007 году ИПСК привлекает внимание во всем мире1. Из-за его величайшей особенности дифференцироваться в любой тип соматических клеток, ожидается, что он будет применяться в различных областях, таких как регенеративная медицина, выяснение причин трудноизлечимых заболеваний и разработка новых терапевтическихпрепаратов. Кроме того, использование соматических клеток, полученных из ИПСК человека, может сократить количество экспериментов на животных, которые подвергаются значительным этическим ограничениям. Несмотря на то, что для исследования новых методов с помощью ИПСК постоянно требуется большое количество однородных ИПСК, управление ими слишком трудоемко. Кроме того, обращение с ИПСК затруднено из-за его высокой чувствительности, даже к незначительным культурным и экологическим изменениям.
Чтобы решить эту проблему, предполагается, что автоматизированные системы культуры будут выполнять задачи вместо людей. Некоторые группы разработали несколько автоматизированных систем культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека для поддержания и дифференцировки клеток и опубликовали свои достижения 4,5,6. Эти системы оснащены многошарнирными роботизированными манипуляторами. Достоинства роботизированных манипуляторов заключаются не только в том, что они в высокой степени имитируют движения человеческой руки, но и в том, что они требуют более высокой стоимости манипулятора (рук), более крупной и тяжелой системы и трудоемких усилий инженеров по обучению для получения целенаправленных движений 7,8. Для того, чтобы облегчить внедрение аппарата в большее количество исследовательских учреждений в точках экономического, космического и человеческого потребления, мы разработали новую автоматизированную систему культивирования для поддержания и дифференцировки ИПСК в различные типы клеток9.
Наше обоснование для новой системы заключалось в том, чтобы использовать рельсовую систему осей X-Y-Z вместо многошарнирных роботизированных манипуляторов9. Чтобы заменить сложные функции роботизированных манипуляторов, мы применили новую идею к этой системе, которая может автоматически изменять три типа конкретных функциональных наконечников манипуляторов. Здесь мы также покажем, как пользователи могут легко составлять графики задач с помощью простых заказов на программное обеспечение из-за отсутствия требований к вкладу инженеров на протяжении всего процесса.
Одна из роботизированных культуральных систем продемонстрировала создание эмбриоидных тел с использованием 96-луночных планшетов в качестве 3D-клеточных агрегатов для дифференцировки4. Система, описанная здесь, не может работать с 96-луночными планшетами. Один из них достиг текущего уровня надлежащей производственной практики (cGMP) с использованием клеточной линии, хотя это не была плюрипотентная стволоваяклетка человека. Автоматизированная система культивирования, описанная здесь, была разработана специально для помощи в лабораторных экспериментах (рис. 1). Тем не менее, он имеет достаточное количество систем для поддержания уровня чистоты, эквивалентного шкафу безопасности уровня IV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по этике Медицинского университета Кансай одобрил создание и использование здоровых ИПСК добровольного происхождения под названием KMUR001 (одобрение No 2020197). Донор, который был открыто завербован, предоставил официальное информированное согласие и согласился с научным использованием клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий интерфейс (специальное программное обеспечение под названием "ccssHMI", работающее под управлением операционной системы Windows XP) является основным рабочим экраном. Под вышеупомянутым интерфейсом организован ряд вкладок, позволяющих пользователям инициировать различные операции.
1. Погрузочные работы
- Нажмите кнопку «Загрузка » на верхнем экране программы. Нажмите кнопку Loading Preparation Start (Начало подготовки к загрузке ).
- Поместите тарелку (тарелки) или тарелку (тарелки), которые нужно ввести в устройство, в нужное положение в аппарате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимая информация для идентификации тарелки должна быть написана на каждой крышке. - Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
- Выберите тип и количество блюд или тарелок в программном обеспечении.
- Нажмите кнопку Подготовка к загрузке завершена . Нажмите кнопку Loading Start .
- После того, как блюдо загружено в систему, выберите информацию о тарелке, например, с iPS-ячейками или без iPS-клеток, в программном обеспечении. Пропишите заметки о каждом блюде в программе.
- Нажмите кнопку «Регистрация » в конце, чтобы завершить операцию загрузки.
2. Операция разгрузки
- Нажмите кнопку «Выгрузить » на верхнем экране программного обеспечения. Выберите тарелку (тарелки), которую нужно удалить в программном обеспечении.
- После выбора блюд нажмите кнопку «Начало подготовки к разгрузке ». Нажмите кнопку Начало выгрузки .
