Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.
Abstract
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) עם יכולת אינסופית של התרבות עצמית צפויים להיות בעלי יישומים בתחומים רבים, כולל הבהרה של פתולוגיות של מחלות נדירות, פיתוח תרופות חדשות ורפואה רגנרטיבית שמטרתה לשקם איברים פגועים. למרות זאת, היישום החברתי של hiPSCs עדיין מוגבל. זאת, בין היתר, בשל הקושי לשחזר את הבידול בתרבות, אפילו עם ידע מתקדם וכישורים טכניים מתוחכמים, בשל הרגישות הגבוהה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לשינויים סביבתיים זעירים. היישום של מערכת תרבות אוטומטית יכול לפתור בעיה זו. ניתן לצפות לניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה שאינה תלויה במיומנותו של החוקר על פי נוהל משותף בין מכונים שונים. למרות שמספר מערכות תרבות אוטומטיות המסוגלות לשמור על תרביות iPSC ולגרום לבידול פותחו בעבר, מערכות אלה הן כבדות, גדולות ויקרות מכיוון שהן עושות שימוש בזרועות רובוטיות אנושיות ורב-מפרקיות. כדי לשפר את הבעיות הנ"ל, פיתחנו מערכת חדשה באמצעות מערכת פשוטה של מסילות הזזה על ציר x-y-z, המאפשרת לה להיות קומפקטית יותר, קלה יותר וזולה יותר. יתר על כן, המשתמש יכול בקלות לשנות פרמטרים במערכת החדשה כדי לפתח משימות טיפול חדשות. לאחר קביעת משימה, כל שעל המשתמש לעשות הוא להכין את ה- iPSC, לספק מראש את הריאגנטים והחומרים המתכלים הדרושים למשימה הרצויה, לבחור את מספר המשימה ולציין את השעה. אישרנו כי המערכת יכולה לשמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במצב בלתי ממוין באמצעות מספר מעברים ללא תאי הזנה ולהתמיין לסוגי תאים שונים, כולל קרדיומיוציטים, הפטוציטים, אבות עצביים וקרטינוציטים. המערכת תאפשר ניסויים בעלי יכולת שחזור גבוהה בין מוסדות ללא צורך בחוקרים מיומנים ותקל על יישום חברתי של hiPSCs במגוון רחב יותר של תחומי מחקר על ידי הפחתת המכשולים לערכים חדשים.
Introduction
מאמר זה נועד לספק נהלי טיפול בפועל ומפורטים עבור מערכת תרבית אוטומטית עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC), אשר ייצרנו על ידי שיתוף פעולה עם חברה, ולהציג תוצאות מייצגות.
מאז פרסום המאמר בשנת 2007, iPSC מושך תשומת לב בכל רחבי העולם1. בשל התכונה הגדולה ביותר של היכולת להתמיין לכל סוג של תא סומטי, הוא צפוי להיות מיושם בתחומים שונים כגון רפואה רגנרטיבית, להבהיר את הגורמים למחלות עקשניות, ופיתוח תרופות טיפוליות חדשות 2,3. בנוסף, שימוש בתאים סומטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בבני אדם עשוי להפחית ניסויים בבעלי חיים, הכפופים למגבלות אתיות משמעותיות. למרות שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הומוגניים רבים נדרשים כל הזמן לחקור שיטות חדשות עם iPSCs, זה מייגע מדי לנהל אותם. יתר על כן, הטיפול ב- iPSC קשה בגלל רגישותו הגבוהה, אפילו לשינויים תרבותיים וסביבתיים עדינים.
כדי לפתור בעיה זו, מערכות תרבות אוטומטיות צפויות לבצע משימות במקום בני אדם. קבוצות מסוימות פיתחו כמה מערכות אוטומטיות לתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיות אנושיות לתחזוקה והתמיינות של תאים ופרסמו את הישגיהן 4,5,6. מערכות אלה מציידות זרועות רובוטיות רב-מפרקיות. לזרועות רובוטיות יש לא רק ערך בכך שהן מחקות מאוד תנועות זרוע אנושיות, אלא גם ראויות בכך שהן דורשות עלויות גבוהות יותר עבור הזרוע(ות), אריזות מערכת גדולות וכבדות יותר, ומאמצי חינוך גוזלי זמן על ידי המהנדסים כדי להשיג את התנועות המכוונות 7,8. על מנת להקל על החדרת המנגנון למתקני מחקר נוספים בנקודות של צריכת משאבים כלכליים, חלל ומשאבי אנוש, פיתחנו מערכת תרבית אוטומטית חדשנית לתחזוקה והתמיינות של iPSC לסוגי תאים שונים9.
הרציונל שלנו למערכת החדשה היה לאמץ מערכת מסילות ציר X-Y-Z במקום זרועות רובוטיות רב-מפרקיות9. כדי להחליף את הפונקציות המורכבות דמויות היד של זרועות רובוטיות, יישמנו רעיון חדש למערכת זו, אשר יכול לשנות באופן אוטומטי שלושה סוגים של קצוות זרוע פונקציונליים ספציפיים. כאן, אנו גם מציינים כיצד משתמשים יכולים בקלות לבצע לוחות זמנים של משימות עם הזמנות פשוטות בתוכנה בגלל היעדר דרישות לתרומות המהנדסים לאורך כל התהליך.
אחת ממערכות התרבית הרובוטיות הדגימה יצירת גופים עובריים באמצעות לוחות 96 בארות כצברי תאים תלת-ממדיים להתמיינות4. המערכת המדווחת כאן אינה יכולה להתמודד עם לוחות 96 בארות. אחד מהם השיג את הציון הנוכחי של תנאי ייצור נאותים (cGMP) באמצעות קו תאים, למרות שזה לא היה תא גזע פלוריפוטנטי אנושי5. מערכת התרביות האוטומטיות המפורטת כאן פותחה כעת במטרה ספציפית לסייע בניסויי מעבדה (איור 1). עם זאת, יש לו מספיק מערכות כדי לשמור על רמות נקיות שוות ערך לארון בטיחות ברמה IV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של קנסאי אישרה את הייצור והשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים בריאים שמקורם במתנדבים בשם KMUR001 (אישור מס' 2020197). התורם, שגויס בגלוי, סיפק הסכמה רשמית מדעת והסכים לשימוש המדעי בתאים.
הערה: הממשק הנוכחי (התוכנה המיוחדת בשם "ccssHMI" הפועלת תחת מערכת ההפעלה Windows XP) הוא מסך הפעולה הבסיסי. תחת הממשק הנ"ל, סדרה של כרטיסיות מסודרות, המאפשר למשתמשים ליזום פעולות שונות.
1. פעולות טעינה
- לחץ על טען כפתור במסך העליון של התוכנה. לחץ על הלחצן Loading Preparation Start .
- הניחו את הצלחות או הצלחות שיוכנסו למכשיר במקומן במנגנון.
הערה: המידע הדרוש לזיהוי צלחת צריך להיות כתוב על כל מכסה. - סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
- בחר את הסוג והכמות של הצלחות או הצלחות בתוכנה.
- לחץ על הלחצן טען הכנה הושלמה . לחץ על לחצן 'טען התחל '.
- לאחר העלאת צלחת למערכת, בחר את המידע על המנה, כגון עם תאי iPS או ללא תאי iPS, בתוכנה. רשום הערות על כל מנה בתוכנה.
- לחץ על לחצן רישום בסוף כדי להשלים את פעולת הטעינה.
2. פעולת פריקה
- לחץ על הלחצן Unload במסך העליון של התוכנה. בחר את המנות שברצונך להסיר בתוכנה.
- לאחר בחירת המנה, לחץ על הלחצן Unloading Preparation Start . לחץ על לחצן התחל פריקה .
- לאחר העברת הצלחות מהאינקובטור לשולחן העבודה במערכת, יש ללחוץ על כפתור הסרת הכלים .
- פתחו ידנית את חלון ההזזה הקדמי והוציאו את הכלים. סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
3. תוספת של חומרים מתכלים: פיפטה, צינורות, בינוני
- כדי לחדש חומרים מתכלים כגון פיפטה, צינורות ומדיום, לחץ/י על הכפתור ״חומרים מתכלים״ במסך העליון של התוכנה ולאחר מכן בחר/י את הפריט לחידוש.
- פיפטות
- לחץ על לחצן פיפטה . בחר בלחצן חדש .
- בחר ארון תקשורת שהמשתמש רוצה לחדש בתוכנה. לחץ על הלחצן Relenish Start .