- После того, как тарелка (тарелки) была перенесена из инкубатора на верстак в системе, нажмите кнопку Извлечение тарелки .
- Вручную откройте переднее раздвижное окно и выньте тарелку. Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
3. Дополнение расходных материалов: пипеток, пробирок и сред
- Чтобы пополнить расходные материалы, такие как пипетки, пробирки и среда, нажмите кнопку « Расходные материалы » на верхнем экране программного обеспечения, затем выберите предмет, который нужно пополнить.
- Пипетки
- Нажмите кнопку Пипетка . Нажмите кнопку Пополнить .
- Выберите стойку, которую пользователь хочет пополнить на программном обеспечении. Нажмите кнопку « Пополнить начало ».
- Убедившись, что крышка отсека для хранения пипеток на верстаке открыта, вручную откройте переднее сдвижное окно и пополняйте пипетки по мере необходимости.
- Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности. Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
- Нажмите кнопку «Настройка пополнения » и введите информацию для пополнения, затем нажмите кнопку «Регистрация ».
- Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
- Трубы
- Нажмите кнопку Tube (Трубка ). Нажмите кнопку Пополнить .
- Выберите стойку, которую пользователь хочет пополнить на программном обеспечении. Нажмите кнопку « Пополнить начало ».
- Убедившись, что стойка переместилась наверх, нажмите кнопку «Пополнить трубку ».
- Вручную откройте переднее сдвижное окно и пополняйте трубки по мере необходимости.
- Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
- Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
- Нажмите кнопку «Настройка пополнения » и введите информацию для пополнения, затем нажмите кнопку «Регистрация ». Нажмите кнопку Закрыть .
- Терпимая
- Нажмите кнопку «Средний ». Нажмите кнопку « Пополнить » в программном обеспечении.
- Выберите одну стойку из трех, которые пользователи хотят пополнить. Нажмите кнопку « Пополнить начало ».
- Убедившись, что крышка отсека для хранения носителя открыта, вручную откройте переднее сдвижное окно и пополните запас материала.
- Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
- Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
- Нажмите кнопку « Пополнить » и введите информацию о носителе, включая название и количество носителя. При необходимости введите дополнительные комментарии.
- Нажмите кнопку «Регистрация ».
- Нажмите кнопку Закрыть .
- Пипетки
4. Выбор задачи
- Нажмите кнопку «Задача » на верхнем экране программы.
- Нажмите кнопку Постановка задачи . Выберите нужную задачу из списка задач и нажмите кнопку «Следующий шаг ».
- Укажите дату и время выполнения задачи, а затем нажмите кнопку Регистрация . Выберите блюдо или тарелку для выполнения задания, а затем нажмите кнопку Регистрация .
- После повторного подтверждения выбранной задачи нажмите кнопку Регистрация . Подтвердите, что задача зарегистрирована на следующем экране.
- При необходимости таким же образом поставьте следующую задачу.
- Нажмите кнопку «Пуск » в конце. После этого задача запустится автоматически в указанную дату и время.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после завершения каждой задачи автоматически включаются УФ-лампы (расположенные с двух сторон вытяжки), а через 5-30 минут, в соответствии со вспомогательной настройкой, они выключаются, чтобы сохранить вытяжку в асептическом состоянии. Чтобы остановиться, пользователи могут нажать кнопку Пуск . - Если пользователи хотят отменить запланированную задачу заранее, нажмите кнопку Остановить .
- После выбора задачи для прерывания нажмите кнопку Редактировать задачу .
- Нажмите кнопку Отмена задачи . Подтвердите, что задача удалена, на следующем экране.
5. Проверьте картинки ячеек
- Каждое задание включает в себя микроскопические наблюдения (фотографирование) до и после работы. Наблюдайте за процессом культивирования клеток фотографически, выполняя задание по микроскопической фотографии до или после каждого задания.
- Выберите предустановленные программы задач, в том числе заранее выберите несколько конкретных местоположений чашки или лунки для наблюдения с фиксированной точкой для мониторинга одного и того же местоположения с течением времени.