- לאחר אישור כי המכסה של אזור אחסון פיפטה על שולחן העבודה נפתח, לפתוח ידנית את חלון הזזה הקדמי ולחדש את פיפטות לפי הצורך.
- סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני. לחץ על הלחצן חדש הושלם .
- לחץ/י על הכפתור ״ הגדרת חידוש ״ והזן/י את פרטי החידוש ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״רישום ״.
- לחץ על הלחצן חדש הושלם .
- צינורות
- לחץ על הלחצן Tube . בחר בלחצן חדש .
- בחר ארון תקשורת שהמשתמש רוצה לחדש בתוכנה. לחץ על הלחצן Relenish Start .
- לאחר אישור שהמדף עבר לחלק העליון, לחץ על הלחצן חדש צינור .
- פתח ידנית את חלון ההזזה הקדמי וחדש את הצינורות לפי הצורך.
- סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
- לחץ על הלחצן חדש הושלם .
- לחץ/י על הכפתור ״ הגדרת חידוש ״ והזן/י את פרטי החידוש ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״רישום ״. לחץ על לחצן סגור .
- בינוני
- לחץ על הלחצן בינוני . בחר בלחצן חדש בתוכנה.
- בחר ארון תקשורת אחד מתוך שלושה שהמשתמשים רוצים לחדש. לחץ על הלחצן Relenish Start .
- לאחר אישור כי המכסה של אזור האחסון הבינוני נפתח, פתח ידנית את חלון ההזזה הקדמי וחדש את המדיום.
- סגור ידנית את חלון ההזזה הקדמי ולחץ על לחצן אישור הבטיחות המכאני.
- לחץ על הלחצן חדש הושלם .
- לחץ על הלחצן חדש והזן את המידע עבור המדיום, כולל השם והכמות של המדיום. הזן הערות נוספות במידת הצורך.
- לחץ על הלחצן הרשמה .
- לחץ על לחצן סגור .
- פיפטות
4. בחירת משימות
- לחץ על לחצן משימה במסך העליון של התוכנה.
- בחר בלחצן הגדרת משימה . בחר את המשימה הרצויה מרשימת המשימות ולחץ על הלחצן השלב הבא .
- ציין את התאריך והשעה לביצוע המשימה ולאחר מכן לחץ על הלחצן הרשמה . בחר צלחת או צלחת לביצוע המשימה ולאחר מכן לחץ על לחצן הרשמה .
- לאחר אישור מחדש של המשימה שנבחרה, לחץ על לחצן הרשמה . ודא שהמשימה נרשמה במסך הבא.
- במידת הצורך, הגדר את המשימה הבאה באותו אופן.
- לחץ על לחצן התחל בסוף. לאחר מכן, המשימה תתחיל באופן אוטומטי בתאריך ובשעה שצוינו.
הערה: מיד לאחר סיום כל משימה, אורות UV (הממוקמים משני צידי מכסה המנוע) נדלקים באופן אוטומטי, ולאחר 5-30 דקות, בהתאם להגדרת העזר, הם כבויים כדי לשמור על מכסה המנוע במצב אספטי. כדי לעצור, משתמשים יכולים ללחוץ על לחצן התחל . - אם משתמשים רוצים לבטל משימה מתוזמנת מראש, לחץ על לחצן עצור .
- לאחר בחירת המשימה לביטול, לחץ על לחצן ערוך משימה .
- לחץ על לחצן ביטול משימה . אשר שהמשימה נמחקה במסך הבא.
5. בדוק תמונות סלולריות
- כל משימה כוללת תצפיות מיקרוסקופיות (צילום) לפני ואחרי עבודת המשימה. התבונן בהתקדמות תרבית התאים באופן צילומי על ידי שילוב משימת צילום מיקרוסקופית לפני או אחרי כל משימה.
- בחר תוכניות משימה מוגדרות מראש, כולל בחירת מיקומים ספציפיים מרובים של הצלחת או צלחת הבאר מראש לתצפית בנקודה קבועה כדי לפקח על אותו מיקום לאורך זמן.
6. מעבר ובידול
- בצע את השלבים בסעיפים 1-5 והגדר את המערכת האוטומטית לתרביות תאים לביצוע העברה והתמיינות. הגדרות המכשיר למעבר, התמיינות קרדיומיוציטים, התמיינות הפטוציטים, התמיינות תאים קודמנים עצביים והתמיינות קרטינוציטים מוצגות בטבלה 1, טבלה 2, טבלה 3, טבלה 4 וטבלה 5, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם
השתמשנו בשלושה קווי hPSC (RIKEN-2F, 253G1 ו-KMUR001). ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול התחזוקה באמצעות ניסויים ידניים יומיים ואופטימיזציה נוספת של התוכניות המפורטות באמצעות שבעת הניסויים המקדימים שבוצעו על ידי המערכת. לדוגמה, לחצי גזירה הנגרמים על ידי מהירויות הנוזל של זרימת היריקה מפיפטים שונים המטופלים על ידי בני אדם והמערכת שונים למדי; לכן, ביצענו אופטימיזציה של משך הזמן של העיכול האנזימטי ומספר הפיפטינג לפיזור תאים על ידי המערכת.
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם נשמרו על צלחת של 10 ס"מ מצופה במטריצת תרבית תאיםבגודל 0.5 מיקרוגרם/ס"מ עם מדיום תרבית hiPSC (למשל, Neutristem או StemFit AK02N). לצורך המעבר, המערכת תוכנתה לשטוף hiPSC שלוש פעמים עם 5 מ"ל של מלח חיץ פוספט ללא סידן (PBS[-]), ולאחר מכן לטפל עם 3 מ"ל של אנזים TrypLE express בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב Rho kinase (Y-27632) במשך 15 דקות ב 37 ° C. לאחר מכן, המערכת הוסיפה 9 מ"ל של PBS(-) עם 0.15% שבר אלבומין בסרום בקר V (BSA) וביצעה שני סטים של תנועה ששאפו 10 מ"ל של נוזל המכיל תאים ושחררו את הנוזל מקצה פיפטה בתנועת זיג-זג על פני החלק העליון של הצלחת, אשר היה מוטה 20° קרוב יותר למשטח הצלחת, וחזר על רצף הפעולות הנ"ל כאשר הצלחת מוטה ב 20° בצד הנגדי. לאחר מכן, המערכת אספה את התווך המכיל את התא בצינור של 15 מ"ל וכיסתה אותו, ולאחר מכן הוא היה צנטריפוגה ב 115 x גרם במשך 5 דקות כדי להפקיד את התאים. לאחר מכן, המערכת שאפה את הסופרנאטנט ופיזרה את כדורית התא לתאים בודדים באמצעות 10 מ"ל של מדיום תרבית עם 10 מיקרומטר Y-27632 על ידי פיפטינג 10 פעמים. המערכת העבירה 1 מ"ל של תמיסה כחולה טריפאן לתוך צינור חדש של 15 מ"ל, ולאחר מכן הוסיפה 1 מ"ל של תרחיף התא וערבבה אותם על ידי פיפטינג חמש פעמים. לאחר מכן, 100 μL של תמיסת התא המוכתם הכחול טריפאן נשאפו וניפקו לחלון הכניסה של ההמוציטומטר החד פעמי במחזיק. המערכת העבירה את מחזיק ההמוציטומטר לאזור התצפית המיקרוסקופי, וצילמה תמונה, שנותחה מיד על ידי תוכנה, וריכוז התא שהתקבל הוחל לשלב הבא. לצורך תחזוקת iPSC, המערכת זרעה את התאים בצפיפות תאים של 15,000 תאים לסמ"ק2 בלוחות פלסטיק חדשים בקוטר 10 ס"מ המצופים במטריצת תרבית תאיםבקוטר 0.5 מיקרוגרם/ס"מ. לצורך ניסויי התמיינות זרעה המערכת את התאים בצפיפות התאים הנדרשת בתווך שהוכן לכל סוג תא סומטי בלוחות בעלי 6 בארות מצופות במטריצת תרבית תאים מדוללת ל-1/100. לבסוף, המערכת ביצעה נעילה צולבת חמש פעמים לפני העברת הלוחות לאינקובטור. למערכת הועמסו שלוש צלחות חדשות בקוטר 10 ס"מ המכילות iPSCs ושלוש צלחות מצופות מראש במטריצת תרביות תאים, וכן הוכנו פריטים נחוצים אחרים בהתאם לנהלים שהוזכרו לעיל. מחזור אחד של תרבות תחזוקה מורכב ממשימה חולפת ביום הראשון ואחריה שינוי מדיום תרבית פעם ביום למשך 3 ימים. לאורך כל הניסוי, מחזור זה נקבע לחמישה מחזורים. בנוסף, מתכלים התחדשו בתורו.