6. Пассаж и дифференциация
- Выполните действия, описанные в разделах 1-5, и настройте автоматизированную систему культивирования клеток для выполнения пассажа и дифференцировки. Настройки приборов для пассажа, дифференцировки кардиомиоцитов, дифференцировки гепатоцитов, дифференцировки нейральных клеток-предшественников и дифференцировки кератиноцитов приведены в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4 и таблице 5 соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поддержание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
Мы использовали три линии hPSC (RIKEN-2F, 253G1 и KMUR001). Мы оптимизировали протокол технического обслуживания с помощью ежедневных экспериментов, выполняемых вручную, и дополнительно оптимизировали подробные программы с помощью семи предварительных экспериментов, проведенных системой. Например, напряжения сдвига, вызванные скоростями потока жидкости из разных пипеток, с которыми обращаются люди и система, совершенно различны; Поэтому мы оптимизировали продолжительность ферментативного сбраживания и количество пипеток для диспергирования клеток системой.
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека хранили на 10-сантиметровой чашке, покрытой матрицей клеточной культуры 0,5 мкг/см2 с питательной средой hiPSC (например, Neutristem или StemFit AK02N). Для прохождения система была запрограммирована на трехкратную промывку ИПСК 5 мл фосфатного буферного солевого раствора без кальция (PBS[-]), затем обработку 3 мл экспресс-фермента TrypLE с добавлением 10 мкМ ингибитора Ро-киназы (Y-27632) в течение 15 мин при 37 °C. После этого система добавляла в планшет 9 мл PBS(-) с 0,15% бычьим сывороточным альбумином фракции V (БСА) и выполняла два подхода движений, которые аспирировали 10 мл клеточной жидкости и дозировали жидкость из наконечника пипетки зигзагообразными движениями через верхнюю часть планшета, который был наклонен на 20° ближе к поверхности планшета. и повторил вышеописанную последовательность операций с пластиной, наклоненной на 20° с противоположной стороны. Затем система собирала содержащую клетки среду в пробирку объемом 15 мл и закрывала ее, после чего ее центрифугировали при 115 x g в течение 5 мин для осаждения клеток. После этого система аспирировала надосадочную жидкость и диспергировала клеточную гранулу в отдельные клетки, используя 10 мл питательной среды с 10 мкМ Y-27632 путем пипетирования 10 раз. Система перенесла 1 мл раствора трипанового синего в новую пробирку объемом 15 мл, затем добавила 1 мл клеточной суспензии и перемешала их путем пипетирования пять раз. После этого 100 мкл клеточного раствора трипана, окрашенного синим, аспирировали и дозировали во входное окно одноразового гемоцитометра в держателе. Система перемещала держатель гемоцитометра в зону микроскопического наблюдения и делала снимок, который тут же анализировался программным обеспечением, а полученная концентрация клеток применялась к следующему этапу. Для поддержания ИПСК система высевала клетки с плотностью клеток 15 000 клеток/см2 в новые пластиковые планшеты диаметром 10 см, покрытые матрицей клеточной культуры 0,5 мкг/см2 . Для экспериментов по дифференцировке система засевала клетки с требуемой плотностью клеток в среду, приготовленную для каждого типа соматических клеток, в 6-луночные планшеты, покрытые матрицей клеточной культуры, разбавленной до 1/100. Наконец, система выполнила перекрестную блокировку пять раз, прежде чем переместить пластины в инкубатор. В систему были загружены три новые 10-сантиметровые планшеты, содержащие ИПСК, и три планшета, предварительно покрытые матрицей клеточных культур, а также другие необходимые элементы были подготовлены в соответствии с соответствующими процедурами, упомянутыми выше. Один цикл поддерживающей культуры состоит из задания по прохождению в 1-й день с последующей сменой питательной среды один раз в день в течение 3 дней. На протяжении всего эксперимента этот цикл был рассчитан на пять циклов. Кроме того, по очереди пополнялись расходники.
Согласно заказанному графику, пять циклов культуры технического обслуживания были успешно выполнены, как и планировалось системой. На фотографиях клеток, сделанных автоматически во время выполнения каждой задачи, было подтверждено, что клетки плавно размножались с течением времени. Разложение ячейки (n = 3) было рассчитано и показано на рисунке 2. Для подтверждения того, остается ли недифференцированное состояние ИПСК неизменным даже после поддерживающей культуры в автоматизированной культуральной системе, проводили иммуноцитометрический анализ (Oct3/4 и SSEA4) с использованием оставшихся образцов при каждом пассаже (рис. 3А). Кроме того, после пяти циклов три чашки были выгружены из системы, а также проведен иммуногистохимический анализ (Oct3/4, SSEA4 и Tra1-81) (рис. 3B). Оба анализа с использованием флуоресцентного иммуноокрашивания показали, что недифференцированное состояние iPS-клеток сохраняется. Кариотипирование ИПСК также проводили до и после поддерживающей культуры в автоматизированной системе культивирования. Несмотря на то, что аномалия наблюдалась в аллеле хромосомы 17 до начала поддерживающей культуры, после 5 поддерживающих культур система не наблюдала никаких особых изменений, включая аномалию (рис. 3В). Настройки, используемые для обслуживания ИПСК, сведены в таблицу 1.