על פי לוח הזמנים שהוזמן, חמישה מחזורים של תרבות תחזוקה בוצעו בהצלחה כמתוכנן על ידי המערכת. מתמונות התאים שצולמו באופן אוטומטי במהלך כל משימה, אושר כי התאים התרבו בצורה חלקה לאורך זמן. התרחבות התאים (n = 3) חושבה והוצגה באיור 2. כדי לוודא אם המצב הבלתי מובחן של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים נותר ללא שינוי אפילו לאחר תרבית תחזוקה במערכת התרביות האוטומטית, בוצע ניתוח אימונוציטומטוטורי (Oct3/4 ו-SSEA4) באמצעות הדגימות הנותרות בכל מעבר (איור 3A). יתר על כן, לאחר חמישה מחזורים, שלוש הצלחות נפרקו מהמערכת, וניתוח אימונוהיסטוכימי (Oct3/4, SSEA4 ו-Tra1-81) בוצע גם כן (איור 3B). שני הניתוחים באמצעות אימונוסטיין פלואורסצנטי הראו כי המצב הבלתי ממוין של תאי iPS נשמר. קריוטייפ של iPSCs בוצע גם לפני ואחרי תרבות תחזוקה במערכת תרבות אוטומטית. אף על פי שנצפתה חריגה באלל של כרומוזום 17 לפני תחילת תרבית התחזוקה, המערכת לא נצפתה שינוי מסוים לאחר 5 תרביות תחזוקה, כולל החריגה (איור 3C). ההגדרות המשמשות לתחזוקה של iPSCs מסוכמות בטבלה 1.
בידול
קרדיומיוציטים
פרוטוקול הבידול מפרסום קודם בוצע כאן10. המערכת זרעה hiPSCs בלתי ממוינים (KMUR001) בצפיפות של 30,000 תאים לסמ"ק2 על לוחות 6 בארות מצופי תרבית תאים בתווך תרבית hiPSC בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632. המערכת שינתה את התווך של תאי גזע פלוריפוטנטיים בינוניים לבני אדם עם 6 מיקרומטר של מעכב GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL Activin A ו-10 ng/mL BMP4 לאחר 3 ימים (יום התמיינות 1). ביום התמיינות 3, המערכת השתנתה למדיום CDM3: RPMI 1640, אלבומין אנושי רקומביננטי 500 מיקרוגרם/מ"ל, ו-213 מיקרוגרם/מ"ל חומצה L-אסקורבית 2-פוספט עם 2 מיקרומטר Wnt-C59. ביום הבידול 5, המערכת השתנתה למדיום CDM3 טרי; לאחר מכן, הוא חזר על שינוי למדיום CDM3 טרי כל יומיים. ההגדרות המשמשות להתמיינות קרדיומיוציטים של iPSCs מסוכמות בטבלה 2.
הפטוציטים
פרוטוקול הבידול מפרסום קודם בוצע כאן11. המערכת זרעה hiPSCs בלתי ממוינים (RIKEN2F) בצפיפות של 25,000 תאים לסמ"ק2 על לוחות 6 בארות מצופי מטריצת תרבית תאים בתווך תרבית hiPSC בתוספת 10 מיקרומטר של Y-27632. לאחר יומיים (יום התמיינות 1), המערכת שינתה את התווך ל-RPMI-1640 בתוספת 2% B27 פחות אינסולין (RPMI-B27) המכיל 100 ננוגרם/מ"ל Activin A, 6 μM CHIR-99021, ותוסף גלוטמין 1% (למשל, GlutaMAX) למשך 24 שעות. ביום התמיינות 2, שינינו את המדיום ל-RPMI-B27 עם 50 ng/mL Activin A. ביום התמיינות 5, המערכת שינתה את המדיום ל-RPMI-B27, המכיל תוספת גלוטמין 1% ו-10 ננוגרם/מ"ל BMP-4. ביום התמיינות 9, המערכת שינתה את מדיום ההבשלה לכבד לתווך הפטוציטים: מדיום L-15 של לייבוביץ' המכיל 8.3% מרק טריפטוז פוספט, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט, 50 מיקרוגרם/מ"ל נתרן L-אסקורבט, 100 ננומטר דקסמתזון, 0.58% אינסולין-טרנספרין-סלניום, תוסף גלוטמין 2 מ"מ, 8.3% סרום בקר עוברי ו-100 ננומטר rac-1,2-dihexadecylglycerol. לאחר מכן, המערכת חזרה ושינתה את המדיום למדיום טרי אחת ליומיים. ההגדרות המשמשות להתמיינות הפטוציטים של iPSCs מסוכמות בטבלה 3.
תאים מקדימים עצביים
פרוטוקול הבידול מפרסום קודם בוצע כאן12. המערכת זרעה hiPSCs בלתי ממוינים (RIKEN2F) בצפיפות של 25,000 תאים/ס"מ2 על לוחות 6 בארות מצופי ממברנת מרתף במדיום איגל (DMEM)/F12 ובתווך נוירובזאלי (1:1) בתוספת 10% תחליף סרום נוקאאוט, 0.1 mM חומצות אמינו לא חיוניות, תוסף גלוטמין 1 mM עם מעכב קולטן TGF-beta 10 מיקרומטר (SB431542), מעכב אות BMP 10 מיקרומטר (dorsomorphin), ו 10 מיקרומטר Y-27632 (יום הבחנה 1). ביום התמיינות 5, המערכת שינתה את המדיום ל-DMEM/F12 ו-Neurobasal medium 1:1 בתוספת 0.1mM חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM תוסף גלוטמין, 1% תוסף N-2, 1% תוסף B-27, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית 2-פוספט, 10 μM SB431542 ו-10 μM dorsomorphin. ביום התמיינות 9, המערכת שינתה את המדיום ל-DMEM/F12 ואת התווך הנוירובזאלי ביחס של 1:1 בתוספת חומצות אמינו לא חיוניות של 0.1 מילימול, תוסף גלוטמין של 1 מילימול, תוסף N-2 של 1%, תוסף B-27 של 1%, חומצה אסקורבית 2-פוספט של 50 מיקרוגרם/מ"ל וחומצה רטינואית של 1 מיקרומטר של כל הטרנס. ביום התמיינות 13-16, המערכת שינתה את המדיום כל יום עם DMEM/F12 ומדיום נוירובזאלי 1:1 בתוספת 0.1 mM חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM תוסף גלוטמין, 1% תוסף N-2, 1% תוסף B-27, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית 2-פוספט, ו 10 ng / mL bFGF ו 10 ng / mL EGF. ההגדרות המשמשות להתמיינות תאי קודמן עצביים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מסוכמות בטבלה 4.
קרטינוציטים
פרוטוקול הבידול מפרסום קודם בוצע כאן13. המערכת זרעה hiPSCs בלתי ממוינים (253G1) בצפיפות של 15,000 תאים לסמ"ק2 בלוחות 6 בארות מצופות תרבית תאים בתווך תרבית hiPSC עם 10 מיקרומטר Y-27632. לאחר יומיים לאחר מכן (יום התמיינות 1), המערכת שינתה את התווך למדיום הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM)/F12 ולמדיום נוירובזאלי (1:1) עם 0.1 מילימטר חומצות אמינו לא חיוניות, 1 מ"מ גלוטמין, 55 מיקרומטר 2-מרקפטואתנול, 1% תוסף N-2, תוספת B-27 2%, 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית 2-פוספט, אלבומין בסרום בקר 0.05% ו-100 ננוגרם/מ"ל FGF-בסיסי. ביום התמיינות 3, ולאחריו, המדיום שונה למדיום קרטינוציטים אנושי (ללא תוספת ליום 3 ועם תוספת ביום 5 / אחריו) בתוספת של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 1 מיקרומטר חומצה רטינואית all-trans, 25 ng/mL hBMP-4, 2.4 מיקרוגרם/מ"ל אדנין, 1.37 ng/mL triiodothyronine, 0.3 mM חומצה אסקורבית 2-פוספט, ו 2 מיקרומטר forskolin, כל 2 ימים על ידי המערכת. ההגדרות המשמשות להתמיינות קרטינוציטים של iPSCs מסוכמות בטבלה 5.