Дифференциация
Кардиомиоциты
Протокол дифференциации из предыдущей публикации был использован здесь10. Система высевала недифференцированные ИПСК (KMUR001) с плотностью 30 000 клеток/см2 на 6-луночные планшеты, покрытые матрицей клеток, в питательной среде с ИПСК с добавлением 10 мкМ Y-27632. Через 3 суток (1-й день дифференцировки) система меняла среду на среду плюрипотентных стволовых клеток человека с 6 мкМ ингибитора GSK-3ß CHIR-99021, 20 нг/мл активина А и 10 нг/мл BMP4. На 3-й день дифференцировки система переходила на среду CDM3: RPMI 1640, 500 мкг/мл рекомбинантного человеческого альбумина и 213 мкг/мл 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты с 2 мкМ Wnt-C59. На 5-й день дифференциации система была заменена на свежую среду CDM3; после этого его повторяли, меняя на свежую среду CDM3 через день. Настройки, используемые для кардиомиоцитарной дифференцировки ИПСК, сведены в таблицу 2.
Гепатоциты
Протокол дифференциации из предыдущей публикации был использован здесь11. Система высевала недифференцированные ИПСК (RIKEN2F) с плотностью 25 000 клеток/см2 на 6-луночные планшеты, покрытые матриксом клеток, в питательной среде с ИПСК с добавлением 10 мкМ Y-27632. Через 2 дня (1-й день дифференцировки) система изменила среду на RPMI-1640 плюс 2% B27 минус инсулин (RPMI-B27), содержащий 100 нг/мл активина A, 6 мкМ CHIR-99021 и 1% добавку глютамина (например, GlutaMAX) в течение 24 часов. На 2-й день дифференцировки мы изменили среду на RPMI-B27 с 50 нг/мл активина А. На 5-й день дифференцировки система изменила среду на RPMI-B27, содержащую 1% глютаминовой добавки и 10 нг/мл BMP-4. На 9-е сутки дифференцировки система меняла среду на среду созревания гепатоцитов: среду L-15 Лейбовица, содержащую 8,3% бульона триптозофосфата, 10 мкМ гидрокортизона 21-гемисукцината, 50 мкг/мл L-аскорбата натрия, 100 нМ дексаметазона, 0,58% инсулина-трансферрин-селена, 2 мМ добавки глютамина, 8,3% фетальной бычьей сыворотки и 100 нМ рака-1,2-дигексадецилглицерина. После этого система повторяла смену среды на свежую через день. Параметры, используемые для дифференцировки гепатоцитов ИПСК, сведены в таблицу 3.
Клетки-предшественники нейронов
Здесь был использован протокол дифференциации из предыдущей публикации12. Система высевала недифференцированные ИПСК (RIKEN2F) с плотностью 25 000 клеток/см2 на 6-луночные планшеты, покрытые матрицей базальной мембраны, в модифицированной среде Eagle (DMEM)/F12 компании Dulbecco и нейробазальной среде (1:1), дополненной 10% заменой сыворотки Knockout, заменимыми аминокислотами 0,1 мМ, добавкой глутамина 1 мМ с ингибитором рецептора TGF-бета 10 мкМ (SB431542), ингибитором сигнала BMP 10 мкМ (дорсоморфином), и 10 мкМ Y-27632 (1-й день дифференцировки). На 5-й день дифференцировки система изменила среду на DMEM/F12 и нейробазальную среду 1:1 с добавлением 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ глутамина, 1% добавки N-2, 1% добавки B-27, 50 мкг/мл 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 10 мкМ SB431542 и 10 мкМ дорсоморфина. На 9-й день дифференцировки система изменила среду на DMEM/F12 и нейробазальную среду 1:1 с добавлением 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ добавки глютамина, 1% добавки N-2, 1% добавки B-27, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата и 1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты. На 13-16-й день дифференцировки система меняла среду каждый день с помощью DMEM/F12 и нейробазальной среды 1:1 с добавлением 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ глутаминовой добавки, 1% добавки N-2, 1% добавки B-27, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата, а также 10 нг/мл bFGF и 10 нг/мл EGF. Настройки, используемые для дифференцировки нейральных клеток-предшественников ИПСК, сведены в таблицу 4.
Кератиноциты
Протокол дифференциации из предыдущей публикации был использован здесь13. Система высевала недифференцированные ИПСК (253G1) с плотностью 15 000 клеток/см2 в 6-луночные планшеты, покрытые матриксом клеток, в питательной среде hiPSC с 10 мкМ Y-27632. Через 2 дня (1-й день дифференцировки) система изменила среду на модифицированную среду Дульбекко Eagle medium (DMEM)/F12 и нейробазальную среду (1:1) с 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ глутамина, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1% добавки N-2, 2% добавки B-27, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты 2-фосфата, 0,05% бычьего сывороточного альбумина и 100 нг/мл FGF-основного. На 3-е сутки дифференцировки, а затем среду меняли на среду кератиноцитов человека (без добавки на 3-й день и с добавкой на/после 5-го дня) с добавлением 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты, 25 нг/мл hBMP-4, 2,4 мкг/мл аденина, 1,37 нг/мл трийодтиронина, 0,3 мМ аскорбиновой кислоты 2-фосфата, и 2 мкМ форсколин, каждые 2 дня системой. Настройки, используемые для кератиноцитарной дифференцировки ИПСК, сведены в таблицу 5.
Как упоминалось выше, весь процесс выполнялся с использованием только автоматизированного оборудования для культивирования, начиная от посева iPS-клеток и заканчивая последующей серией протоколов дифференцировки. Оценивали экспрессию характерных маркеров в каждой клетке (рис. 4). Показано, что дифференциация может быть индуцирована только с помощью автоматизированной системы культивирования.
Рисунок 1: Краткая информация об автоматизированной системе культуры. (A) Изображение системы, показывающее размер и эскиз компоновки 1. (Б) Изображение верстака и эскиз макета 2. (C) Ручные инструменты: тарелка, пробирка и пипетка. Эта цифра была изменена с разрешения Bando et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Задача прохождения и рост клеток. (А) Квадрат иллюстрирует каждый процесс. (B) Расширение ИПСК, рассчитанное с использованием каждого автоматизированного подсчета клеток в трех независимых экспериментах. (C) Репрезентативные изображения, получаемые автоматически от прохода к проходу. Масштабные линейки = 400 мкм и 100 мкм (вставка). Эта цифра была изменена с разрешения Bando et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Автоматизированное долгосрочное поддержание ИПСК. (A) Все иммуноцитометрические анализы трех независимых экспериментов для Oct-3/4 и SSEA-4. Каждая синяя гистограмма указывает на отсутствие первичного контроля антител. Каждая красная гистограмма представляет собой указанный антиген-специфический сигнал. (B) Репрезентативные изображения иммуногистохимически окрашенных клеток для Oct-3/4, SSEA-4 и Tra 1-81. Масштабные линейки = 50 мкм. (C) Кариотип RIKEN2F-iPSC после пятого пассажа. Эта цифра была изменена с разрешения Bando et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммуногистохимическое окрашивание. Иммуногистохимическая картина гепатоцитов (шкала = 100 мкм), кардиомиоцитов (шкала = 100 мкм), нейрональных клеток-предшественников (шкала = 100 мкм) и кератиноцитов (шкала = 200 мкм). Эта цифра была изменена с разрешения Bando et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Подготовка прохода и настройка системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Препараты дифференцировки кардиомиоцитов и настройки системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Препараты дифференцировки гепатоцитов и настройки системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 4: Препараты для дифференцировки клеток-предшественников нейронов и настройки системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 5: Препараты для дифференцировки кератиноцитов и настройки системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критически важным шагом в протоколе является то, что если пользователь обнаружит какие-либо неисправности, нажмите кнопку отмены, остановки или сброса в любое время и начните с первого шага. Программное обеспечение позволяет избежать человеческих ошибок, в том числе двойного бронирования, открытия дверей во время активных задач системы и отсутствия пополнения. Другим критическим моментом для успешной и эффективной дифференцировки в желаемую соматическую клетку является правильный отбор линий плюрипотентных стволовых клеток, поскольку каждая плюрипотентная стволовая клетка имеет неконтролируемое смещение в своих дифференцировочных свойствах14,15.