כאמור, התהליך כולו בוצע באמצעות ציוד תרבית אוטומטי בלבד, החל מזריעת תאי iPS ועד לסדרה הבאה של פרוטוקולי התמיינות. הביטוי של סמנים אופייניים בכל תא הוערך (איור 4). הוכח כי ניתן ליצור בידול באמצעות מערכת תרבות אוטומטית בלבד.
איור 1: סיכום מערכת התרביות האוטומטיות. (A) תמונה של המערכת המציגה גודל ושרטוט פריסה 1. (B) תמונה של שולחן העבודה וסקיצה של הפריסה 2. (C) כלי עבודה: צלחת, צינור ופיפטה. נתון זה שונה באישור Bando et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העברת מטלת וגדילת תאים. (A) הריבוע ממחיש כל תהליך. (B) הרחבת iPSC מחושבת באמצעות כל ספירת תאים אוטומטית בשלושת הניסויים הבלתי תלויים. (C) תמונות מייצגות שצולמו באופן אוטומטי ממעבר למעבר. מוטות קנה מידה = 400 מיקרומטר ו- 100 מיקרומטר (כניסה). נתון זה שונה באישור Bando et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תחזוקה אוטומטית לטווח ארוך של iPSC. (A) כל הניתוחים האימונוציטומטוטוריים של שלושת הניסויים הבלתי תלויים עבור Oct-3/4 ו-SSEA-4. כל היסטוגרמה כחולה מצביעה על כך שאין שליטה ראשונית בנוגדנים. כל היסטוגרמה אדומה מייצגת את האות הספציפי לאנטיגן שצוין. (B) תמונות מייצגות של תאים מוכתמים אימונוהיסטוכימית עבור Oct-3/4, SSEA-4 ו-Tra 1-81. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) קריוטיפ של RIKEN2F-iPSC לאחר המעבר החמישי. נתון זה שונה באישור Bando et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צביעה אימונוהיסטוכימית. תמונות אימונוהיסטוכימיות של הפטוציטים (פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר), קרדיומיוציטים (פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר), תאי אב עצביים (פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר) וקרטינוציטים (פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר). נתון זה שונה באישור Bando et al.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: הכנות מעבר והגדרות מערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: תכשירי התמיינות קרדיומיוציטים והגדרות מערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: תכשירי התמיינות הפטוציטים והגדרות המערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: הכנות להבחנה עצבית מוקדמת של תאים והגדרות מערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: תכשירי התמיינות קרטינוציטים והגדרות מערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלב קריטי בפרוטוקול הוא שאם משתמש מוצא תקלות כלשהן, לחץ על לחצן ביטול, עצירה או איפוס בכל עת והתחל מחדש מהצעד הראשון. התוכנה יכולה למנוע טעויות אנוש, כולל הזמנה כפולה, פתיחת דלתות בזמן שמשימות המערכת פעילות, וחוסר חידוש. נקודה קריטית נוספת להתמיינות מוצלחת ויעילה לתא הסומטי הרצוי היא בחירה נכונה של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מכיוון שלכל תא גזע פלוריפוטנטי יש הטיה בלתי נשלטת בתכונות ההתמיינות שלו14,15.
מערכת תרבית אוטומטית זו עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים יכולה לשמר ולהתמיין אותם לסוגי תאים סומטיים שונים. גודלה של מערכת זו הוא 200 ס"מ (רוחב), 110 ס"מ (עומק) ו 233 ס"מ (גובה), עם משקל כולל של 1.2 טון. האינקובטור המובנה במכשיר יכול להכיל בו זמנית שלושים ושש צלחות של 10 ס"מ ותשע צלחות מרובות באר.
שיפורים לעומת דגמים קודמים הם שראשית, כזרוע טיפול, מערכת המסילות של ציר X-Y-Z הוסבה לאחרונה מזרוע מפרקית בעלת 6 צירים, הפועלת על ידי שינוי כלי החוד של הזרוע לשלושה חלקים שונים עבור כלים, צינורות ופיפטות . הזרוע תלויה מתקרת המערכת ונעה לאורך ציר X-Y-Z. שנית, הוכנסה מערכת ספירת תאים עבור תרביות תחזוקה ללא מזין ופרוטוקולי אינדוקציה של התמיינות המבוצעים ברציפות מהמעבר. לאחר ערבוב תמיסת התרחיף החד-תאי עם תמיסת הטריפאן הכחולה, הוא הועבר להמוציטומטר חד פעמי לתצפית והדמיה מיקרוסקופית. התוכנה מנתחת באופן אוטומטי את התמונה המתקבלת כדי לספור את מספר התאים החיים ולחשב את נפח הדרוש כדי זרע את מספר התאים הנדרש. הדיוק של ספירת התאים שהושגה על ידי ניתוח תמונה זה היה עקבי עם זה שהתקבל באופן ידני.
מערכת המסילות X-Y-Z-axes יושמה כדי לטפל בכל משימה מהר יותר מהגרסה הקודמת (זרוע מפרקית מרובת צירים). באמצעות מערכת תרבית אוטומטית זו, חמישה מעברים רצופים בוצעו במשך 16 ימים, ו- iPSCs הורחבו פי 625 ± פי 93. למרות שהוכחת הסיבולת לזמן תחזוקת התאים ללא תאי הזנה הייתה קצרה יותר מההדגמה הקודמת שלנו עם תאי הזנה, התרחבות התאים הייתה יעילה יותר בהשוואה להדגמה הקודמת6. נראה כי קיצור זמן המשימה תרם למניעת התייבשות נזק לתאים במהלך המשימות.
יתר על כן, משימות התמיינות מתרבית תחזוקה להתמיינות לקרדיומיוציטים, הפטוציטים, תאים מקדימים עצביים וקרטינוציטים בוצעו ללא התערבות אנושית. לאחר סדרה של קורסים אלה, אושר על ידי fluorescence immunostaining כי התאים שהתקבלו במערכת התרבית האוטומטית בלבד התמינו לתאים הרצויים. לכן, על ידי שיתוף תוכנית משימה ושימוש במערכת זו, חוקרים שאינם מכירים את ניהול תאי iPS יכולים להשיג תאים סומטיים שמקורם ב- iPSC עבור המחקר שלהם. יתר על כן, הבדלים ביכולת השחזור בין חוקרים או מתקנים יכולים להתבטל ככל האפשר, וזה יכול להבטיח כי תאים באיכות הומוגנית מתקבלים בכל פעם.
על ידי אימוץ מערכת מסילות חדשה, ניתן היה להקטין את הציוד ולהפחית את משקלו ל -1.2 טון, ~ 200 ק"ג קל יותר מבעבר. יתר על כן, עלויות הגדרת חלקים ותוכניות יכולות להיות מופחתות בכ -10,000 דולר ארה"ב. עלויות התחזוקה והתכנות הוערכו בירידה של 13%. על מנת להניע חוקרים נוספים להיכנס בקלות למחקר הקשור לתאי iPS, חשוב גם לשמור על עלויות ציוד נמוכות6. אנו מקווים שמערכות התרבית האוטומטיות הנוכחיות ושל הדור הבא יהיו אחת התרומות שיסייעו לספק iPSCs ותאים ממוינים שמקורם ב-iPSC באיכות אחידה יותר.
מגבלותיה העיקריות של מערכת זו הן יכולתו המוגבלת של המקרר לאחסון טנטטיבי של תרביות וחולשתו בטיפול בכמויות קטנות (<100 מיקרוליטר) של נוזלים. יתר על כן, היעדר בינה מלאכותית מתוחכמת משבית אופטימיזציה אוטומטית בהתאם למצב התא בזמן. המגבלה הקטנה היא הדרישה של קצוות פיפטה מיוחדים הניתנים על ידי יצרני המערכת 4,5. אנו מפתחים את הדור הבא של מערכות תרבית שיוכלו להתמודד עם כמויות קטנות של נוזלים עבור תכשירים בינוניים ויכללו מערכת אופטימיזציה של משוב המבוססת על בינה מלאכותית (System Learning) עתירת ביצועים. ליצרן השיתופי שלנו9 יש מספיק ידע לבנות מערכות בהתאמה אישית בהתאם לצרכים המיוחדים של המשתמשים. בנוסף לכך, מערכות הדור הבא המצוידות בפונקציות כלליות ורחבות יותר יהיו בשוק בקרוב. אנו שוקלים גם מערכת השכרה מבוססת מנוי שתספק מערכות עדכניות לכל המשתמשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמרכז לקידום עסקים חדשים, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., אוסקה, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