Эта автоматизированная система культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток может поддерживать и дифференцировать их в различные типы соматических клеток. Размер этой системы составляет 200 см (ширина), 110 см (глубина) и 233 см (высота), при общем весе 1,2 тонны. Встроенный в устройство инкубатор может одновременно вмещать тридцать шесть 10-сантиметровых тарелок и девять мультилуночных тарелок.
Улучшения по сравнению с предыдущими моделями заключаются в том, что во-первых, в качестве манипулятора рельсовая система осей X-Y-Z была преобразована из 6-осевого шарнирно-сочлененного рычага, который работает путем замены наконечника рычага на три разные части для тарелок, пробирок и пипеток. Манипулятор подвешен к потолку системы и перемещается по оси X-Y-Z. Во-вторых, была введена система подсчета клеток для безпитательных поддерживающих культур и протоколы индукции дифференцировки, которые выполняются непрерывно с момента пассажа. После смешивания раствора одноклеточной суспензии с раствором трипанового синего его его переводили на одноразовый гемоцитометр для микроскопического наблюдения и визуализации. Программное обеспечение автоматически анализирует полученное изображение, чтобы подсчитать количество живых клеток и рассчитать объем, необходимый для посева необходимого количества клеток. Точность подсчета клеток, полученная в результате анализа изображений, соответствовала точности, полученной вручную.
Рельсовая система осей X-Y-Z была применена для более быстрого выполнения каждой задачи по сравнению с предыдущей версией (многоосевой шарнирно-сочлененный рычаг). С помощью этой автоматизированной системы культивирования было выполнено пять непрерывных пассажей в течение 16 дней, и ИПСК были расширены в 625 ± 93 раза. Несмотря на то, что испытание выносливости при содержании клеток без питающих ячеек было короче, чем наша предыдущая демонстрация с фидерными ячейками, расширение ячейки было более эффективным по сравнению с предыдущей демонстрацией6. Сокращение времени выполнения задач, по-видимому, способствовало предотвращению повреждения клеток от высыхания во время выполнения задач.
Кроме того, задачи дифференцировки от поддерживающей культуры до дифференцировки в кардиомиоциты, гепатоциты, клетки-предшественники нейронов и кератиноциты выполнялись без вмешательства человека. После серии таких курсов флуоресцентным иммуноокрашиванием было подтверждено, что клетки, полученные только в автоматизированной системе культивирования, дифференцировались в нужные клетки. Таким образом, используя эту систему, исследователи, которые не знакомы с управлением iPS-клетками, могут получить соматические клетки, полученные из ИПСК, для своих собственных исследований. Более того, различия в воспроизводимости между исследователями или учреждениями можно было бы максимально устранить, и это могло бы гарантировать, что клетки однородного качества всегда будут получены.
Благодаря новой рельсовой системе оборудование может быть уменьшено до 1,2 тонны, что на ~200 кг легче, чем раньше. Кроме того, затраты на запчасти и настройку программ могут быть снижены примерно на 10 000 долларов США. Затраты на техническое обслуживание и программирование, по оценкам, снизятся на 13%. Для того, чтобы мотивировать больше исследователей легко участвовать в исследованиях, связанных с iPS-клетками, также важно поддерживать низкую стоимость оборудования6. Мы надеемся, что автоматические системы культивирования текущего и следующего поколений станут одним из вкладов в создание ИПСК и дифференцированных клеток, полученных из ИПСК, более однородного качества.
Основными ограничениями этой системы являются ограниченная вместимость холодильника для предварительного хранения культур и его слабость при работе с небольшими количествами (<100 мкл) жидкости. Кроме того, отсутствие развитого искусственного интеллекта отключает автоматическую оптимизацию в соответствии с состоянием ячейки. Незначительным ограничением является требование наличия специальных наконечников для пипетки, предоставляемых производителями системы 4,5. Мы разрабатываем следующее поколение культуральных систем, которые смогут работать с небольшими объемами жидкости для приготовления сред и включать в себя систему оптимизации обратной связи на основе высокопроизводительного искусственного интеллекта (системного обучения). Наш сотрудничающий производитель9 обладает достаточным ноу-хау для создания индивидуальных систем в соответствии с особыми потребностями пользователей. Кроме того, в скором времени на рынке появятся системы следующего поколения, оснащенные более общими и широкими функциями. Мы также рассматриваем возможность создания системы аренды по подписке, чтобы обеспечить всех пользователей современными системами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автору нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Центра содействия развитию нового бизнеса, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Осака, Япония.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
